1. INSTRUMENTACIJA I SENZORI
ZA KLINIČKE LABORATORIJE
Kliničke laboratorije
Utvrđuju ućešće i koncentraciju
pojedinih materija u:
Tkivima
Krvi
Gasovima
Instrumentacija najčešće zasnovana
na elektrohemijskim pretvaračima
1

2. Pomoć u dijagnostici
Utvrđene su i statistički
standardizovane fiziološke granice
koncentracija pojedinih materija
U mnogim slučajevima utvrđeni su i
uzroci koji dovode do odstupanja
koncentracija od standardnih
fizioloških vrednosti
Parcijalni pritisak gasa
Velik broj laboratorijskih analiza svodi se na
određivanje parcijalnih pritisaka gasova u
rastvorima (pO2, pCO2, pH, pN)
Daltonov zakon, ukupan pritisak gasa p u
zapremini V pri apsolutnoj temperaturi T je:
n
p= RT
V
R – univerzalna gasna konstanta
n – broj molova gasa
2

3. Parcijalni pritisak gasa
Parcijalni pritisak jednog gasa u smesi
gasova je:
nG
pG = RT
V
Ukupan pritisak smese gasova jednak je
zbiru parcijalnih gasova
Rastvorljivost gasova
Količina gasa rastvorenog u tečnosti
jednaka je proizvodu parcijalnog pritiska tog
gasa i njegova rastvorljivosti u posmatranoj
tečnosti (Henrijev zakon)
Rastvorljivost je koeficijant koji se definiše
za određenu kombinaciju gas-tečnost i
predstavlja količinu gasa sa parcijalnim
pritiskom od 760mmHg rastvorenog u
tečnosti.
Rastvorljivost opada sa porastom
temperature
3

4. Primer metaboličkog procesa
Metabolizam svih ćelija u organizmu
zahteva kiseonik O2 i energetske substrate
U metaboličkom procesu oksidacijom
glukoze oslobađa se energija, a kao
nusprodukti generišu se ugljendioksid (CO2)
i niz drugih bioprodukata
Pluća su organ u kome dolazi do kontakta
atmosfere sa krvlju, preciznije do
oslobađanja CO2 i rastvaranja (vezivanja)
O2 u krvi
Parcijalni pritisci u krvi
pO2 u alveolama tipično 104
mmHg
pO2 u kapilarima venskog
sistema koji ulazi u alveole je 40
mmHg
Razlika pritisaka od 64 mmHg
daje energiju za difuziju
kiseonika iz atmosfere u kapilare
Hemoglobin lako vezuje O2 pa je
pO2 u kapilarima koje izlaza iz
pluća oko 104 mmHg
Ovako kiseonikom obogaćena
krv se delimično meša sa
venskom krvlju pa je pO2 na
izlasku iz leve ventrikule 95
mmHg
4

5. Parcijalni pritisci u krvi
U intersticijalnom fluidu
je pO2 oko 40 mmHg
U periferijskom
sistemu kapilara
kiseonik difunduje u
intersticijalni fluid, time
smanjuje zasićenost
krvi kiseonikom u
venama na vrednost
pO2 oko 40 mmHg
Kiseonik u krvi
Od ukupnog kiseonika približno 97% krvi je vezano za
hemoglobin, a 3% je rastvorene u krvnoj plazmi
Te je pO2 raspoređen na 92.8 mmHg (oksihemoglobin –
HbO2), i 2.8 mmHg (plazma)
U slučaju mirovanja (bazalni metabolizam) venska krv sadrži
oko 75 % HbO2, a u slučaju jakog napora (vežbanje) HbO2
može da padne na vrednosti ispod 20%, i tada je intersticijalni
parcijalni pritisak pO2 reda 15 mmHg
Svaki poremećaj u alveolama koji remeti difuziju iz atmosfere
u kapilare, ili u sistemskom krvotoku koji remeti difuziju
kiseonika iz krvi u intersticijalni prostor uzrokuje hipoksiju
(nedostatka kiseonika) ili acidoze (prisustvo kiselih, toksičnih
materija u krvi)
Obe promene vode velikim smetnjama u funkcionisanju
organizma, i moguć je i tragičan ishod.
5

