1. 323Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
VIII.-Capítulo 9
Biotecnología aplicada al control de
enfermedades fúngicas y bacterianas
Zappacosta, Diego
1 Introducción
Desde la domesticación de las plantas por
el hombre las enfermedades han causado
enormes pérdidas en la producción. El uso
intensivo de monocultivos con baja diversi-
dad genética en la agricultura moderna ha
redundado en una elevada susceptibilidad a
algunas enfermedades y en un incremento
de la agresividad de algunos patógenos. Con
excepción de las enfermedades epidémicas,
que llegan a destruir cultivos completos, se
estima que las pérdidas ocasionadas por
patógenos en el plano mundial representan
un 12% del potencial de producción, tenien-
do mayor incidencia en hortalizas, frutales y
arroz. Además de causar pérdidas en la pro-
ducción, algunos patógenos también redu-
cen la calidad de los alimentos, como es el
caso de algunas especies de Fusarium y
Aspergillus, que dejan en los tejidos infec-
tados toxinas que afectan la salud humana
y animal.
Existen varias formas de controlar las
enfermedades, entre los que podemos men-
cionar: a) las prácticas culturales, como la ro-
tación, la sanidad del material inicial, el con-
trol de restos vegetales, etc., b) la aplicación
de agroquímicos y c) la resistencia genética.
Aunque las tres alternativas son utilizadas,
la última, por su mejor implementación y
menor impacto ambiental, es una de las
mejores opciones. Es frecuente, sin embar-
go, encontrar inconvenientes para su aplica-
ción, tales como la falta de genes de resis-
tencia, la rápida evolución de nuevas razas
virulentas del patógeno, etcétera.
La incorporación de genes de resisten-
cia es uno de los mayores desafíos para los
mejoradores durante el desarrollo de nue-
vos cultivares. Tradicionalmente se ha lleva-
do a cabo a través de métodos convencio-
nales de mejoramiento, que involucran se-
lección y evaluación de grandes poblaciones
derivadas de cruzamientos entre materiales
susceptibles y resistentes y la posterior selec-
ción bajo condiciones propicias para la en-
fermedad.
Si bien estos métodos convencionales
han resultado exitosos en muchos casos, son
lentos y laboriosos, ya que involucran cruzas,
retrocruzas y selección, siendo además difícil
seguir la evolución de nuevas razas virulentas
de los patógenos. Esto ha llevado a un uso
masivo de agroquímicos a pesar de su alto
costo y su alto impacto ambiental.
La biotecnología y la biología molecular
ofrecen nuevas herramientas a los
mejoradores, aumentando las posibilidades
y la eficiencia en la obtención de variabilidad
genética y en la selección de caracteres de-
seables, brindando además alternativas via-
bles para identificar, seleccionar y transferir
genes de resistencia.
El cultivo in vitro fue una de las primeras
herramientas de la biotecnología utilizadas
en la búsqueda de resistencia a enfermeda-
des. Desde sus distintas alternativas brinda
soluciones para sortear barreras en los cruza-
mientos, colaborando además en la selección
de genotipos resistentes. En lo que respecta
a la ingeniería genética, la resistencia a en-
fermedades fúngicas y bacterianas no ha al-
canzado el mismo nivel de desarrollo que la
resistencia a insectos o virus. Sin embargo
existen numerosos proyectos de investiga-
ción en curso y se prevé un gran desarrollo
comercial en los próximos años.
En este capítulo se intentará ofrecer un
panorama actualizado de las herramientas
que la biotecnología vegetal brinda al
mejorador para el estudio y control de las
enfermedades fúngicas y bacterianas.
2 Cultivo in vitro
Es posible encontrar genes de resistencia
en muchas de las especies cultivadas o en
especies muy cercanas filogenéticamente y
transferirlos por cruzamientos convenciona-
les a especies susceptibles. Sin embargo, a
veces, es necesario recurrir a especies no tan
cercanas filogenéticamente, pudiendo exis-
tir barreras de incompatibilidad. En estos ca-
sos es posible obtener híbridos viables con la
utilización de técnicas tales como el rescate
de embriones, la hibridización somática, la
2. 324 ZAPPACOSTA, Diego
fusión de protoplastos, la polinización in
vitro, etc. Estas técnicas ya fueron descriptas
en capítulos precedentes y son utilizadas
para la incorporación de diversas característi-
cas entre las que encontramos la resistencia
a enfermedades.
Una técnica promisoria es la selección in
vitro de materiales resistentes utilizando al
patógeno vivo o algún metabolito purifi-
cado o no del mismo u otras sustancias quí-
micas como agente de selección. Esta técni-
ca será tratada con más detalle a continua-
ción.
2.1 Selección in vitro de genotipos
resistentes
Los ensayos para la selección de resisten-
cia a patógenos («screening») y el estudio
de la interacción hospedador-patógeno bajo
condiciones de campo se encuentran sujetos
a una gran variación entre experimentos.
