Genetika razvoja, uzroci kongenitalnih malformacija, gastrulacija, embrij.

1. Genetika razvoja

2. Svake 3,5 min u svijetu se rodi beba sa kongenitalnom malformacijom
Svake godine oko 150.000 beba sa ozbiljnim poremećajima
Učestalost 1 beba na 20 rođenih – u vašoj polulaciji bit će barem 1
beba sa malformacijama
Nekoliko tisuća različitih kongenitalnih malformacija – nekima znamo
uzrok, nekima ne
Kongenitalna malformacija je abnormalnost strukture tijela, funkcije ili
metabolizma koja je dovoljno ozbiljna da zahtjeva brigu liječnika

3. Uzroci kongenitalnih malformacija

4. Možete li reći koja od ovih žena je trudna?
Većina žena sazna za trudnoću tek mjesec dana nakon začeća
Upravo u tom periodu događaju se kritične promjene u razvoju bebe
“Niti rođenje, niti udaja / ženidba, niti smrt nisu najvažniji trenuci u
životu. Najvažniji trenutak života je gastrulacija”.
Lewis Wolpert (1996)

5. Gastrulacija – kritično razdoblje u razvitku – djelovanje teratogenih faktora – poznati
teratogeni – alkohol, zračenje, lijekovi, virusi itd
Sve ili ništa Više ili manje

6. Sve stanice odraslog organizma – potekle od jedne – ista DNA
Za vrijeme razvoja stanice se usmjeravaju pod utjecajem faktora rasta, hormona i ostalih
signalnih molekula koje modificiraju kromatin i ekspresiju pojedinih gena.
Sposobnost genoma da odgovori na razvojne signale ključan za diferencijaciju stanica

7. Pluripotentne stanice – da bi dale diferencirane stanice tkiva – pakiranje genoma u područja
koja su dostupna transkripcijskim faktorima ili nisu
Heterokromatin i eukromatin
Različit način pakiranja kromatina

8. Što je različito u kromatinu koji je aktivan (otvoren), od onog koji nije (zatvoren)?
‘Epi’genetika - ‘na’ ili ‘preko’ genetske informacije kodirane u DNA
U različitim stanicama na istu DNA dolazi drugačija informacija o modeliranju kromatina

9. 1. Metilacija DNA
Epigenetske modifikacije
Najčešće zahvaća citozin Ciljno mjesto metilacije:
CpG sekvence
Dodavanje metilne
skupine na peti C atom
citozina
Biološka uloga 5mC:
ekspresija gena
prijenos obrasca ekspresije gena na stanice kćeri
Nova baza
5- metilcitozin (5mC)

10. Metilacija DNA i ekspresija gena
Nemetilirane CpG sekvence = aktivni geni
Metilacija sprječava vezivanje transkripcijskih faktora – nema ekspresije
promotor kontrolna regija

11. aktivni kromatin – acetilirani histoni srži nukleosoma
Acetilacija odstranjuje pozitivan naboj i smanjuje afinitet između histona i DNA
Metilacija DNA i ekspresija gena
Metilirani CpG privlače histonske deacetilaze
Povećana mobilnost
nukleosoma duž DNA
Pristup transkripcijskoj mašineriji
Metilirani CpG privlače histonske deacetilaze

12. Metilacija CpG sekvenci + modifikacija histona = inaktivan kromatin

13. Utišavanje gena – mehanizam
metilirani CpG privlače MeCP2 koji aktivira histonske deacetilaze (HDAC) – deacetilacija histona.
MeCP2 aktivira i histonske metiltransferaze ( SUVh39) koje metiliraju H3-histone na K9 što privlači
heterokromatinski protein HP1 koji stabilizira inaktivno stanje heterokromatina.