6. Glukoza u krvi
Osnovni energent u metabolizmu je glukoza
Koncentracija glukoze direktno utiče na mogućnost
ishrane ćelija
Normalne vrednosti glukoze u krvi su u intervalu od
4 do 6.5 mmol/litru (70-110 mg/100 ml)
Glukoza iz krvi u metaboličkom procesu ulazi u
ćeliju i u procesu oksidacije daje potrebnu energiju
za elektro hemijske procese koji rezultuju
aktivacijom ćelije
Svaki poremećaj koncentracije (hipoglikemija i
hiperglikemija) može da dovede do kratkotrajnih ili
dugotrajnih posledica
Opseg normalnih vrednosti
najvažnijih sastojaka krvi
GASOVI U KRVI
pO2[mmHg] 80-104
Pored O2, CO2 i glukoze pCO2 [mmHg] 33-78
niz drugih minerala je pH 7.31-7.45
neophodan za Hematokriti [%] 40-54
funkcionisanje organizma Ukupni hemoglobin [g/100 ml] 13-18
(Fe, Ca, Mg, itd.), naravno Zasićenje O2 [%] 95-100
tu su prisutni i Na+ i K+. ELEKTROLITI
Većina svih minerala je u Na+ [mmol/l] 135-155
jonskom obliku. K+ [mmol/l] 3.6-5.5
Takođe, od značaja je i Ca2+[mmol/l] 1.14-1.31
koncetracija, tj. parcijalni Cl- [mmol/l] 98-109
pritisak drugih gasova METABOLITI
(npr. pH - parcijalni pritisak Glukoza [mg/100 ml] 70-110
vodonika) Laktati [mg/100 ml] 3-7
Kreatinin [mg/100 ml] 0.9-1.4
Urea [mg/100 ml] 8-26
6

7. Princip rada elektrohemijskih
pretvarača
a)
b)
Princip rada elektrohemijskih
pretvarača
Odabirom i konstrukcijom elektroda
potrebno je postići da mereni napon
zavisi isključivo od koncentracije
određene vrste jona
E1+E2+E4+E5=const
E3=f(koncentracije)
7

8. Merenje parcijalnog pritiska
kiseonika (pO2)
Zapremina kiseonika u nekoj tečnosti zavisi samo od
rastvorljivosti kiseonika u toj tečnosti, ali je u prisustvu
drugih sastojaka u krvi određivanje znatno složenije.
Osnovni sastojak odgovoran za prisustvo kiseonika u
krvi je hemoglobin (Hb), pigment gvožđa, koji lako
oksidiše, i postaje oksihemoglobin (HbO2).
Jedan gram hemoglobina se kombinuje sa 1.34 ml
kiseonika, a tipično 100 ml krvi sadrži 15 grama
hemoglobina, tako da 100 ml krvi sadrži oko 20.1 ml
kiseonika.
U realnosti i drugi sastojci utiču na količinu kiseonika
kao što je koncentracija jona vodonika, tj. kiselost
rastvora, zasićenost hematokritima itd.
Elektroda za merenje parcijalnog
pritiska kiseonika (pO2)
Elektroda za merenje parcijalnog
pritiska kiseonika radi kao pretvarač u
struju pod dejstvom polarizacionog
napona od 0.6 do 0.8 Volti.
Elektroda je napravljena od Pt žice
koja je zatopljena u staklo i čiji je vrh u
direktnom kontaktu sa merenim
rastvorom
Strujni krug se zatvara preko
referentne Ag/AgCl elektrode i slanog
mosta od KCl
Pt elektroda predstavlja katodu koja
predstavlja ponor jona kiseonika,
pošto je zatvoreno strujno kolo stavra
se difuziona struja jona kiseonika koja
je proporcionalna pO2
Nedostatak starenje Pt elektrode
8

9. Klarkov tip kiseonične
elektrode
Princip rada isti kao kod
obične pO2 elekt.
Membrana od polietilena ili
teflona propušta jone
kiseonika, a blokira prolaz
svih ostalih čestica
Kontakt između katode i
referentne elektrode u samoj
kompaktnoj sondi
Joni koseonika prolaze kroz
membranu i odlaze ka katodi
usled čega dolazi do
gradijenta koncentracije i
struje difuzije
9