Esto se debe principalmente a la distribución
no uniforme de los patógenos y a la falta de
control sobre las variables ambientales. Por
ejemplo, en el caso de enfermedades del
suelo, los períodos relativamente largos de
crecimiento favorecen el desarrollo de otras
enfermedades que pueden interferir y afec-
tar la validez de los resultados. Por esta ra-
zón, queda claro que los ensayos de selec-
ción por resistencia a enfermedades deben
realizarse, en lo posible, bajo condiciones
controladas. Estas condiciones raramente
pueden encontrarse a campo. Se han plan-
teado alternativas utilizando invernáculos o
ambientes controlados, lo cual soluciona al-
gunos de los problemas mencionados ante-
riormente. En estas situaciones, la selección
de genotipos resistentes se basa en la ob-
servación de la respuesta de genotipos indi-
viduales en la población de plantas ante la
presencia del patógeno. Otras metodologías
plantean el uso de metabolitos producidos
por el patógeno, que en algunos casos han
demostrado tener el mismo efecto que el
microorganismo mismo. Esto último se ob-
serva principalmente cuando las toxinas pro-
ducidas por el hongo son factores de virulen-
cia importantes.
La selección in vitro se basa en exponer
plantas, órganos, tejidos o células vegetales
a patógenos o sus metabolitos simulando la
interacción hospedador-patógeno que tiene
lugar en la naturaleza. Esta técnica permite
estandarizar la evaluación, haciéndola repe-
tible y confiable, con la ventaja adicional de
que en un espacio reducido y en un corto
período se puede chequear la resistencia o
tolerancia de gran cantidad de individuos.
Esto brinda además la posibilidad de poder
ensayar callos y plántulas, sin necesidad de
trabajar con plantas adultas. Presenta, sin
embargo, algunos inconvenientes, tales como
la falta de correlación in vitro-in vivo y la po-
sible aparición de modificaciones genéticas no
deseables originadas por el pasaje por culti-
vo in vitro. No obstante, en algunos casos,
la respuesta obtenida in vitro ha demostra-
do tener una estrecha correlación con la re-
sistencia-tolerancia obtenida in vivo (Yoder,
1980).
Diferentes técnicas in vitro pueden ser
explotadas para seleccionar o inducir varian-
tes con mayor resistencia a enfermedades o
para establecer modelos de estudio de
interacciones planta-patógeno. Sin embargo,
la elección de la estrategia experimental de-
pende del sistema hospedador-patógeno
considerado. Las principales variables a tener
en cuenta son (Daub, 1986):
§ La naturaleza y complejidad de las téc-
nicas de cultivo in vitro requeridas (cultivo de
embriones, regeneración de plantas desde
suspensiones celulares, callos, etc.).
§ El nivel en que se realiza la selección o
«screening» (in vitro o en plantas regenera-
das luego de realizar manipulaciones in vitro)
§ Los agentes utilizados para la selección
de resistencia (el patógeno mismo, filtrados,
toxinas específicas o toxinas de otro patóge-
no muy relacionado, agentes químicos, etc.).
§ El origen de la nueva resistencia busca-
da (recuperación de variación existente, cam-
bios espontáneos, mutagénesis, etc.).
Muchos microorganismos patógenos de
plantas producen fitotoxinas, que son
metabolitos tóxicos, no enzimáticos, que, no
obstante hallarse a bajas concentraciones,
dañan a las plantas (Tabla 1). Una toxina
específica es un metabolito producido por el
patógeno que posee la misma especificidad
por el material vegetal que el patógeno mis-
3. 325Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
mo. En cambio, las toxinas no específicas son
metabolitos producidos por el patógeno que
pueden tener alguna relevancia en el desa-
rrollo de la enfermedad, pero no son respon-
sables de todos los daños causados por el
mismo. Sin embargo, en algunas
interacciones compatibles estas toxinas no
específicas pueden ser necesarias para una
infección exitosa y en otros casos son sólo
determinantes secundarios de la enferme-
dad. El mecanismo responsable de su toxici-
dad varía con el patosistema y, en muchos
de ellos, el(los) rol(es) de las toxinas en la
patogenicidad no está(n) claramente
establecido(s), especialmente en los casos de
toxinas no específicas, como por ejemplo el
ácido fusárico. En general se considera que
actúan como factores de virulencia, debilitan-
do al hospedador o inhibiendo o retardan-
do las respuestas de defensa (Johal, 1995).
Buscando resistencia a toxinas se puede ha-
llar resistencia a patógenos, ya que la toxina
puede tener un rol decisivo en la patogénesis
(McCormick y col., 1998).
En algunas especies de plantas se ha te-
nido éxito en la selección de materiales resis-
tentes a patógenos utilizando toxinas espe-
cíficas como presión de selección in vitro.
Entre las interacciones más estudiadas pode-
mos mencionar el caso de avena-
Cochliobolus victoriae, caña de azúcar-
Drechslera sacchari y plátano-
Mycosphaerella fijiensis.