14. DNA metiltransferaza
Nemetilirani citozin
Replikacija
DNA
Prijenos metilacijskog obrasca ekspresije gena na stanice kćeri
DNA metiltransferaza
(Dnmt)
metilira CpG sekvence
Metilacija Metilacija
Ne prepoznaje ga Dnmt
Hemimetilirana DNA
Obrazac metilacije DNA je nasljedan – svi potomci ove stanice imat će isti metilacijski obrazac

15. Jedan te isti genom može dati više epigenoma
Svaka stanica prenosi svoj epigenom na stanice kćeri

17. Jednojajčani blizanci naslijede isti set gena, u odrasloj dobi različiti
epigenetske modifikacije – pod utjecajem vanjskih faktora: prehrana, fizička aktivnost, pušenje,
način života
Stariji jednojajčani blizanci – značajne razlike u ukupnoj količini i distribuciji 5mC
Različite predispozicije bolestima (pokazano na 30 parova blizanaca)
Fraga et al. (2005) PNAS July 26, vol. 102 no. 30, 10604–10609
Jednojajčani blizanci – identičan genotip, epigenetski se ne razlikuju u ranom djetinjstvu

18. Iste epigenetske promjene nastale zbog utjecaja vanjskih faktora djeluju
istovremeno na tri generacije
Tri generacije odjednom izložene istim uvjetima okoliša (prehrana, otrovi, hormoni)

19. Rani razvoj: nakon oplodnje epigenetsko reprogamiranje genoma svake
buduće vrste stanica
Nakon oplodnje do blastociste –
globalna demetilacija
Sposobnost epigenetskih faktora da odgovore na razvojne signale je istovremeno i temelj
njihove osjetljivosti na vanjske faktore
Npr. epigenom se može promijeniti zbog različite prehrane (folna kis, B12), etanola
Nakon blastociste – gastrualcija –
globalna de novo metilacija

20. Mnoge hranjive tvari– donori metilnih skupina – mogu promijeniti epigenom zametka koji
se razvija: prehrana majke sa prevelikom ili premalom količinom donora metila može
promijeniti ekspresiju gena
Važno u ranom razvoju kad se uspostavlja epigenom
buduće jedinke

21. Što je folat?
• Vodotopivi vitamin B-kompleksa:
• Folat
– dolazi prirodno u hrani (apsorbira se 50%)
• Folna kiselina
– u obliku vitaminskog suplementa (apsorbira se 100%)
S-adenosyl-methionine
5-methyl-tetrahydro-folate
S-adenosyl-methionine
Zašto je folat važan?
Sudjeluje u biokemijskom putu SAM –
donoru metilnih skupina – metilaciji DNA

22. Miševi i ljudi imaju gen agouti
ljudi: pretilost, proizvodnja inzulina
miš:
agouti gen nemetiliran – miš sa žutim krznom, pretio, sklon razvoju dijabetesa i raka
agouti gen metiliran (kao što je u normalnom mišu) krzno smeđe,mršav, vrlo nizak rizik od
razvitka bolesti
Primjer:
Pretio žuti miš i mršavi smeđi miš genetički identični

23. Što može napraviti nedostatak folata u prehrani?
Dva miša istog genotipa iste starosti – majka smeđeg miša
dobivala folat u trudnoći, majka žutog ne

24. Žutu trudnu mišicu hranimo s dodatkom folata – potomstvo smeđe, zdravo

25. Neuralni žlijeb
Mezoderm uz neuralnu cijev zadeblja i dijeli se u somite – prekursori mišića i kostura
Neuralna cijev zatvorena Čovjek:
Neuralna cijev
se zatvori do 28.
dana trudnoće

26. Zatvaranje neuralne cijevi kritično – ako se
ne zatvori do kraja – spina bifida
Folat – donor metila može sprječiti do 70% slučajeva spine bifide (uč. 1/1000) – uzimanje
folata mjesec dana prije začeća i u prvom trimestru trudnoće

27. • Daily multivitamin use
− 400µg folic acid
alkohol inhibira apsorpciju folata
Metabolizam folata poremećen djelovanjem:
pušenje – smanjuje iskorištavanje folata

28. Ne zaboravimo da postoji i otac!
Pred 40 god. Gladys Friedler: ženke štakora prije trudnoće izložila djelovanju morfija.
Potomci mali, nisu nikad izlagani morfiju - njihovi potomci isto mali
Izložila djelovanju morfija mužjake prije parenja – također utjecaj na potomke
Rezultati odbačeni – kako otac može prenijeti na potomke nešto što nije mutacija?
Otkrivena epigenetika – objašnjeno
Anne Ferguson-Smith: chromosomes remember whether they came from the mother orAnne Ferguson-Smith: chromosomes remember whether they came from the mother or
from the father
2006. Muški miševi izloženi kokainu (inhalacija) kroz dulje vrijeme, pareni sa zdravim
ženkama: potomci nisu mogli zapamtiti gdje je hrana u kavezu (naročito ženski potomci)
Nikakva oštećenja DNA nisu pronađena u spermijima mužjaka

