Pruebas bioquímicas utilizadas para identificación de enterobacterias

1. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA
ENTEROBACTERIAS
Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas
para diferenciar bacterias. Estas pruebas se fundamentan en
demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar
azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de
compuestos, la producción de compuestos coloreados, etc.

2. TSI: Triple azúcar Hierro
 Objetivo:
- Diferenciar las especies de enterobacterias.
- Identificar los productos finales de los procesos metabólicos
 Composición:
Peptona 159 g
Extracto de levadura 3 9.9g
Extracto de carne 3 g
Sacarosa 10 g
Sulfato de hierro 0,20 g
Cloruro sódico 5 g
Tiosulfato de sodio 0,30 g
Rojo fenol 0,024 g

3.  Fundamento:
El extracto de carne y peptona aportan los nutrientes para el desarrollo
bacteriano.
La lactosa, sacarosa y glucosa son los carbohidratos fermentables.
El rojo de fenol es el indicador de pH.
Por la fermentación de los azúcares, se producen ácidos que se detectan por el
indicador de pH.
 Materiales:
- Asa de siembra.
- Mechero de alcohol.
- Medio TSI
- Tubos TSI

4. Procedimiento
- Preparar medio TSI, envasar en tubos y dejar solidificar en pico de flauta.
- Inocular los tubos de TSI con el asa de siembra, para eso se debe
introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo.
- Tras retirar el asa del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y
otro lado.
- Incubar a 35° durante 24 horas.

5. Interpretación:
Si fermenta la glucosa, acidificará el medio haciendo virar a amarillo el indicador en el
fondo del tubo.
Si fermenta lactosa o sacarosa, acidifica el medio en su superficie volviéndolo de color
amarillo.
Si produce ácido sulfhídrico se presentará un ennegrecimiento del tubo. La producción de
sulfhídrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación de la
glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es
fermentadora de glucosa.
Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora de
gas.

7. Citrato de Simmons
 Objetivo:
- Observar algunas reacciones bioquímicas relacionadas con la fisiología
bacteriana, para la identificación de enterobacterias
 Composición:
Fórmula Litro
Dihidrógeno fosfato de amonio 1 g
Fosfato dipotásico 1 g
Cloruro de sodio 5 g
Citrato de sodio 2 g
Sulfato de magnesio 0.2 g
Azul de bromotimol 0.08 g
Agar 15 g

8.  Fundamento:
El medio contiene citrato de sodio, que es un anión, como única fuente de carbono, y
fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar
el citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de
amoniaco (NH+), lo que produce la alcalinización del medio por conversión del NH a
hidróxido de amonio (NH4OH).
 Materiales:
- Asa de siembra.
- Mechero de alcohol.
- Medio Citrato de Simmons
- Tubos de ensayo

9. Procedimiento
 Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio de
aislamiento primario
 Se siembra en forma de estría única en el pico de flauta (agar inclinado)
del tubo de agar citrato.
 El tubo se incuba a 35 °C durante 24 a 48 horas

10. Interpretación:
 La prueba positiva esta representada por la
producción de color azul oscuro en el termino de 24 a
48 horas, que indica que el microorganismo en
prueba ha sido capaz de utilizar el citrato contenido
en el medio, con formación de productos alcalinos.
 La prueba también puede considerarse positiva sin
que haya color azul, si hay desarrollo visible en la
estría de siembra. Esto es valido porque para que
el desarrollo sea visible, el microorganismo debió
haber ingresado en la fase logarítmica de
crecimiento, lo que solo es posible si ha asimilado
carbono y nitrógeno.