También se pueden usar toxinas no es-
pecíficas para la selección de materiales re-
sistentes. Muchos patógenos producen es-
tos metabolitos tóxicos
y la resistencia a alguno
de ellos puede mejorar
la resistencia a la enfer-
medad en forma cuali y
cuantitativa. Ejemplos
de selección usando
toxinas no específicas
se encuentran en las
interacciones: arroz-C.
miyabeanus, tomate-
Fusarium oxysporum,
apio-Septoria apiicola,
café-Colletotrichum
kahawae, espárrago-F.
o x y s p o r u m ,
A r a b i d o p s i s - F .
moniliforme, cebolla-Phoma terrestris, en-
tre otras.
Una de las principales limitaciones de este
sistema de selección es precisamente el des-
conocimiento del tipo de toxina(s) o la im-
portancia de ellas en muchas enfermedades.
También es de destacar que en algunas
interacciones donde se conocen toxinas es-
pecíficas, las mismas no son activas en todos
los tejidos y células. Descifrar el fundamento
bioquímico de la resistencia a una toxina fa-
cilitaría el proceso de selección.
Aunque los comentarios anteriores se
aplican fundamentalmente a patógenos
fúngicos, las bacterias también producen
fitotoxinas. En general, estas toxinas son no
específicas y causan síntomas en muchas plan-
tas que no son hospedadores del patógeno
que las produce. Aunque las fitotoxinas
bacterianas son generalmente no requeridas
para la patogénesis, ellas típicamente funcio-
nan como factores de agresividad y su pro-
ducción resulta en un incremento de la seve-
ridad de la enfermedad (Bender, 1998).
Otra alternativa para la selección de ma-
teriales resistentes es usar como presión de
selección enzimas pectolíticas, cuando éstas
cumplen un rol importante en la patogénesis,
como es el caso de los patógenos que pro-
ducen la maceración de los tejidos que ata-
can. Un ejemplo de ello lo constituye la
interacción entre Rhizoctonia fragariae y
Botrytis cinerea con la frutilla, donde se lo-
gró seleccionar plantas con mayor resisten-
cia a los patógenos mencionados utilizando
Tabla 1: Principales toxinas de microorganismos patógenos de plantas
4. 326 ZAPPACOSTA, Diego
enzimas pectolíticas purificadas a partir de
cultivos líquidos de los mismos.
La falta de toxinas relevantes en la pato-
génesis de muchas enfermedades y/o acti-
vas a nivel celular, ha llevado a establecer y
estudiar sistemas in vitro con el patógeno
mismo. Uno de los mayores problemas en
estos sistemas es controlar el crecimiento
excesivo del patógeno, sea bacteria u hon-
go, sobre el material vegetal y sobre el me-
dio de cultivo y la dificultad para interpretar
los resultados. Otro inconveniente es la co-
rrelación entre las interacciones hospedador-
patógeno in vitro e in vivo (la resistencia in
vitro puede no ser expresada in vivo o la si-
tuación recíproca). Un prerrequisito para una
eficiente selección in vitro utilizando al pa-
tógeno es que el sistema in
vitro sea consistente con los
eventos que suceden a nivel
de planta (hay que tener en
cuenta cuáles son los tejidos
susceptibles, el estado fisio-
lógico de la planta, etc.). En
el caso de hongos biótrofos
obligados y en muchos
necrótrofos las técnicas de
cocultivo han resultado ser
una solución para cultivarlos
en condiciones controladas.
El cultivo dual de hongos
necrótrofos y tejidos vegeta-
les puede resultar óptimo
para estudios básicos y apli-
cados, constituyendo un sis-
tema simplificado en el cual
factores nutricionales y am-
bientales pueden ser cuida-
dosamente controlados. Se
ha establecido exitosamen-
te este sistema de cultivo
para las interacciones alfalfa-
P h y t o p h t h o r a
megasperma, tabaco-P.
parasitica var. nicotianae,
t a b a c o - P e r o n o s p o r a
tabacina, caña de azúcar-
Sclerospora sacchari, abe-
to-Ceratocystis polonica y
Lamium purpureum-
Coniothyrium palmarum,
entre otras (Miller, 1985).
3 Obtención de resistencia utilizando
herramientas de ingeniería genética
Una de las alternativas biotecnológicas
más promisorias para obtener resistencia a
enfermedades es la incorporación de genes
de resistencia mediante tecnología génica.
Estas técnicas han sido descriptas previamen-
te (ver III.-3), por lo que en esta sección sólo
se tratarán las situaciones específicas de re-
sistencia a bacterias y hongos patógenos.
Como resultado de los estudios tendien-
tes a la identificación, clonación y caracteri-
zación de genes involucrados en la resisten-
cia a enfermedades han sido identificados
muchos mecanismos que las plantas utilizan
para responder a la infección de patógenos,
Figura 1: Principales mecanismos de defensa que presentan las plantas
frente al ataque de microorganismos (modificado de Kombrink y Somssich,
1995).