10. Upotreba O2 elektrode
Poprečni presek i elektronika
za Klarkovu O2 elektrodu.
Pojačavač sa leve strane daje
referentni napon od 0.7 V.
Pojačavač sa desne strane
radi kao pretvarač struje u
napon.
Otpor Rb odredjuje
jednosmernu struju Ib koja
poništava struju koja
odgovara koncentraciji
kiseonika 0.
Merenje pH - kiselosti
pH je recipročno vrednost koncentracije
jona vodonika (od 0 do 14; 7 je neutralan
rastvor)
Povećanje pH je smanjenje koncentracije
jona vodonika i povećanje baznosti rastvora
Smanjenje pH je povećanje koncentracije
jona vodonika i povećanje kiselosti rastvora
10

11. Merenje pH staklenom
elektrodom
Pufer smesa slabe baze ili
kiseline i njene soli
Održava stabilnu pH vrednost i pri
prodiranju jakih baza ili kiselina
tako što so formira kiselinu ili
bazu i neutrališe primesu u
puferu, a pH ostaje konstantan
Ako je koncentracija H+ jona u
merenom rastvoru drugaćija no u
puferu oni difunduju kroz
membranu stavrajući membranski
potencijal koji je srazmeran razlici
koncentracije H+ jona sa dve
strane staklene membrane
Staklena pH elektroda i kalomel elektroda za merenje pH. Kalomel je
referentna elektroda (V=0)
11

12. Referentna kalomel elektroda
Merenje pCO2
Princip se bazira na modifikaciji merenja pH
Elektroda za merenje pH se obavije slojem
koji je propustan za molekule CO2
Između membrane i elektrode je tanak sloj
vode koji sa CO2 formira ugljenu kiselinu
H2CO3
Merenjem pH vrednosti dobija se
informacija o koncentraciji CO2
12

13. Elektroda za pCO2
Merenje pCO2
13

14. Kombinovana elektroda pO2 i
pCO2
Novi tip kombinovane
elektrode pO2 i pCO2.
OA2 izlaz daje napon
proporcionalan
koncentraciji kiseonika, a
elektrometarski
pojačavač daje napon koji
je:
VCO2 ≈ log10 (pCO2) + A
Intravaskularni senzori za
merenje parcijalnih pritisaka
Neprekidno posmatranje parcijalnih pritisaka gasova u krvi je osnovni
zahtev u tretmanu pacijenata sa poremećajima metabolizma
ventilacije
Razvijeni su minijaturni senzori koji se mogu intravaskularno koristiti
u dužem periodu
Princip rada senzora je zasnovan na promeni oblika i zapremine
crvenih krvnih zrnaca usled promene pH, pO2 ili pCO2
Različiti oblici i zapremina eritrocita različito utiču na promenu
refleksije u zavisnosti od dužine optičkog puta i ta veličina je
korelisana sa parcijalnim pritiscima
Optička vlakna se koriste za prenos incidentnog zračenja, i vraćanje
reflektovanog zračenja da bi se optičkom metodom odredile hemijske
karakteristike posmatranog substrata
Optička vlakna su pogodna zbog dimenzija, a i sa njima se
jednostavno vrši odabiranje samo određene frekvencije (filtar), tako
da se relativno lako mogu izdvojiti karakteristike od interesa
14

15. Principijelna šema optičkog
intravaskularnog senzora
Fluorescentni optički senzori
parcijalnog pritiska gasova
Nastaje fluorescencija usled interakcije upadnog
monohromatskog zračenja sa obojenim zrncima
Trajanje fluorescencije je obrnuto srazmerno pO2
Omotač se pravi od poroznog polipropilena
15

16. Intravaskularni sistem za
monitoring gasova u krvi
Merenje glukoze
Klasične metode merenja glukoze se svode
na uzimanje uzorka krvi, odvajanje plazme
od ćelije, dodavanje odgovarajućeg
reagensa plazmi i procesiranje dobijenog
substrata radi primene kolorimetrijske
metode merenja
Od posebnog je interesa pri tretmanu osoba
sa poremećenom regulacijom insulina meriti
u realnom vremenu koncentraciju glukoze,
da bi se na osnovu te informacije dozirala
količina insulina
16