11. LIA: Agar Lisina Hierro
MEDIO DE
CULTIVO
Indicador de pH: Purpura de bromocresol
Ácido: Amarillo pH 5.2
Alcalino: Púrpura pH 6.8
Medio no inoculado: Purpura intenso brillante pH 6.0
Base de descarboxilasa de Moller
Composición:
Peptona
Piridoxal
Citrato deamonio
Glucosa
Agar
Extracto de carne
L-lisina
Tiosulfato de sodio
Agua destilada

12.  Fundamento:
Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido
(lisina y arginina) para formar una amina con la consiguiente alcalinidad.
 Materiales:
- Asa de siembra.
- Mechero de alcohol.
- Medio LIA
- - Tubos de ensayo
Procedimiento
 Inocular por picadura y estría
 Incubar a 35-37°C
 Tiempo 18-24 hrs

13.  Interpretación:
A: Ácido (Amarillo)
K: Alcalino (Violeta)
R: Rojo (desaminación oxidativa)
• Descarboxilación de lisina:
Positivo : K/K
Negativo: K/A
• Desaminación de lisina: R/A
• Producción de H2S: Enegrecimiento del medio
• Producción de gas: burbujas o levantamiento del medio de cultivo de las
paraedes deltubo.

14. SIM: Sulfuro Indol Movilidad
 Objetivo:
- Determinar si un organismo es móvil o inmóvil, si es capaz de liberar ácido sulfhídrico
y la capacidad de desdoblar el indol de la molécula de triptófano.
 Fundamento:
La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una reacción de reducción que da
un sulfito y un sulfato.
El gas incoloro SH2 reacciona con una sal pesada, citrato férrico de amonio para producir un
precipitado negro insoluble, sulfato ferroso.
El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres
metabolitos principales: indol, escatol e indolacético.
La formación de indol se produce solamente en aquellos organismos capaces de
fermentar los hidratos de carbono.

15.  MEDIOS Y REACTIVOS
 Caldo triptofano (triptofano al1%)
• Peptona o digerido pancreatico de caseina (tripticasa) 2g
• Cloruro de sodio0,5g
• Agua destila da 100ml
 Reactivo de Kovac
• Alcohol amilico o isoamilico puro 150ml
• p-dimetilaminobenzaldehido 10g
• HCI concentrado 50ml
 Reactivo de Ehrlich
• p-dimetilaminobenzaldehido 2g
• Alcohol etílico 190ml
• HCI concentrado 40ml

16. Procedimiento
 Sembrar el caldo triptófano con el microorganismo por probar e incubar a
35 °C durante 18 a 24 horas.
 Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15 gotas del reactivo
haciendoque se deslicen por la pared del tubo.
 Si se utiliza el reactivo de Ehrlich, este
paso debe ser precedido por el agregado de 1 mL de xilol. Esto no
es necesario con el reactivo de Kovac.

17.  Interpretación:
 Ácido sulfhídrico positivo: Ennegrecimiento del medio
 Indol:
Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio
Negativo: No se produce color /Color naranja en la superficie del medio indica
desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser precursor de la
formación de indol.

18.  Movilidad:
Positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y se difunden
en el medio provocando turbiedad.
Negativa: Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra.

19. MIO: Movilidad, Indol, Ornitina
 Objetivo:
Identificar enterobacterias sobre la base de movilidad, la producción de ornitina
descarboxilasa e indol.
 Composición:
• Extracto de levadura
• Peptona
• L-Ornitina
• Dextrosa
• Agar
• Agua
Indicador de pH: Púrpura de bromocresol
Ácido: amarillo pH 5.2
Alcalino: Púrpura pH 6.8
Medio no inoculado: Púrpura intenso brillante pH 6.0

20.  Fundamento:
• Descarboxilación de ornitina: mide la capacidad enzimática de un organismo para
descarboxilar un aminoácido para formar una amina, con la consiguiente
alcalinidad.
• Producción de indol: El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por
ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e
indolacético.
 Procedimiento
 Inoculación: picadura en forma vertical
 Tiempo: 28-48 hrs
 Temperatura 35 -37°C

21.  Interpretación:
 Ornitina descarboxilasa
Positivo: color púrpura del medio
Negativo: color amarillo en el fondo del tubo que puede ser púrpura al final
 Indol:
Positivo: anillo rojo en la superficie del medio
Negativa: No se Produce color / Color naranja en la superficie del medio, indica
desarrollo de escatol

22.  Movilidad:
Positiva: Los organismos móviles migran de la línea de siembra en el medio
provocando turbiedad.
Negativa: crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra.