5. 327Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
lográndose avances en el conocimiento de
los genes que participan en estas respuestas
(Fig. 1). La identificación de estos genes per-
mitió la evaluación de su rol específico y su
forma de activación mediante el empleo de
plantas transgénicas. Numerosos trabajos
detallan los distintos mecanismos de defen-
sa que las plantas poseen para contrarrestar
el ataque de microorganismos y son reco-
mendados como una lectura accesoria al
material que sigue a continuación (Kombrink
y Somssich, 1995; Durand-Tardif y Pelletier,
2003).
3.1 Resistencia a hongos fitopatógenos
La selección de genes de resistencia para
ser introducidos en plantas por tecnología
génica se basa, en parte, en la evaluación de
la toxicidad de productos génicos sobre el
crecimiento y desarrollo de los patógenos in
vitro y del rol del gen en las respuestas de
resistencia. Muchos productos génicos per-
tenecen al grupo de las proteínas relaciona-
das a la patogénesis (van Loon, 1999), mien-
tras que otras pertenecen a las vías
biosintéticas de las fitoalexinas (compuestos
antimicrobianos de bajo peso molecular pro-
ducto del metabolismo secundario) o forta-
lecen las defensas estructurales (por ejemplo
fortificación de la pared celular). Algunas res-
puestas normales de resistencia son relativa-
mente lentas, detectándose, en algunos ca-
sos la expresión 48 hs luego de la infección
(Fig. 2).
En el caso de plantas transgénicas la idea
sería lograr expresión temprana o
sobreexpresión del producto, general-
mente a través de promotores cons-
titutivos. Otros genes interesantes
son aquellos que participan en las vías
de inducción de los mecanismos na-
turales de resistencia. Recientemen-
te, la clonación de numerosos genes
R (de resistencia) ha precipitado el
interés en el uso de estos genes para
obtener resistencias de amplio espec-
tro.
Las principales estrategias de con-
trol de enfermedades fúngicas me-
diante el uso de plantas transgénicas
pueden ser agrupadas en cinco cate-
gorías (Punja, 2001):
• Expresión de productos
génicos que son directamente tóxi-
cos para los patógenos o que redu-
cen su crecimiento. Incluyen proteí-
nas relacionadas a la patogénesis (pro-
teínas PR), como enzimas hidrolíticas
(quitinasas, 1,3-β-glucanasas), proteí-
nas antifúngicas (osmotinas y tau-
matinas), péptidos antimicrobianos (tioninas,
defensinas, lectinas), proteínas de transfe-
rencia de lípidos (LPT), proteínas inactiva-
doras de riboso-mas 28S rRNA fúngicos (RIP)
y fitoalexinas.
• Expresión de productos génicos que
destruyen o neutralizan componentes de
ataque del patógeno. Por ejemplo:
inhibidores de poligalacturonasas (enzimas
que degradan algunos componentes de la
pared celular vegetal), ácido oxálico o lipasas.
• Expresión de productos génicos que
mejoran las defensas estructurales de la
planta. Consiste en la elevación de los nive-
les de ligninas y peroxidasas asociadas a la
pared celular.
• Expresión de productos génicos que
participan en las vías de señales que regu-
lan las defensas. Incluyen la producción de
Figura 2: Tiempo relativo de inducción de las principales defensas
contra patógenos fúngicos (modificado de Kombrink y Somssich,
1995).
6. 328 ZAPPACOSTA, Diego
elicitores específicos, peróxido de hidrógeno
(H2
O2
), ácido salicílico o etileno.
• Expresión de productos de genes de
resistencia (genes R). Participan en la reac-
ción de hipersensibilidad y en la interacción
con factores de avirulencia.
3.2 Enzimas hidrolíticas
La estrategia más ampliamente utilizada
es la sobreexpresión de enzimas
hidrolíticas tales como 1,3-β-glucanasas o
quitinasas, que degradan la pared celular de
hongos y han demostrado tener actividad
antifúngica in vitro.
Con la expresión de diferentes tipos de
quitinasas en varias especies vegetales se ha
logrado reducir el tamaño, el número y el
desarrollo de lesiones causadas por varios
hongos patógenos, algunos de amplio ran-
go de hospedadores, como por ejemplo
Botrytis cinerea y Rhizoctonia solani. La ex-
presión de quitinasas ha sido inefectiva, sin
embargo, para el control de Cercospora
nicotianae, Colletotrichum lagenarium y
Pythium spp., indicando que en los hongos
existen diferencias en la sensibilidad a este
tipo de enzimas. Las diferentes quitinasas
presentan variación en características tales
como especificidad de sustrato, pH óptimo y
localización celular, lo cual trae aparejadas
diferencias en su actividad antifúngica. Aun-
que los resultados de estos estudios no han
sido espectaculares en términos de niveles de
control de la enfermedad, la tasa de progre-
sión y la severidad de la misma pudieron ser
significativamente reducidas, como se ha
demostrado en cultivos transgénicos evalua-
dos a campo (Melchers y Stuiver, 2000).