29. Pamćenje – neuroni –eksprimiraju specifične proteine potrebne za normalnu funkciju
stanice koje nisu neuroni eksprimiraju NRSE (neuron-restrictive silencer element) koji
zajedno sa histonskim deacetilazama suprimira gene karakteristične za neuron
Vanjski signali – okoliš može promijeniti epigenetske markere i neuron ne funkcionira kao neuron

30. Droge (npr. kokain) uzrokuje dugotrajnu adaptaciju stanica mozga temeljenu
na promjeni u ekspresiji gena
BDNF (Brain-derived neurotrophic
factor) – faktor rasta aktivan u
hipokampusu, korteksu – dijelovihipokampusu, korteksu – dijelovi
mozga ključni za učenje, pamćenje,
naročito dugotrajno pamćenje
CREB (cAMP response element-binding)
transkripcijski faktor koji se veže na sekvence DNA
nazvane CRE (cAMP response elements) regulirajući
ekspresiju nizvodnih gena. Geni regulirani CREBom
su BDNF i mnogi neuropeptidi

31. Ne podcjenjujmo epigenetski obrazac majke koji se prenosi na djecu i
određuje njihovo ponašanje!
Majke miševa koje su brižne i paze na svoje potomke predale su svoj
metilacijski obrazac CNS-u svojih potomaka. Taj se obrazac zadržava do
odrasle dobi i prenosi na slijedeću generaciju.
Kad smo kod CNS-a:
Zadržavanje metilacijskog obrasca u odrasloj dobi potvrđuje hipotezu da
se obrazac prenosi na stanice potomke
Objašnjava nasljeđivanje “instinkta” - načina ponašanja

32. Razdoblje prije gastrulacije – pravilo sve ili ništa
Sve ili ništa Više ili manje

33. Epigenetske modifikacije gena u dva kritična perioda:
razvoju gameta
preimplantacijskom rastu
Za vrijeme gametogeneze uspostavljaju se specifični metilacijski obrasci u gametama oba spola

34. Potpomognuta oplodnja – uključuje manipulaciju gametama i preimplantacijskim
embrijima
Intrauterini zaostatak u rastu
Prerani porod
Smanjena porođajna težina
Angelman i Beckwith-Wiedemann sindrom ( 6x veća incidencija nego prirodnim putem)
Children Born After Assisted Reproduction at Greater Risk of Congenital Malformations, ScienceDaily (July,2010)
ICS 26/301 (8.6%)
IVF 75/837 (9.0%) ozbiljnih kongenitalnih malformacija
Djeca začeta prirodnim putem 168/4000 (4.2%)

35. Stimulacija ovarija?
Manipulacija i selekcija gameta?
Kultivacija embrija?
Zašto povećan rizik od kongenitalnih malformacija nakon potpomognute oplodnje?

36. Za vrijeme gametogeneze uspostavljaju se specifični
metilacijski obrasci u gametama oba spola
Stimulacija ovulacije, ICSI – intervencija prije završene uspostave metilacijskog
obrasca u gametama

37. Priprema oocite i spermija za ICSI:
Odstranjivanje stanica cumulusa uz pomoć hijaluronidaze. Kontrola pod invertnim mikroskopom –
postojanje prve polocite – znači oocita u metafazi II.
Svaka oocita se stavlja u kapljicu medija koja okružuje kapljicu medija sa spermijima. Kapljice se
prekriju laganim parafinskim uljem i stavljaju na grijani stolić mikroskopa sa mikromanipulatorom.
Za vrijeme injektiranja spermija oocita se pridržava mikropipetom, a drugom mikropipetom se
injektira spermij.

38. Intrauterini zaostatak u rastu
Prerani porod
Smanjena porođajna težina
Angelman i Beckwith-Wiedemann sindrom
Zašto baš ovakvi poremećaji?
Svi spadaju u poremećaje imprintinga
Što je genomski imprinting?