17. Hemijski senzori za merenje
koncentracije glukoze u krvi
Glukoza u procesu oksidacije daje
glukoničnu kiselinu i peroksid
U prisustvu enzima glukoza oksidaze, ova
reakcija se vrši veoma brzo, a enzim se ne
troši već je samo katalizator
S obzirom da je ovo proces oksidacije, i da
postoji potrošnja kiseonika, jasno je da
možemo meriti potrošnju kiseonika,
oslobođenu toplotu, ili količine glukoničnu
kiseline i peroksida
U postojećim tehničkim realizacijama mere
se sve supstance osim glukonične kiseline
Poluprovodnički senzori za
hemijska merenja
17

18. Spektrofotometrija
Spektrofotometrija je osnova za merenje niza sastojaka gasova i
tečnosti
Princip rada spektrofotometra je da materijali koji su od interesa
selektivno absorbuju, propuštaju ili reflektuju elektromagnetske talase
različitih talasnih dužina
Koristi se opseg između ultraljubičastih i infracrvenih talasa, tj. između
200 i 800 nm
Birač talasne dužine
Za odabiranje jedne talasne dužine svetlosti pri merenjima
koriste se optički filtri i monohromatori
Filtri se realizuju primenom posebnih vrsta silikatnog stakla sa
raznim primesama, i one u velikoj meri atenuiraju određene
talasne dužine, dok su druge talasne dužine manje oslabljene
Monohromatori koriste efekte prelamanja (prizma) i difrakcije
(difrakciona rešetka)
Monohromatori imaju mali propusni opseg (≈0.5 nm) u
zavisnosti od proreza koji se postavlja iza monohromatora
prema uzorku, i odličnu propustljivost (90%)
Posebna prednost monohromatora je što možemo lako
menjati propusni opseg i talasnu dužinu
Prizme se prave od stakla ili kvarca, a kvarc mora da se koristi
za talasne dužine iznad 350 nm
18

19. Spektrofotometar
Merenja sastava tečnosti -
Disperzivna spektrofotometrija
Šema dvo-zračnog spektrofotometra. Jednostruki monohromator
raspršava svetlo pre fotodetektora. Otvori nisu prikazani.
19

20. Plameni fotometri
a)
b)
Uzorak se nalazi u posudi, pomešan sa
supstancom koja omogućava sagorevanje i
posebnom pumpom dovodi do gorionika gde
se po potrebi raspršuje u sitne kapljice
Emisioni plameni fotometri a)
Rade na principu emisije zračenja koja
nastaje pri vraćanju pobuđenog elektrona u
ravnotežno stanje
Energija potrebna da pobudi elektrone je
toplota koja se razvija u plamenu
Količina zračenja je proporcionalna
koncentraciji materijala, a talasna dužina je
karakteristika materijala
Mereći spektralnu karakteristiku saznajemo
sastav i koncentraciju datog materijala u
supstanci
20

21. Šematski prikaz
plamenog emisionog
fotometra.
Dva kanala se
koriste u cilju
kompenzacije
«šuma».
Absorpcioni plameni fotometri
b)
Svetlosni snop se propušta kroz plamen,
deo energije će biti absorbovan usled
interakcija sa materijalom, pa u zračenju
koje dolazi na detektor nedostaju pojedini
delovi spektra
Nepostojanje pojedine talasne dužine pri
snimanju je indikator postojanja određene
materije, a stepen absorpcije, tj. smanjenja
intenziteta zračenja na pojedinoj talasnoj
dužni indikator koncentracije date supstance
21

22. Šematski prikaz
plamenog
absorpcionog
fotometra.
Dva kanala se koriste
u cilju kompenzacije
«šuma».
Fluorometri
Fluorometrija ja zasnovana na činjenici da brojni
molekuli emituju svetlo karakteristične talasne
dužine neposredno posle absorbovanja energije
zračenja
U ovom procesu eksitacija nastaje kao rezultat
elektromagnetske energije dovedene iz svetlosnog
izvora, tj. lampe
Prednost fluorometra u odnosu na plamene
fotometre je u povećanoj osetljivosti
Druga najvažnija prednost je što u ovoj metodi
detektujemo fluorescenciju, tako da ne dolazi do
registrovanja zračenja drugih supstanci koje nisu od
interesa, i koje su zapravo artefakti
22