Los resultados obtenidos utilizando 1,3-
β-glucanasas son similares a los de
quitinasas. La expresión combinada de am-
bas enzimas en varias especies ha revelado
un comportamiento mucho más efectivo en
la prevención del desarrollo de varias enfer-
medades que la expresión de una sola de
ellas, corroborando los resultados obtenidos
en los ensayos in vitro. Lo mismo sucede con
otras proteínas PR con actividad antifúngica
in vitro, tales como osmotina y taumatina
(TLP), que en plantas transgénicas muestran
una disminución de los daños causados por
enfermedad, pero los resultados más alen-
tadores aparecen cuando se expresan en
combinación con quitinasas y 1,3-b-
glucanasas.
Como regla general, el uso de estrategias
de ingeniería genética que involucren la ex-
presión de dos o más productos de genes
antifúngicos en un determinado cultivo de-
bería proveer un control de la enfermedad
más efectivo y de más amplio espectro que
el uso de estrategias con un solo gen (Shah,
1997).
3.3 Péptidos antimicrobianos
Las defensinas y tioninas son péptidos de
bajo peso molecular, ricos en cisteína, que
poseen actividad antimicrobiana. La
sobreexpresión de estas proteínas en plan-
tas transgénicas reduce el desarrollo de va-
rios patógenos como Fusarium y Alternaria
y confiere resistencia a Verticillium en papa
en condiciones a campo.
También se han desarrollado plantas
transgénicas que expresan pequeños
péptidos antimicrobianos sintéticos (10-20
aminoácidos) que pueden afectar a las hifas,
a la pared celular o aumentar la permeabili-
dad de las membranas celulares fúngicas. La
habilidad para crear recombinantes sintéti-
cos o variantes combinadas de péptidos ofre-
ce nuevas oportunidades para lograr resisten-
cia a un amplio rango de patógenos de ma-
nera simultánea, siendo alternativas
promisorias para mejorar la eficacia de las
plantas transgénicas en el futuro (Lassner y
Bedbrook, 2001).
3.4 Fitoalexinas
Son otro grupo de compuestos
antimicrobianos, productos del metabolismo
secundario, presentes en un amplio rango de
especies vegetales cuya expresión es induci-
da por la infección de patógenos y elicitores.
Son sintetizados a través de complejas vías
bioquímicas, como la del shikimato. La mani-
pulación genética para suprimir o mejorar la
producción de fitoalexinas no es sencilla, ya
que se hallan involucradas varias enzimas.
Como en el caso de las enzimas
hidrolíticas, no se ha demostrado conclu-
yentemente su rol en mejorar la resistencia
a enfermedades en muchas interacciones
7. 329Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
hospedador-patógeno. En plantas transgé-
nicas se ha demostrado que la sobreexpre-
sión de genes que participan en la síntesis
de ciertas fitoalexinas como el resveratrol y
la medicarpina resulta en una demora en el
desarrollo de la enfermedad y en la aparición
de los síntomas producidos por varios
patógenos en distintas especies vegetales.
Sin embargo, hay que tener en cuenta que
las fitoalexinas son potencialmente tóxicas
para los animales y tienden a no ser específi-
cas en su acción, por lo tanto es necesario
realizar más evaluaciones de los riesgos po-
tenciales de su utilización, además de las re-
lacionadas con sus características de conferir
resistencia a enfermedades (Essenberg,
2001).
3.5 Compuestos que mejoran las
defensas estructurales de la planta
La pared celular vegetal es una barrera
que los patógenos tienen que superar en su
ataque y lo logran a través de enzimas que
la degradan (como las poligalacturonasas) o
mediante la acción de toxinas. Se han dise-
ñado plantas transgénicas que expresan
inhibidores de poligalacturonasas, pero los
resultados por el momento no son conclu-
yentes. Otra estrategia considerada ha sido
la sobreexpresión de peroxidasas, enzimas
que participan en la lignificación de la pared
celular. La lignificación alrededor de los sitios
de infección es un mecanismo natural que
presentan las plantas para restringir el ata-
que de patógenos. Mediante esta estrate-
gia se logró un aumento en los niveles de
lignina de la planta, que no brindó, sin em-
bargo, una mejora en la resistencia a enfer-
medades en varios sistemas hospedador-
patógeno estudiados.
Una opción más reciente es la expresión
de enzimas que degradan toxinas fúngicas,
como la expresión en tabaco de una enzima
degradadora de tricotecenosde Fusarium
sporotrichloide, que reduce el daño a los te-
jidos y mejora la emergencia de plántulas en
presencia de la toxina. La inactivación de fac-
tores de virulencia específicos por productos
génicos expresados en plantas transgénicas
es una estrategia promisoria para reducir el
desarrollo de patógenos específicos.
3.6 Elicitores
Las vías de señales que coordinan las res-
puestas de defensa en las plantas, que inclu-
yen la reacción de hipersensibilidad (RH), la
producción de proteínas PR y de fitoalexinas,
pueden ser activadas por moléculas llamadas
elicitores. La inducción de RH y necrosis, que
resulta en la activación de respuestas de de-
fensa, podría resultar en una inducción de
resistencia a un amplio espectro de enferme-
dades. El uso de estas estrategias requeriría,
sin embargo, de la cuidadosa manipulación
de vías metabólicas complejas, cuya altera-
ción podría tener efectos secundarios no
deseables sobre otros caracteres del cultivo,
ya que intervienen en varios procesos vege-
tales. Mediante el uso de plantas
transgénicas se han disectado genéticamen-
te muchas de estas vías, identificándose mu-
chos de los compuestos intervinientes en las
respuestas de defensa a patógenos.
