Temario de 2º de Bachillerato. Ensayos de secuenciación, PCR, microarrays, ADN recombinante

1. El ADN y la Ingeniería genética Tema 16

5. Técnicas utilizadas en Ingeniería genética

6. Aplicaciones de la ingeniería genética

7. Nuevas disciplinas surgidas de la ingeniería genética

8. Tecnología del ADN recombinante Fragmentar y aislar el ADN Unión a vectores. Introducción en las células. Clonación Búsqueda del clon idóneo. Análisis del ADN clonado: transferencia Southern, Secuenciación. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

10. Escalonado (extremos cohesivos o pegajosos)Posteriormente, los fragmentos de distintos ADN cortados con la misma enzima se podrán unir mediante otro enzima, una ADN ligasa

11. ADN recombinante

13. Se separan las cadenas de ADN (desnaturalización).

14. Se devuelven las condiciones adecuadas y se produce la renaturalización.

15. Se pueden obtener moléculas híbridas de los dos tipos de ADN

16. El porcentaje de hibridación está relacionado con el parentesco evolutivo

18. AAAAAA 3’ 5’ TTTTTT 5’ AAAAAA 3’ 5’ TTTTTT 5’ 3’ Transcriptasa inversa ADNc Degradación del ARN TTTTTT 5’ 3’ Síntesis de la otra cadena de ADN ADN polimerasa I Nucleasa S1 elimina el bucle ADN de doble cadena

20. Clonación de ADN En ingeniería genética se entiende por clonación la obtención de múltiples copias de un gen específico o de un fragmento de ADN en el interior de un organismo hospedador. Estos organismos deben cumplir las siguientes características: Crecimiento rápido No debe ser patógeno Debe favorecer la entrada del transgén Debe ser muy bien conocido Debe ser fácilmente manipulable Escherichiacoli

22. Debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta.

23. Tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.

25. Virus bacteriófagos

26. Cósmidos

27. YAC’s (cromosomas artificiales de levadura)

28. Cromosomas artificiales de bacterias (BAC’s)

30. Se localizan en las bacterias.

31. Tienen replicación independiente.

32. Genes propios (resistencias a antibióticos) que permiten seleccionarlos posteriormente

33. Facilidad para la manipulación.

36. Incorporan material genético mediante el proceso de transducción.

38. Son fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y la porción COS (fragmento de fagos necesario para empaquetar el material genético)

39. Lleva varios genes de plásmidos

40. Incorpora marcadores (resistencia a antibióticos)

41. Tiene varios sitios de restricción

43. Cromosoma artificial de levadura Son vectores de clonación de alta capacidad. Esto permite clonar en levaduras (microorganismos eucariotas) secuencias de ADN de hasta un millón de pares de bases o más, al comportarse como un cromosoma propio de la levadura.

45. Clonación de los fragmentos de ADN Inserción de genes marcadores en el vector (plásmido o lo que sea). Generalmente de resistencia a antibióticos Se cortan el ADN humano y el vector con el mismo plásmido. Se mezclan los fragmentos. Obtención de plásmidos recombinantes. Se juntan los plásmidos con bacterias. Incorporación de los plásmidos por transformación bacteriana. Cultivo de bacterias en presencia de un antibiótico. Las bacterias que no han incorporado el plásmido mueren (no son resistentes).

48. La colección de clones debería contener, teóricamente, todas las secuencias existentes en la fuente original de ADN, es decir, debería contener muestras de todo el ADN del organismo.

49. Para encontrar el gen de interés hay que utilizar sondas de ácidos nucleicos.

51. Se pueden sintetizar a partir de la secuencia de bases del gen o de la secuencia de aminoácidos de la proteína

53. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN y además en muy poco tiempo. La reacción es un proceso cíclico: La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice y se separe las dos hebras. Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Se utiliza la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermusaquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas). Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias.