39. Čovjek: 100-200 utisnutih genaČovjek: 100-200 utisnutih gena
Anne Ferguson-Smith: chromosomes remember whether they came from
the mother or from the father

40. Intrauterini zaostatak u rastu, smanjena porođajna težina: poremećaj imprintinga

41. Kako i zašto je nastao genomski imprinting?
Teorija genetskog konflikta:
Imprinting je nastao kao rezultat različitog interesa majke i oca za rast
fetusa in utero
Geni eksprimirani od oca imaju funkciju poticati fetalni rast i omogućiti
što bolji prolaz hranjivih tvari od majke do fetusašto bolji prolaz hranjivih tvari od majke do fetusa
Geni eksprimirani od majke imaju funkciju suprimirati fetalni rast
(majka se bori protiv parazita koji raste u njezinom tijelu!)
Jedino prava kombinacija gena ekspirmiranih od oca i majke može
uravnotežiti prehranu i potrebe za rast fetusa

42. Primjeri koji idu u prilog teoriji genetskog konflikta:
IGF2: insulin growth factor II, eksprimiran od oca
potiče fetalni rast
potiče rast placente, omogućuje transport hranjivih tvari
IGF2R: insulin growth factor II receptor, eksprimiran od majke
IGF2 i njegov receptor IGF2R– odgovorni za fetalni rast
IGF2R: insulin growth factor II receptor, eksprimiran od majke
smanjuje količinu slobodnog IGF2
Knockout miševi za IGF2R – povećana
placenta, prekomjerni fetalni rast
Knockout miševi za IGF2 – manja
placenta, manji potomci

43. Jedino prava kombinacija ekspresije majčinih i očevih gena
može rezultirati normalnim razvojem

44. U svakoj generaciji imprint suprotnog spola
se mora izbrisati i u gametama ustanoviti
vlastiti koji odgovara spolu osobe
Nasljeđujemo različiti imprint od oca i majke
Ciklus imprintinga

45. Disbalans aktivnosti utisnutih gena dovodi do poremećaja
imprintinga i bolesti

46. Bekwith-Wiedemann sindrom
- makroglosia, umbilikalna hernia, velika porođajna težina,
hepatomegalija, nefromegalija, visoki % Wilmsovih i drugih
embrionalnih tumora – rabdomiosarkom, hepatoblastom
pogođena tkiva – visoka ekspresija Igf2
Nasljeđivanje:
- 15% obiteljsko, autosomno dominanto (11.krom. utisnuta regija)
- 85% sporadičnih slučajeva: - 20 % genetski (pUPD, mutacije)
- 60 % epigenetski (poremećaj metilacije)
- 20 % nepoznati

47. Potpomognuta oplodnjaPotpomognuta oplodnja ii BWSBWS
ART/
cohort
country referenceRR
6/149 UK Maher et al., 2003x 4
USA DeBaun et al., 20034
3/65*
x 6
#LOM/
#tested
2/2
5/6
#ICSI/
#IVF
3/3
5/2
study
retro.
retro.
prosp.
RR = relative risk
LOM = loss of maternal methylation * overlapping patients
Halliday et al., 2004
6/149 UK Maher et al., 2003x 4
France Gicquel et al., 20036/149 x 3
4/37 Australiax 9
19/341* USA
2/2
6/6
3/3
- Chang et al., 2005
3/3
2/4
1/3
5/5 -
retro.
retro.
retro.
case
retro.
8/213 retro. UK Sutcliffe et al., 20068/8

48. K.H. Ørstavik et al. : Another Case of Imprinting Defect in a Girl with Angelman Syndrome
Who Was Conceived by Intracytoplasmic Sperm Injection The American Journal of Human
Genetics, Volume 72, Issue 1, 218-219, 2003
Kromosom 15

49. Angelman regija aktivna u majke, u oca inaktivirana imprintingom
Takav balans daje zdravo dijete
Angelman sindrom će nastati ako iz bilo kojeg razloga majčina regija nije
aktivna
IVF – ICSI: djevojčice zadržale očev imprint, izgubile majčin
Manipulacija gametama? In vitro kultura?

51. Rješenje problema:
PREIMPLATACIJSKA
DIJAGNOSTIKA
Joe Leigh Simpson: Children born after preimplantation genetic diagnosis show no
increase in congenital anomalies, Human Reproduction, Vol.25, No.1 pp. 6–8, 2010