El peróxido de hidrógeno (H2
O2
)inhibe el
crecimiento de patógenos y activa ciertas vías
de trasmisión de señales que inducen res-
puestas de defensa. La expresión de niveles
elevados de H2
O2
en plantas transgénicas a
través de la expresión de la glucosa oxidasa
reduce los efectos causados por patógenos
como Rhizoctonia, Verticillium,
Phytophthora y Alternaria en varias espe-
cies cultivadas. Hay que tener en cuenta, sin
embargo, que niveles elevados de H2
O2
son
fitotóxicos.
Otros activadores de defensas son el áci-
do salicílico, el etileno y el ácido jasmónico.
La manipulación de los niveles de ácido
salicílico en plantas transgénicas tiene un gran
potencial para mejorar la resistencia a enfer-
medades, ya que no sólo inducen la expre-
sión de proteínas PR, sino también la de
otros productos de defensa, los cuales, en
conjunto, han demostrado tener una
interacción sinérgica y conferir elevados nive-
les de resistencia (Lawton, 1997).
3.7 Genes R
Estos genes son los más utilizados en
mejoramiento convencional ya que son de-
terminantes simples de una resistencia efec-
tiva y específica. En su mayoría, los produc-
tos de estos genes actúan reconociendo in-
8. 330 ZAPPACOSTA, Diego
directamente factores de avirulencia de
patógenos a través de correceptores, pero
también hay casos de interacción directa (Fig.
3). Existen varios ejemplos de plantas
transgénicas que expresan genes R; sin em-
bargo, debido a la complejidad de las vías de
señales involucradas en las respuestas de
defensa, es improbable que la expresión de
un solo gen mejore la tolerancia a enferme-
dades. Se dispone de una gran cantidad de
genes R clonados cuyo análisis permitirá la
obtención de genes R sintéticos con domi-
nios funcionales adecuados que confieran
resistencias de amplio espectro (Rommens y
Kishore, 2000).
4 Perspectivas
El desarrollo de plantas transgénicas con
resistencia a enfermedades fúngicas no ha
alcanzado el éxito logrado en el desarrollo
de otras resistencias, como por ejemplo a
herbicidas, insectos o virus. La mayoría de los
estudios se han realizado sobre sistemas
modelo como tabaco, habiendo pocos estu-
dios a campo, estimándose la aparición en el
mercado de materiales transgénicos con re-
sistencia a hongos en los próximos años.
En la mayoría de los casos mencionados
anteriormente, la expresión de los
transgenes ha sido constitutiva, lo cual es
positivo para el control de patógenos que
afectan al mismo tiempo varios ti-
pos de órganos como hojas, tallos
y frutos. Sin embargo, cuando la ac-
ción de los patógenos es específica
de órganos o tejidos es recomenda-
ble el uso de promotores específicos.
En ciertos casos la actividad
antifúngica de determinados com-
puestos mejora cuando actúan en
el espacio apoplástico o son volca-
dos en la vacuola. En este aspecto
es necesario orientar los esfuerzos
hacia la búsqueda de promotores
específicos inducibles por patógenos
y a la evaluación de los sitios más
adecuados de expresión de los
transgenes a fin de desarrollar plan-
tas transgénicas con elevados nive-
les de resistencia a un amplio espec-
tro de enfermedades.
Las expectativas puestas en el
desarrollo de plantas transgénicas son gran-
des, ya que podrían brindar soluciones para
el control de distintas enfermedades, como
las provocadas por patógenos de amplio ran-
go de hospedadotes, entre los que se en-
cuentran Rhizoctonia solani y Botrytis
cinerea, para los cuales existen muy pocas
fuentes convencionales de resistencia.
Las plantas transgénicas expresando re-
sistencia a enfermedades podrían ser cues-
tionadas porque:
§ Los productos génicos antimicrobianos
podrían tener efectos adversos sobre la
microflora no patogénica que habita sobre
o en las inmediaciones de las plantas.
§ Los productos antifúngicos expresados
podrían tener efectos indeseables en la sa-
lud de los organismos que consumen dichas
plantas, en particular el hombre.
§ Una fuerte presión sobre los patógenos
podría llevar a la aparición de nuevas cepas
resistentes y la ruptura de genes de resisten-
cia nuevos o existentes.
§ Algunos productos de genes de resis-
tencia, como las proteínas PR, los compues-
tos antifúngicos y los inhibidores de
poligalacturonasas (PGIP), reducen el desarro-
llo de la enfermedad, pero no la previenen
totalmente.
