Apresentação sobre provas de identificação e meios de cultura usados em laboratório para diagnóstico de microrganismos, em especial, bactérias.

1. Universidade Federal do Pará
Hospital Universitário João de Barros Barreto
Laboratório de Análises Clínicas
Estágio Supervisionado I
João Marcos de Oliveira
Belém
2016
Microbiologia: meios de cultura e
provas de identificação

2. Meios de cultura: inespecíficos
Ágar Sangue
→ Isolamento não específico de microrganismos
→ Verificação de hemólise causada pelos
microrganismos, especialmente de Streptococcus sp. e
Staphylococcus sp.
Ágar Chocolate
→ Isolamento não específico de microrganismos
exigentes
→ sangue hemolisado: libera nutrientes fundamentais
para o crescimento desses microrganismos
Ex: Haemophilus sp., Neisseria sp. entre outros.
João Marcos

3. Ágar sangue: observação de hemólise
α-hemólise β-hemólise γ-hemólise
α-hemólise: lise parcial das hemácias.
β-hemólise: lise total das hemácias.
γ-hemólise: hemácias permanecem íntegras.
Fonte das imagens: www.bacteriainphotos.com
João Marcos

4. Ágar chocolate
Haemophilus influenzae em ágar chocolate.
Fonte: Medical-Labs
Neisseria meningitidis em ágar chocolate.
Fonte: Flickr: Nathan Reading
João Marcos

5. Meios de cultura: inespecíficos
Candida albicans Aspergillus fumigatusSporothrix schenckii
Ágar Sabouraud
→ Meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos
fungos leveduriformes e filamentosos. Como o meio não é
seletivo, pode ocorrer contaminações por bactérias.
→ Para evitar que isso ocorra, alguns laboratórios optam por
usar esse meio com um antibiótico na composição (Ex:
gentamicina ou cloranfenicol).
João Marcos

6. Meios de cultura: inespecíficos
Ágar CLED
→ Isolamento não específico e quantificação de
microrganismos (bactérias e leveduras) presentes em
amostras de urina
→ Permite identificar a fermentação da lactose pelas colônias.
Escherichia coli Pseudomonas aeruginosaKlebsiella pneumoniae
João Marcos

7. Ágar MacConkey
→ Isolamento específico de bacilos Gram-negativos (enterobactérias e não fermentadores),
além da observação de colônias fermentadoras de lactose.
→ inibe o crescimento de micro-organismos Gram-positivos, especialmente Enterococcus e
Staphyococcus.
Meios de cultura: específicos
Meio original Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa
João Marcos

9. Meios de cultura: específicos
Ágar Salmonella-Shigella
→ Isolamento específico de bacilos, além da observação de colônias fermentadoras de lactose.
Usado com a finalidade de isolar espécies de Salmonella e Shigella.
→ Devido a alguns de seus componentes - sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio -, tem
poder de inibição maior contra o crescimento de Enterococcus e Staphyococcus. Tiossulfato de
sódio e o citrato férrico permitem evidenciar a coloração negra das colônias de Salmonella spp
Meio original Salmonella spp. Shigella spp.
João Marcos

10. Meios de cultura: específicos
Ágar Manitol
→ Isolamento específico de bactérias do gênero Staphylococcus.
→ Meio com alta concentração de sal, além de ter em sua composição indicador de pH.
Meio original Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis
Fonte das imagens: Site Biomedicina Brasil
João Marcos

11. Meios de cultura: específicos
Colônias de Pseudomonas aeruginosa em Ágar Cetrimide
Fonte: BioMérieux
Meio original
Fonte: EO Labs
Isolamento
Ágar Cetrimide
→ Isolamento específico de Pseudomonas aeruginosa.
→ A cetrimida (brometo de cetiltrimetilamônio) é um composto quaternário de amônio que inibe
um grande número de bactérias incluindo espécies de Pseudomonas exceto a aeruginosa.
→ A maioria das espécies de P. aeruginosa podem ser identificadas pelo odor característico
parecido com uva da aminoacetofenona.
João Marcos

12. Meios de cultura: específicos
Ágar Löwenstein Jensen
→ Isolamento de Mycobacterium spp.; o crescimento dessas colônias é lento.
→ Alta concentração de lipídios: utilização de ovos na produção do meio como fonte
dessas moléculas.
Cultivo
Ágar Löwenstein Jensen
Fonte: Biomedicina Brasil
Mycobacterium tuberculosis em Löwenstein Jensen. Colônias
com aspecto de fungos.
João Marcos

