1. Trao đổi trực tuyến tại:
http://www.mientayvn.com/Y_online.html
2. TS. BS Đỗ Thị Thanh Thủy
PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION)
NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG
3. MỤC TIÊU BÀI GIẢNG
1. Trình bày được nguyên tắc PCR
2. Trình bày được cách chống ngoại nhiễm
trong PCR
3. Trình bày được ứng dụng của PCR
4. Kary Mullis mô tả 1983 (Cetus Corporation)
1985: Xuất hiện trên tạp chí “Science”
Đạt Nobel Prize hóa học 1993
Polymerase Chain Reaction (PCR) là phản ứng
khuếch đại một đoạn ADN bằng enzym polymerase,
thực hiện trong ống nghiệm, có độ nhạy rất cao.
PCR
POLYMERASE CHAIN REACTION
15. THÀNH PHẦN TRONG PCR
DNA đích
5’ 3’
3’ 5’
primers
A
B Nucleotide tự do
Taq DNA
polymerase
Mg2+
Mg2+
Mg2+
Mg2+
Mg2+
Mg2+
Dd đệm chứa
magnesium
16. NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR
1. DNA đích (đoạn DNA quan tâm)
Từ máu, chất tiết (đàm, dịch màng phổi, dịch khớp…,
tóc, phết niêm mạc má, phết cổ tử cung…), [C] 1 µg
(0,1-1 µg)
Đoạn DNA 1kb đến 10kb (thường <1 kb)
2. Mồi (primers)
đoạn đơn DNA thường có 18-22 nucleotide, bổ xung
với đoạn DNA đích. 5’-ACT TTC ACC AGC GTT TCT GG-3’
Mồi xuôi, mồi ngược (F, R).
Tm (Melting Temperature): 52-58 °C
Tm= 4 x (số C + số G) + 2 x (số A + số T)°C
%GC: 40% đến 60%
Ta: Tm - 5 °C
[C]: 0.1-0.5µM
PCR
MIX
18. 3. DNA polymerase:
enzym chịu nhiệt, xúc tác tổng hợp sợi DNA mới, kỹ
thuật đơn giản, đặc hiệu. [C]: 1-2.5 units
Nhiều loại men chịu nhiệt, tùy mục đích
- Ly trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt:
Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus
thermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent)…
- Tổng hợp bằng công nghệ tái tổ hợp
như Ampli Taq, Vent (exo).
- Tổng hợp men polymerase
chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai
(proofreading) khi tổng hợp chuỗi
nucleic acid bổ sung (3-5 exonuclease)
như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu.
NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR
19. 4. dNTP (deoxy ribonucleotid):
dATP, dGTP, dCTP, dTTP
[C]: 20-200µM
5. Ion Mg++ - cofactor của enzyme
MgCl2: 1.5 mM (0.75-4 mM)
6. Dung dịch đệm
pH 8.3-8.8
NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR
20. THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR
1. Máy luân nhiệt
(THERMOCYCLER)
(I) Thổi liên tục những
luồng khí nóng sinh ra từ
một đèn phát nhiệt vào
buồng ủ, hay luồng khí
lạnh sinh ra từ một dàn
lạnh của máy làm lạnh
(LightCycler – Roche).
21. (II) Dựa theo hiệu ứng
Peltier ngược.
Hai thanh kim loại nối với
hai cực của nguồn điện và
được điều chỉnh tự động
để chiều dòng điện đi qua
có thể thay đổi: bên này
nóng, bên kia lạnh. Khi
thay đổi chiều dòng điện thì
nhiệt độ của hai thanh
cũng thay đổi ngược lại:
bên này lạnh, bên kia nóng
THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR
23. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH PCR
1. Khuếch đại DNA đích
2. Phát hiện sản phẩm PCR (amplicon)
24. PHÁT HIỆN SẢN PHẨM PCR
Điện di trên gel agarose
(submarine agarose gel electrophoresis)
phân loại DNA dựa vào kích thước
1. Trong điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực
dương, đoạn DNA có kích thước ngắn di chuyển nhanh
hơn so với đoạn có kích thước lớn.
2. Trong khi điện di, ethidium bromide sẽ đan xen vào cấu
trúc sợi đôi DNA và làm sợi đôi DNA phát sáng khi quan
sát dưới đèn UV
26. Chuẩn bị mẫu điện di :
– Ống DNA cần điện di (chứa 1 hoặc nhiều đoạn DNA
có kích thước khác nhau)
– Ống chứa thước đo (ladder, marker)
– Ống chứa dd đệm có màu (loading buffer) .