56. ADN obtenidos de la escena de un crimen (medicina forense).

57. ADN de células embrionarias (diagnostico prenatal de trastornos genéticos)

58. ADN de genes virales (en células infectadas por virus difíciles de detectar, como el VIH)Animación de la PCR: http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf

59. OH Secuenciación del ADN * Método del didesoxi de Sanger – método de la interrupción controlada de la replicación enzimática (de la polimerización de DNA). *Elementos necesarios: - DNA polimerasa - Oligonucleótido (primer o cebador), de 18-30 nucleótidos y complementario al extremo 3’ del fragmento de DNA que queremos secuenciar - Mezcla de los 4 desoxinucleósidostrifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) - Una pequeña cantidad de cada uno de los 4 didesoxinucleósidostrifosfato (ddATP* o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP*) marcados (*florescencia específica para cada uno de ellos) Didesoxi nucleótido (bloqueo de la síntesis de DNA) Desoxi nucleótido

60. Pasos de la secuenciación Primero es necesario obtener una gran cantidad de fragmentos de ADN (clonación) Desnaturalización del ADN (obtención de cadenas simples) Mezcla de todos los componentes de la reacción Comienza la síntesis de ADN, que termina cuando la ADN polimerasa incorpora un ddNTP marcado Se obtienen fragmentos de distinta longitud, todos ellos acabados en un ddNTP* Se separan las moléculas marcadas mediante un gel de poliacrilamida. Un detector identifica cada uno de los ddNTP* finales gracias al color. El espectrograma resultante nos indica la secuencia de bases.

61. Materiales necesarios para la secuenciación Obtención de cadenas de distinto tamaño acabadas en un ddNTP* Separación de fragmentos por tamaños e identificación por color

62. El estudio de la genómica es el conocimiento del genoma completo y de las interacciones entre los genes que lo forman. objetivo Genómica Identificación de genes codificadores de proteínas Genes que interactúan entre sí Comparación de genomas de distintas especies

63. Genómica Conocimiento del genoma completo Identificación de genes Rastreo de secuencias de inicio de transcripción Comparación con genes conocidos

64. Genómica Interacciones entre los genes del genoma Genes que interactúan entre sí La expresión de un gen afecta a otros y varía en función de las condiciones La expresión del genoma se evalúa con chips de ADN

65. Ensayo de micromatrices de ADN Sirve para saber si un tejido normal presenta genes alterados que podrían provocar una enfermedad

66. http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/ Animación secuenciación genoma humano http://www.pbs.org/wgbh/nova/genome/sequencer.html#

67. Proteoma Conjunto de proteínas de una célula, tejido o genoma completo PROTEÓMICA Proteómica Estudios sistemáticos de las proteínas codificadas por el genoma de un organismo. El conjunto de proteínas supera con mucho al de los genes. Su importancia radica en que son ellas las que desempeñan las actividades celulares

68. Ingeniería genética y medicina

69. Secuencia de la proteína (insulina) Síntesis de los ADN Obtención de plásmidos recombinantes con los genes para formar las dos cadenas de la insulina. Expresión en E. coli Purificación y procesado químico Obtención de insulina activa

70. Los seres humanos difieren en un 0.1% del genoma. Estas diferencias están localizadas en regiones cromosómicas concretas. Estas zonas se usan como marcadores genéticos Con la identificación de los marcadores se hace la huella genética (método de Southernblot) La comparación de huellas genéticas permite resolver casos policiales.

71. MÉTODO DE SOUTHERN BLOT

72. Ingeniería genética y medicina

73. Ingeniería genética y agricultura Obtención de plantas transgénicas Resistencia a herbicidas Mejora del producto Plantas farmacéuticas Se introduce un gen de E. coli que permite usar mayores concentraciones de herbicidas sin dañar a la planta de interés, y eliminando malas hierbas. Las plantas producen sustancias medicinales, vacunas o anticuerpos (planticuerpos). Se mejora el valor nutricional del producto, por ejemplo añadiendo beta-caroteno al arroz

75. Ingeniería genética y medio ambiente Biorremediación Bioadsorción Biolixiviación Uso de bacterias modificadas para degradar materia orgánica (petróleo) Obtención de metales a partir de minerales de baja ley Fijación de metales pesados a la superficie de la célula para limpieza de suelos

76. Ingeniería genética y ganadería MEJORA DE RAZAS PRODUCCIÓN DE MEDICAMENTOS ESTUDIO DE ENFERMEDADES HUMANAS Obtener razas mas resistentes, mas productivas, con mayor desarrollo, resistentes a condiciones más difíciles Se usan animales transgénicos. Se pueden obtener sustancias de interés como proteínas humanas para combatir enfermedades: Enfisema hereditario Factores de coagulación Se estudia la expresión de genes humanos en organismos transgénicos