13. Meios de cultura: inespecíficos
Ágar Mueller-Hinton
→ Isolamento não específico de microrganismos
→ Meio padrão para a realização de antibiograma pelo
método de Kirby-Bauer (disco-difusão)
→ A sensibilidade é determinada a partir da medição dos
halos de cada antimicrobiano. Cada antibiótico tem seus
valores próprios de sensibilidade.
João Marcos

14. Antibiograma
Valores de alguns antibióticos para antibiograma.
Fonte: Laborclin
João Marcos

15. Coloração de Gram
→ A parede celular das bactérias Gram-
positivas é formada principalmente por
ácidos teicoicos e a das bactérias
Gram-negativas, principalmente por
lipídeos.
→ Por possuírem grande quantidade
de ácidos teicoicos, as Gram-positivas
formam um complexo corado azul
intenso, que não é removido facilmente
com álcool-acetona.
→ As Gram-negativas não retêm a
coloração após o tratamento com
álcool-acetona e são reveladas com
solução de fucsina (coloração de
contraste), ficando coradas de rosa.
João Marcos
Fucsina
Procedimento para a realização da coloração de Gram em
laboratório.

16. Teste da catalase
→ A catalase é uma enzima que decompõe o
peróxido de hidrogénio (H2O2) em água e gás
oxigênio (O2).
→ Após a aplicação da solução de H2O2 à 3%
, a produção de bolhas (devido à produção
de O2) evidencia o resultado positivo para
catalase.
→ Juntamente com a morfologia observada
na coloração de Gram, ela ajuda a dar um
direcionamento para as próximas provas de
identificação.
João Marcos
Teste da catalase: a produção de bolhas ocorre em
bactérias que possuem a enzima catalase.

17. Teste da coagulase
→ Verifica a capacidade de microrganismos reagirem
com o plasma e formarem um coágulo, já que a
coagulase é uma proteína com atividade similar à
protombrina, capaz de converter o fibrinogênio em
fibrina.
→ Para o teste, utiliza plasma de coelho, que na
presença de coagulase, irá formar coágulos no tubo.
→ Separa as espécies de Staphylococcus de
importância clínica (S. aureus), que é coagulase
positiva, das demais espécies do gênero (por serem
coagulase negativa)
João Marcos
Teste da coagulase: a produção de
coágulos no tubo ocorre na presença de
Staphylococcus aureus. Na foto, o
primeiro tubo mostra a presença do
coágulo formado, enquanto no segundo
não há formação do coágulo (o plasma
continua no estado líquido)

18. Coloração de Ziehl – Neelsen (BAAR)
→ Utilizada para o diagnóstico laboratorial de
Micobactérias patogênicas (Mycobacterium tuberculosis
e Mycobacterium leprae), por baciloscopia direta.
→ É uma coloração mais agressiva que o Gram. Essas
bactérias são conhecidas como Bacilos Álcool-Ácido
Resistentes (BAAR), e por isso são resistentes à
coloração de Gram. Elas também possuem paredes
celulares com alto teor de lipídios (cerca de 60%), o que
diminui sua permeabilidade.
Fucsina fenicada sobre a lâmina por 5 minutos e
durante esse tempo, a lâmina deve ser aquecida 3 vezes,
prestando muita atenção, pois o corante deve apenas
emitir um leve vapor, não ferver. Álcool-ácido forte,
descora todas as outras bactérias, com exceção das que
são resistentes a ele (BAAR). Azul de metileno é o
corante usado para a coloração de fundo. Toda a lâmina
ficará colorida de azul, exceto BAAR, que estará rosa.
João Marcos
Coloração de Ziehl-Neelsen: BAAR
corados de rosa. Na imagem,
Mycobacterium tuberculosis.

19. Meios de cultura: TSI (série bioquímica)
Ágar TSI (Triple Sugar Iron Agar)
→ É utilizado para a diferenciação e identificação de bacilos Gram-negativos, com base
na fermentação de carboidratos, produção de H2S e gás.
Contém, em sua composição:
→ Três tipos de açucares: glicose, lactose e sacarose.
→ Vermelho de fenol: indicador de pH, para detecção da fermentação desses açucares.
→ Tiossulfato de ferro: detecção da produção de H2S (cor negra na base do tubo).
→ A fermentação é indicada pela mudança da cor do indicador de pH de vermelho para
amarelo (pH ácido), e a produção de H2S enegrece a base do meio.
João Marcos

20. Série bioquímica: TSI
Possíveis resultados do TSI após 24h de incubação.
Fonte: http://web.clark.edu/tkibota/240/Unknowns/TSI.htm
João Marcos