– Chất phát quang (EtBr, SYBR G,…)
PHÁT HIỆN SẢN PHẨM PCR
Loading buffer
Theo dõi sự di chuyển của
các đoạn DNA
Glycerol/buffer giúp kéo các
đoạn DNA lắng xuống đáy
giếng.
31. Nhiễm chéo từ mẫu sang mẫu
Mẫu [-] thành [+]
PCR carry-over (nhiễm từ amplicon)
Mẫu [-] thành [+]
vì nhiễm amplicon (sản phẩm PCR)
Hiểm họa
NGOẠI NHIỄM TRONG PCR
32. UDG
(Uracyl DNAse Glycosylase)
dUTP
PCR
MIX
PCR mix chứa hệ thống
chống ngoại nhiễm
CHỐNG NGOẠI NHIỄM
• Phòng pre-PCR và
post-PCR tách biệt
• Chiếu tia UV khu vực
làm việc.
• Vệ sinh khu làm việc
bằng isopropanol hay
dd tẩy 10%.
1 2
33. PCR luôn khởi đầu 40oC x 10min
CHỐNG NGOẠI NHIỄMUDG
(Uracyl DNAse
Glycosylase)
dUTP
PCR
MIX
hệ thống chống
ngoại nhiễm
PCR mix chứa
dUTP and UDG
40oC for 10min
Amplicon
chứa U
DNA đích
chứa T
U bị UDG
cắt bỏ
DNA đích
chứa T
PCR mix chứa
dUTP và UDG
DNA đích
chứa
THYMINE
Amplicon,
T thay thế U
34. nick
DNA đích không bị
UNG tác động
PCR mix chứa
dUTP and UDG
30X-40X
94oC/30s-1min
55-60oC/30s-1min
72oC/30s-1min
UDG bị bất hoạt do
To cao trong PCR
Amplicon
T thay thế U
CHỐNG NGOẠI NHIỄM
40. RNA
RT (37o C - 40o C/1h)
Reverse
transcriptase
dNTP
Buffer and MnCl2
PCR (30 - 40 cycles)
cDNA
RT SỬ DỤNG RANDOM PRIMER
41. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG PCR
1. Nhiệt độ biến tính và thời gian
2. Nhiệt độ bắt cặp và thiết kế đoạn mồi
3. Độ dài của đoạn mồi
4. Nhiệt độ giai đoạn kéo dài và thời gian
5. Số chu kỳ thực hiện
42. CHÚ Ý TRONG PCR
Khi thực hiện PCR
1. Chứng âm (Negative control)
Không cho DNA (thay bằng nước cất)
Mục đích: Phân biệt có ngoại nhiễm hay
không
2. Chứng dương (Positive control)
Có một lượng DNA đã biết trong phản ứng
Mục đích: Đảm bảo phản ứng tốt
43. ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC
1. Phát hiện và nghiên cứu các tác nhân gây bệnh
2. Chẩn đoán và nghiên cứu các bệnh lí di truyền
3. Chẩn đoán và nghiên cứu một số bệnh ung thư
4. Pháp y, quan hệ huyết thống…
ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC HỌC
1. Sản xuất thuốc
2. Sản xuất vaccin …
44. PCR PHÁT HIỆN
TÁC NHÂN VSV GÂY BỆNH
Bệnh phẩm
Chuẩn bị mẫu
Ly trích acid nucleic acid
PCR
Phát hiện sản phẩm PCR
- Tác nhân không thể nuôi
cấy thường qui
- Tác nhân virus
(HBV, HCV, SXH…)
- Tác nhân vi khuẩn
(Chlamydia, Legionella,…)
- Tác nhân VK nuôi cấy chậm
(M. tuberculosis)
- Tác nhân VK nuôi cấy thất
bại (số lượng ít, hay đã bị
điều trị KS trước đó)
45. ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC HỌC
Sản xuất Insulin
Yếu tố di truyền
ngoài chromosomal
46. One cell with the
recombinant plasmid
A fermentor used to grow
recombinant bacteria.
47. ỨNG DỤNG PCR TRONG PHÁP Y,
QUAN HỆ HUYẾT THỐNG
Short Tandem Repeats (STR)
Các trình tự lập lại ngắn từ 2-5 bp,
dùng để phân biệt DNA profile của
từng người . Sự đa hình trong STR thể
hiện số copy của các đoạn lặp lại khác
nhau trong quần thể.
Ex: locus TH01 có 6 trình tự lập lại “TCAT”.
CCC TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT AAA
- Có hơn 20 alleles chứa TH01 được biết.
- Mỗi người được hưởng 1 allele từ cha hay mẹ
7 repeats
8 repeats
TCAT
