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1. Un’arma di difesa batterica: Crispr-Cas9
Ilaria Bellini
Microbiologia a 360°

2. …..UNA SCOPERTA CASUALE
• Nel 1987, un team di
ricercatori lavorando sul gene
Iap di E.coli, notò, nelle
immediate vicinanze di esso,
una sequenza genetica
inusuale caratterizzata da
sequenze di DNA ripetute e
non ripetute, la quale
funzionalità biologica a quel
tempo rimase un mistero.
• 20 anni dopo, studi su S.
thermophilus, diedero un
nome a queste sequenze,
portando alla luce quella che
oggi rimane una delle tecniche
di ingegneria genetica più
innovative: Il sistema Crispr-
Cas.

3. LA STRUTTURA

4. UNA MEMORIA IMMUNOLOGICA
BATTERICA?
In S. thermophilus, gli spacers presentavano delle sequenze omologhe a DNA
batteriofago e plasmidico. Effettuando una challenge tra il batterio e due
batteriofaghi si ottennero 9 linee di S.termophilus batteriofago-resistenti.
A livello genomico si identificò l’aggiunta di nuovi spacers.

5. MEGLIO, UN’ARMA DI DIFESA.

6. FOCUS SUL
MECCANISMO

7. IMPARARE DAL NEMICO:
CRISPR-Cas come tool di editing genetico
2012

8. TAGLIA E CUCI: DSB ED I SISTEMI HDR E NHEJ

9. APPLICAZIONI
MALATTIE
GENETICHE
MALATTIE
VIRALI
INFEZIONI
BATTERICHE
ONCOLO
GIA
RESISTENZA A
PATOGENI
MIGLIORIE DEL
FRUTTO
BIOCARBURA
NTI
RESISTENZA A
STRESS
UOMO
PIANTE
INDUSTRI
A

10. CRISPR-CAS9 E PIANTE

12. BIOFABBRICHE
Utilizzo di piante ingegnerizzate tramite crispr-
cas9 per produrre anticorpi monoclonali
 Produzione maggiore.
 Tempi ridotti.
 Costi ridotti.
 Facile attuazione.

13. 1- CRISPR-Cas9 E MALATTIE GENETICHE

14. 2- CRISPR-CAS9 E MALATTIE VIRALI

15. ATTUALITà: CRISPR-CAS9 E COVID19
POSSIBILE CANDIDATO PER TEST DIAGNOSTICO
RAPIDO
RNA virale viene copiato sotto forma di DNA e
amplificato secondo un protocollo semplificato
rispetto alla classica reazione a catena della
polimerasi (PCR). L’acido nucleico risultante
viene incubato con l’enzima Cas12 e una
molecola guida, in grado di riconoscere le
sequenze chiave del virus. Le forbici
enzimatiche, indirizzate dalla guida, tagliano
queste sequenze, quindi la presenza dei
frammenti viene evidenziata da etichette
fluorescenti.
Meno costoso e più rapido.

16. 3- CRISPR-Cas9 ED INFEZIONI BATTERICHE
• Utilizzare questa tecnica per
disabilitare l’azione dei geni
deputati allo sviluppo di
resistenza gli antibiotici
• Avere un’azione battericida
andando a clivare domini
importanti nel genoma
batterico.
IL PROBLEMA
DELL’ANTIBIOTICO
RESISTENZA

17. 4- CRISPR-Cas9 E CANCRO
 Utile per lo studio di geni implicati
nella patogenesi di diversi modelli
tumorali, effettuando il knock-in o
il silenziamento di oncogeni e
oncosoppressori.
 Utilizzata per creare linee cellulari
come modello di diverse tipologie
tumorali.
USO TERAPEUTICO:
 Knock-out di due geni NANOG e
NANOGP8, coinvolti nel tumore
prostatico, ha determinato la
riduzione del potenziale
tumerogenico in modello murino.
 Knock-out di MDR1 in cellule di
osteosarcoma ha determinato la
riduzione della resistenza ad
agenti chemioterapici.

18. I
VANTAGGI

19. IL CASO DI HE JANKUI
Nascita di due gemelline
geneticamente modificate
a livello del gene Ccr5,
coinvolto nell’entrata del
virus HIV nella cellula e
che quindi senza il quale
l’infezione non dovrebbe
avvenire.
Condannato a 3 anni di carcere ed a
pagare una multa di 3 milioni di yuan
(circa 385mila euro)

20. LIMITAZIONI
1. OFF-TARGET:
Un legame ed un taglio
sbagliato possono
determinare mismatches
risultanti in una
mutagenesi collaterale
indotta successivamente dai
sistemi di riparazione.
Esempio di conseguenze:
attivazione oncogeni o
silenziamento di
oncosoppressori.
2. NHEJ
Questo sistema di
riparazione risulta essere,
per sue caratteristiche
intrinseche, quello meno
efficiente e preciso. Per
questo motivo, per
garantire un’efficienza in
CRISPR, l’HDR deve
predominare. Come?
Ricercatori stanno
provando ad inibire
questo pathway, o creare
template di riparo che
favoriscano un sistema
all’altro.
3. DELIVERY
Il sistema di trasporto (vettori virali, plasmidici..) deve
essere sicuro ed efficiente ed assicurarci che il sistema
raggiunga solo un determinato tessuto e determinate
cellule.

21. EVO CAS9
UNA SCOPERTA ITALIANA!!
I ricercatori dell’università di Trento hanno
sottoposto Cas9 a una "evoluzione
darwiniana" in provetta, e da qui deriva il
nome, evoCas9. Hanno inserito la
proteina in cellule specializzate di lieviti ed
hanno lasciato fare alla natura,
selezionando poi i lieviti in cui Cas9
effettuava il taglio nella maniera più
precisa
RISULTATO?
Una cas9 diversa in solo quattro aminoacidi, ma
estremamente più precisa rispetto alle versioni
esistenti. Testato in cellule umane, il nuovo
strumento, oggetto già di un brevetto, ha
dimostrato di ridurre di circa il 99 per cento le
mutazioni non volute.

22. «IL MODOMIGLIORE DI SCONFIGGERE IL NEMICO è
DI FARSELO AMICO»

23. Bibliografia
1. “CRISPR-Cas: Converting A Bacterial Defence Mechanism into A State-of-the-
Art Genetic Manipulation Tool” Alexandre Loureiro et al. 2019.
2. «CRISPR–Cas9 Structures and Mechanisms» Fuguo Jiang et al. 2017.
3. “Applications of the CRISPR/Cas9 System for Rice Grain Quality Improvement:
Perspectives and Opportunities” Sajid Fiaz et al. 2019.
4. “Plants as sources of natural and recombinant anti-cancer agents.” Buyel JF et
al 2018.
5. “Sequenzial laser art and crispr treatments eliminate hiv-1 in a subset of
infected humanized mice” Prasanta K Dash et al. 2019.
6. “CRISPR/Cas9 gene editing technology and its application to the coronavirus
disease (COVID-19), a review” 2020.
7. “Gene correction for SCID-X1 in long term hematopoietic stem cells” Mara
Pavel-Dinu et al. 2019.
8. “Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne
muscular dystrophy” L Amoasii et al. 2018.
9. “A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.” A.
Casini et al. 2018.
10.“ The Enhancement of plant disease resistance using Crispr-Cas9 technology”
Virginia M. G. Borrelli et al. 2018.

24. Contatti:
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Grazie per l'attenzione!