21. ÁPICE BASE H2S GÁS Interpretação mais provável
Vermelho Vermelha - - Sem crescimento: bactéria
exigente.
Vermelho Vermelha - - Crescimento na superfície: não
fermentador ou Gram +
Amarelo Vermelha - - Crescimento na superfície:
Gram + ou esquecimento de
picar a base
Amarelo Amarela - + Enterobactérias ou Aeromonas
Lac neg
Amarelo Amarela + + Salmonella, Proteus,
Morganella, Providencia e
Citrobacter
Possíveis resultados do TSI após 24h de incubação.
Fonte: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
Reações ápice/base
→ Vermelho/amarelo: fermentação da glicose (lactose e sacarose negativos).
→ Amarelo/amarelo = fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 açúcares).
→ Presença de gás (CO2) = bolhas ou meio fragmentado.
→ H2S positivo = cor negra na base.
João Marcos

22. Série bioquímica: Ureia
→ Determina a habilidade do
microrganismo de degradar a ureia em
duas moléculas de amônia pela ação da
enzima urease.
→ Em caso de reação positiva, irá
ocorrer alcalinização intensa do meio,
tornando-o rosa pink.
Teste da ureia: a coloração rosa pink indica reação positiva.
Fonte: Wiki AIA 13-17
João Marcos

23. Série bioquímica: meio SIM
Ágar SIM (Sulfato/Indol/Motilidade Agar)
→ Determina a habilidade do micro-organismo de metabolizar o triptofano em indol.
Triptofano é um aminoácido que pode ser degradado por certas bactérias resultando na
produção de indol, que é evidenciado após a adição do reagente de Kovacs.
→ Com a picada em linha reta, é possível avaliar se a bactéria inoculada é imóvel ou não.
Teste do indol após a adição do reativo de Kovacs
Fonte: http://www.microbiologyinfo.com
Teste da motilidade. O tubo à
esquerda é positivo.
João Marcos

24. Série bioquímica: Fenilalanina
→ Algumas bactérias têm a capacidade de
realizarem a desaminação oxidativa da fenilalanina
através da enzima fenilalanina desaminase.
→ Como produto, formará o ácido fenilpirúvico, que,
por ser ácido, irá acidificar o meio.
→ Para a leitura da prova, é necessário a utilização de
cloreto férrico a 10%, que irá revelar o resultado do
teste.
Teste da fenilalanina após a adição do
cloreto férrico. A reação é praticamente
imediata e irá apresentar a cor verde quando
for positiva.
João Marcos

25. Série bioquímica: Citrato Simmons
→ Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o
citrato de sódio como única fonte de carbono,
juntamente com sais de amônia como fonte de
nitrogênio.
→ No caso de reação positiva, haverá alteração do
pH, que se torna alcalino e provoca a viragem do
indicador de pH (azul de bromotimol) para azul.
Alteração de pH do meio faz com que haja a
mudança de cor
Fonte: mi-cro-sco-pi-ca.blogspot.com
João Marcos

26. Série bioquímica: Caldo malonato
→ Determina a habilidade do microrganismo de
utilizar malonato de sódio como única fonte de
carbono, resultando em alcalinização do meio.
→ A cor original do meio é verde. Em reações
positivas, há a viragem do indicador de pH e o
caldo se torna azul.
→ Em reações negativas, o meio não sofre
alterações e permanece verde.
Caldo malonato: alteração de pH do meio faz
com que haja a mudança de cor em reação
positiva
João Marcos

27. Série bioquímica: Lisina descarboxilase
Ágar Lisina
Crescimento bacteriano → Há a fermentação de
glicose com produção de ácido → acidifica o
meio → o indicador de pH vira, fazendo o meio
mudar de púrpura para amarelo.
Se a bactéria possuir a enzima lisina
descarboxilase: há a liberação de CO2 e
descarboxilação da lisina com produção de
cadaverina (composto alcalino) → neutraliza os
ácidos produzidos na fermentação da glicose →
alcaliniza o meio → viragem do indicador de pH
novamente: o meio muda de amarelo e volta a
ser púrpura (reação positiva). Teste da Lisina descarboxilase: o tubo amarelo
(à direita) apresenta reação negativa.
João Marcos

28. Prova de identificação: DNAse
Ágar DNAse
→ Cepas de alguns microrganismos produzem DNase e
endonuclease termoestável. Essas enzimas hidrolisam o DNA
contido no meio de cultura.
→ Azul de toluidina é adicionando à base do meio.
João Marcos
Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Escherichia coli
Cor original do meio
Resultado...
Positivo: coloração rosa em volta da colônia. Negativo: O meio permanece inalterado.