23. Fluorometri
Fluorometri
U ovoj metodi se koriste dva filtra, jedan na optičkom putu
ozračavanja, i drugi na optičkom putu emisije
U principu se koriste različiti filtri, jer su energije eksitacije i emisije
različite, pa samim tim i treba koristiti filtre sa različitim propusnim
opsezima.
U fluorometrima se koriste različiti izvori svetla, ali je najčešća
primena živine lampe. U tom slučaju se javljaju osnovne linije na 365,
405 436 i 546 nm.
Za razliku od prikazanih šema spektrofotometara u ovom slučaju su
izvor svetla i detektor postavljeni u međusobno ortogonalnim
pravcima da bi se onemogućilo eventualno direktno prostiranje
svetlosti do detektora.
Fluorescencija je osetljiva na temperaturu i pH bez obzira o kom se
materijalu radi, a s obzirom da je cilj merenja koncentracija određene
supstance, moguća je greška.
23

24. Fotometri
Fotometri mere difuznu refleksiju od "nepoliranih" površina. Za difuznu
refleksiju je karakteristično da su neke energije absorbovane, dok su druge
reflektovane,
Uređaj za merenje se naziva reflektometar ili refleksioni denzitometar. U ovom
uređaju kolimisani snop svetla dolazi do uzorka (nepolirane površine) pod
pravim uglom, a meri se reflektovano zračenje pod uglom od 45o
Izvor zračenja je najčešće LED dioda. Nulti nivo refleksije se koristi za
baždarenje. Taj nulti nivo je refleksija of vrlo čistog barijumsulfata ili
magnezijumkarbonata. Oba materijala ne absorbuju talasne dužine koje se
primenjuju, pa je reflektovano zračenje maksimalno u odnosu na inicijalno
zračenje iz izvora.
Kada se umesto pomenutih materijala postavi uzorak koji posmatramo
smanjuje se reflektovano zračenje što registrujemo detektorom. Uzorak se
formira korišćenjem različitih reagensnih materijala i fiziološke tečnosti koju
analiziramo (npr. urin, krv, cerebrovaskularna tečnost). Pri kontaktu fiziološke
tečnosti i reagensa dolazi do "bojenja" reagensa, boja zavisi od koncentracije
supstance na koju je reagens osetljiv
Zadatak fotometra je precizno određivanje boje reagensa što direktno ukazuje
na koncentraciju supstance
Primer trake sa reagensima
Traka za registrovanje prisustva i merenje koncentracije 9 raznih supstanci u urinu
(Boehringer Manheim Diganostics CHEMSTRIP). Komenzaciona zona je
namenjena za automatsko baždarenje reflektometra.
24

25. Slide format reagensa za
fotometre
Za merenje u kliničkim i kućnim
uslovima, i vrlo brzu dijagnostiku
koriste se trake na kojima uzorak
dolazi u kontakt sa reagensom
koristeći takozvani "slide" format
Princip rada ovog senzora je identičan
kao i opisanih traka, ali je metod
posebno pogodan za analizu
koncentracije pojedinih supstanci u
krvi (npr. glukoza)
U slučaju merenja u krvi je mnogo
pogodnije uzorak krvi, kapljicu, staviti
na centralno polje "slide" senzora, a
zatim snimati refleksiju i iz rezultata
"pročitati" koncentraciju.
Osnovni sastojci krvi
Krv je vrlo kompleksan rastvor čvrstotelnih čestica u tečnosti plazmi
Čestice od interesa su eritrociti, leukociti i platelete
Eritrociti su sfernog oblika i imaju prečnik između 6.8 i 7.5 µm, sa
srednjom vrednošću od 7.2 µm, i zauzimaju zapreminu od približno 90 x
10-18 m3. Broj eritrocita u normalnom organizmu se kreće između 4.2 i
5.8 x 1012 po litru kod muškaraca, i 3.7 do 5.2 x 1012 po litru kod žena.
Leukociti su veći od eritrocita i njihov prečnik je između 6 i 18 µm, a
razlikujemo nekoliko vrsta ćelija (štapičasti, segmentirani, eozinofilni,
bazofilni, monociti, limfociti). U proseku u zdravom organizmu ima
između 4 i 10 x 109 po litru belih krvnih zrnaca.
Platelete, ili trombociti su najmanje od tri pomenute čestice i njihov
prečnik je 2 do 4 µm, a ima ih u proseku između 1.5 i 3.5 x 1011 po litru u
zdravom organizmu. Uobičajeno imaju oblik diska. Osnovni zadatak
trombocita je da zaustave krvarenje u slučajevima povrede krvnih
sudova.
25