§ La inducción de muerte celular y de RH
pueden ser peligrosas, ya que si no son co-
Figura 3: Modelos de interacción entre productos de avirulencia
del patógeno (Avr), sitio target de este producto en la célula vegetal
(T) y productos de genes de resistencia R (R1 y R2). (modificado de
Hammond-Kosack y Parker, 2003).
9. 331Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
rrectamente controladas pueden provocar
importantes alteraciones metabólicas.
§ La existencia de un escudo general de
resistencia, que es lo que se busca con nive-
les elevados de resistencia de amplio espec-
tro, puede llevar a la pérdida de genes me-
nores de resistencia en el cultivo y, si un pa-
tógeno logra eludir esta barrera, no existirían
otras para detener su avance.
5 Resistencia a bacterias
Sólo una pequeña proporción de las bac-
terias son fitopatogénicas y han desarrolla-
do mecanismos para invadir y colonizar plan-
tas hospedadoras y causar enfermedades. Por
ello los esfuerzos invertidos en lograr resis-
tencia a bacterias por tecnología génica han
sido escasos. La mayoría de los mismos se han
centrado en una bacteriosis importante en
el ámbito mundial para la cual no se han ha-
llado genes de resistencia potencialmente
transferibles por cruzamientos convenciona-
les, como es el caso de la podredumbre blan-
da y pie negro de la papa, causados por
Erwinia carotovora (During, 1996).
Las principales estrategias para lograr re-
sistencia a bacterias fitopatógenas son las
siguientes:
• Expresión de péptidos bactericidas
(cecropinas) provenientes de insectos y ra-
nas, que actúan a nivel de la membrana
bacteriana.
• Expresión de tioninas, que son
polipéptidos ricos en cisteína presentes en
endosperma y hojas de los cereales, cuya ac-
ción, no específica, se basa en la permea-
bilización de las membranas celulares.
• Expresión de la lisozima del
bacteriófago T4 y de huevo de gallina.
• Cambio de la enzima blanco de toxi-
nas bacterianas o expresión de enzimas
detoxificantes provenientes del mismo pató-
geno u otro organismo.
• Síntesis de fitoalexinas, que general-
mente involucra la modificación de vías
biosintéticas complejas, las cuales no siem-
pre son accesibles a la ingeniería genética.
Los resultados, en algunos casos, han sido
promisorios, aunque la estrategia más inten-
samente investigada, la expresión de
cecropinas, no ha producido resultados con-
cluyentes, especialmente en los ensayos a
campo. Este péptido es degradado por
enzimas vegetales, por lo cual sería necesa-
rio el desarrollo de análogos resistentes a
proteasas.
La expresión de tioninas de cereales en
tabaco mejora la resistencia a Pseudomonas
syringae. Estas proteínas poseen actividad
antimicrobiana in vitro y su expresión cons-
titutiva trae aparejada una disminución sig-
nificativa del crecimiento de la bacteria y una
reducción en el porcentaje de lesiones
necróticas.
Las lisozimas son enzimas que catalizan
la hidrólisis de la mureína, constituyente de
la pared celular bacteriana. Se localizan en las
vacuolas de varias especies vegetales y co-
múnmente poseen fuerte actividad
quitinasa. Antes del inicio de una enferme-
dad las bacterias patógenas se acumulan en
grandes cantidades en los espacios
intercelulares de la planta. Las lisozimas sólo
entran en contacto con las mismas luego de
la ruptura de la célula, cuando las bacterias
son demasiado numerosas como para ser
efectivamente controladas. Por ello, las es-
trategias se han centrado en dirigir las
lisozimas hacia el espacio intercelular. Pocas
lisozimas vegetales han sido caracterizadas y
clonadas, por lo que se han buscado lisozimas
de otros orígenes para ser expresadas en
plantas transgénicas, como la del bacteriófa-
go T4 y la de huevo de gallina. Esta estrate-
gia ha dado buenos resultados en varios ca-
sos y es una de las más prometedoras.
Algunas bacterias producen toxinas que
son clave en el desarrollo de la enfermedad,
como por ejemplo la tabtoxina de
Pseudomonas syringae pv. tabaci, que ac-
túa sobre la síntesis de glutamina, provocan-
do clorosis. La expresión del gen trr que co-
difica para una enzima bacteriana que pro-
tege de la acción de la tabtoxina ha logrado
disminuir los síntomas de la enfermedad, me-
jorando la resistencia. Otra ejemplo es la ex-
presión en plantas de tabaco de ornitil
transcarbamilasas insensibles a la toxina de
P. syringae pv. phaseolicola, que inhibe la
actividad de la misma en poroto.
Los hospedadores resistentes y algunos
no hospedadores son capaces de reconocer
10. 332 ZAPPACOSTA, Diego
y combatir las bacterias fitopatógenas. Estas
plantas resistentes reaccionan con una muer-
te celular localizada en el sitio de infección
(RH), que es inducida por compuestos
bacterianos llamados elicitores, tales como
proteínas de avirulencia (proteínas Avr), que
son reconocidos por proteínas receptoras del
hospedador (Fig. 1). La dilucidación de los
mecanismos de resistencia en hospedadores
resistentes posibilita la obtención de plantas
transgénicas que expresen diferentes recep-
tores que reconozcan una variada gama de
elicitores bacterianos (harpinas, proteínas
Avr, etc.) y que activen las respuestas de de-
fensa.