23. Ureasa
 Objetivo:
Estudiar si el microorganismo posee el enzima ureasa que cataliza la hidrólisis de la urea.
 Composición:
Caldo urea de stuart
Extracto de levadura 0,1 g
Fosfato monopotasico 9,1 g
Fosfato disodico 9,5 g
Urea 20 g
Rojo fenol 0,01 g
Agua destilada 1 L
Agar urea de christensen
Peptona 1 g
Glucosa 1 g
Cloruro de sodio 5 g
Fosfato monopotasico 2 g
Urea 20 g
Rojo fenol 0 ,012 g
Agar 15 g
Agua destilada 1 L

24.  Fundamento:
• Es una diamida del acido carbónico
• Todas las amidas se hidrolizan fácilmente, con liberación de amoniaco y dióxido de
carbono.
• El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio, lo que
produce alcalinización y aumento de pH del medio.
 Procedimiento
 El medio liquido se siembra con un asa, tomando del cultivo puro el
microorganismo por probar.
 El pico de flauta se siembra en estría con el microorganismo por probar.
 Ambos medios se incuban a 35 °C durante 18 a 24 horas.

25.  Interpretación:
Los microorganismos que hidrolizan la urea rápidamente pueden producir reacciones
positivas en l o 2 horas; las especies menos activas pueden requerir 3 días o mas.
 Un color rojo en todoel medio indica alcalinización e hidrolisis de la urea.
 Ausencia de hidrolisis de la urea: el medio conserva su color amarillo original.

26. Caldo MR/VP
 Objetivo:
Medio diferencial para Enterobacterias, basado en la reacción del Rojo Metilo
(MR) y del Acetilmetilcarbinol ( VP, Voges-Proscauer)
 Composición:
A. CaldoVP/RM
• Polipeptona 7g
• Glucosa 5g
• Fosfato dipotasico5g
• Agua destilada1L
B. Reactivos
• oc-naftol al 5%. intensificador de color
• a-naftol 5 g
• Alcohol etilico absoluto 100 mL
• Hidroxido de potasio al 40%, agente
oxidante
• Hidroxido de potasio 40 g
• Agua destilada 100 mL

27.  Fundamento:
• El acido pirúvico, se metaboliza da como resultado la producción de acetoina (acetil
metil carbinol).
• Los microorganismos del grupo Klebsiella- Enterobacter-Hafnia-Serratia producen
acetoina como producto metabólico final principal del metabolismo de la glucosa y
forman cantidades pequeñas de ácidos mixtos.
• En presencia de oxigeno atmosférico e hidróxido de potasio al 40%, la acetoina se
convierte a diacetilo y el a-naftol sirve de catalizador para producir un complejo de
color rojo.

28.  Procedimiento
 Sembrar un tubo de caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo a probar.
 Incubar 24 horas a 35 °C.
 Finalizada la incubación, transferir 1 ml del caldo a un tubo de ensayo limpio.
 Agregar 0,6 ml de a-naftol al 5%, seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%.
Es esencial que los reactivos sean agregados en ese orden. Agitar suavemente el
tubo para exponer el medio al oxigeno atmosférico y dejar el tubo en reposo durante
10 a 15 minutos.

29.  Interpretación:
Positivo: desarrollo de color rojo 15 minutos o mas después del agregado de los
reactivos, que indica la presencia de diacetilo, el producto de oxidación de la acetoina.
La prueba no debe leerse mas allá de una hora después de dejar los tubos en reposo,
porque los cultivos Voges-Proskauer negativos pueden producir un color cobrizo, que se
puede interpretar como un positivo falso.