26. Dodatne analize krvi
Pri analizi krvi mere se koncentracija hemoglobina, sedimentacija,
hematokrit
Postavljanjem epruvete u kojoj se nalazi krv stabilizovana
antikoagulantom, odnosno rastvorom koji ne dozvoljava zgrušavanje, u
centrifugu, i njenim uključenjem izdvajaju se čvrste čestice iz plazme na
dnu epruvete
S obzirom da je epruveta konstantnog poprečnog preseka odnos visine
sloja koji popunjavaju čestice u odnosu na ukupnu visinu stuba u
epruveti, tj. odnos zapremine čestica u odnosu na ukupnu zapreminu
uzorka je broj između 0 i 1. Ovaj broj nazivamo hematokrit.
Sedimentacija je proces izdvajanja čestica iz krvi na dno epruvete usled
gravitacije. Pri tome se krv tretira antikoagulantom. Uobičajeno se
posmatra količina koja se izdvoji za jedan odnosno dva sata, a kao
rezultat daje njihov odnos.
Ručno brojanje krvnih zrnaca
Pre upotrebe automatizovanih brojača
krvnih zrnaca merenje se vršilo primenom
mikroskopa i usrednjavanjem vizuelno
prebrojanih sastojaka krvi u vidnom polju
mikroskopa
Preparat za mikroskop se pravio
razmazivanjem tankog sloja krvi po
staklenoj pločici
Posmatranje uzoraka koristeći mikroskop je
i dalje aktuelno pre svega u analizi
morfologija ćelija.
26

27. Automatizovani brojači krvnih
zrnaca
Brojači krvnih zrnaca rade na principu merenja impedanse
između dve tačke na milimetarskom rastojanju postavljene u
tankoj cevi prečnika oko 100 µm
Krvna zrnca imaju relativno veliku otpornost, pa ako se krv
rastvori u tečnosti koja ima dobru provodnost onda s obzirom
da su dimenzije različitih ćelija (eritrociti, leukociti, trombociti)
različite možemo da detektujemo koja čestica je između
mernih elektroda
Brojanjem ovih događaja, i merenjem ukupne količine tečnosti
koja je prošla između elektroda dobijamo broj pojedinih ćelija
u jedinici zapremine
Uobičajeno je da su elektrode od platine (Pt), a između
elektroda je cev sužena, tako da praktično sve ćelije u nizu
prolaze pored elektroda, a između elektroda se nalazi samo
po jedna ćelija
Automatizovani brojači krvnih
zrnaca
27

28. Optički brojači krvnih zrnaca
Optički sistem koristi osobine da je rasejanje svetlosti pri interakciji sa
različitim elementima krvi različite, pa se brojanjem promena rasejanja
u zadatoj zapremini određuje traženi parametar
I u ovom slučaju se primenjuje rastvor krvi koji se propušta kroz tanku
cev, ali se umesto elektroda kroz cev propušta svetlost i meri
transmisija
Sa izlazne strane se nalazi procep, tako da se samo jedan deo
rasejanog zračenja detektuje
U zavisnosti od ugla rasejanje, zavisi i koliki deo zračenja će proći kroz
"prozor". Na taj način se razlikuju razne vrste ćelija.
Često se za ove namene koriste laserski izvori svetla, a kao detektori
fotodiode i fotomultiplikatori
Sa izlazne strane se u nekim aparatima detektor postavlja pod uglom u
odnosu na upadni pravac zračenja, tako da u trenucima u kojima se na
optičkom putu ne nalazi ćelija krvi, senzor ne registruje zračenje, jer ne
postoji rasejanje
28