Varias de las estrategias mencionadas
previamente son potencialmente aplicables
en el control de bacterias fitopatógenas. Las
que implican la expresión de proteínas
antibacterianas, tales como cecropinas y
lisozimas, tienen la ventaja de implicar a un
solo gen y conferir resistencia amplia. La
inactivación de toxinas bacterianas o la mo-
dificación del sitio blanco de dichas toxinas
puede brindar una estrategia mucho más
específica y eficiente.
6 Genómica y enfermedades causadas
por bacterias
En este área también está incursionando
la genómica. Xylella fastidiosa es una bac-
teria que vive en el xilema de las plantas, cau-
sando enfermedades que producen grandes
pérdidas económicas, incluyendo clorosis
variegada en cítricos. Un grupo de
biotecnólogos brasileños seleccionó este pa-
tógeno para secuen-ciación genómica debi-
do a la gran importancia de los cítricos para
la economía de Brasil. Los frutos de las plan-
tas afectadas son más pequeños y no tienen
valor comercial. Utilizando programas de pre-
dicción de secuencias se han encontrado en
el genoma de esta bacteria, que consta de
más de 2.5 millones de pares de bases, unos
2.904 genes. A la mitad de los mismos se les
ha asignado funciones sobre la base de com-
paraciones realizadas con otros genomas. En-
tre estos genes se encuentran algunos que
están involucrados en la patogenicidad, ge-
nerando compuestos que actúan en diferen-
tes procesos, como:
- Proteínas involucradas en la síntesis y
secreción de toxinas.
- Enzimas involucradas en la ruptura de
las paredes celulares.
- Enzimas para detoxificar de compues-
tos de defensa de la planta.
- Transportadores eficientes de azúcares,
que permiten la existencia en el xilema, po-
bre en nutrientes.
- Proteínas regulatorias, que ayudan a
regular la expresión génica para mantener el
crecimiento en distintos ambientes.
- Síntesis y excreción de polisacáridos
extracelulares.
- Genes involucrados en la eliminación de
antibióticos, que podrían se producidos por
la planta para matar a la bacteria.
- Captación y secuestro de hierro y otros
metales.
7 Situación en la Argentina
La Comisión Nacional Asesora de
Biotecnología Agropecuaria (CONABIA) ha
venido autorizando la realización de pruebas
de laboratorio-invernáculo o a campo de
plantas transgénicas que expresan resisten-
cia a enfermedades. Del total de autorizacio-
nes realizadas en el periodo 1998-2002, 39
(aproximadamente el 10%) corresponden a
solicitudes presentadas por distintas empre-
sas o instituciones para la evaluación de dis-
tintos materiales con resistencia a enferme-
dades. En la tabla 2 se presenta una lista de
algunas de las liberaciones autorizadas.
8 Resumen
Los hongos y bacterias fitopatógenos son
responsables de gran parte de las pérdidas
que se producen sobre los cultivos. Una de
las formas de control más eficiente es a tra-
vés de la resistencia genética. Sin embargo,
no siempre es posible incorporar genes de
resistencia en plantas de cultivo por mejora-
miento convencional. La biotecnología brin-
da al mejorador nuevas herramientas para
la búsqueda e incorporación de resistencias
a través del cultivo in vitro y la ingeniería
genética. Mediante el cultivo in vitro es posi-
ble sortear barreras a la hibridización y selec-
cionar rápida y eficientemente materiales
resistentes a enfermedades. La selección in
vitro se basa en exponer plantas, órganos,
tejidos o células vegetales a patógenos o sus
metabolitos simulando la interacción
11. 333Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
hospedador-patógeno que tiene lugar en la
naturaleza. Mediante tecnología génica es
posible transferir genes que confieren resis-
tencia a enfermedades. Las estrategias más
utilizadas son la expresión de compuestos
antimicrobianos (enzimas hidrolíticas, proteí-
nas antimicrobianas), la expresión de enzimas
o compuestos que neutralizan componentes
de ataque del patógeno (inhibidores de
poligalacturonasas, inactivadores de toxinas),
fortalecimiento de las defensas estructurales
(aumento en los niveles de ligninas o
peroxidasas) o la modificación de las vías de
señales que regulan las defensas por la pro-
ducción de elicitores específicos (peróxido de
hidrógeno, ácido salicílico o etileno). La
genómica brinda nuevas herramientas para
la detección de genes involucrados en la
patogénesis y, aunque actualmente no exis-
ten en el mercado plantas transgénicas que
expresen resistencia a enfermedades fúngicas
o bacterianas, el nivel de desarrollo alcanza-
do indica que en un futuro muy próximo apa-
recerán plantas resistentes a enfermedades
logradas por ingeniería genética.
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