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Manual de métodos generales para determinación de carbohidratos

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MANUAL DE METODOS PARA DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS OFRECE LA AMPLIA VARIEDAD DE LOS METODOS CUALITATIVOS Y CUANTITATIVOS QUE PERMITE NO SOLO IDENTIFICAR SINO CUANTIFICAR LA CANTIDAD EN UN ALIMENTO

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Manual de métodos generales para determinación de carbohidratos

  1. 1. MANUAL DE MÉTODOS GENERALES PARA DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS ELABORADO POR: Leidy Milena Cristancho Cruz Ricardo Alonso Monroy Soler UPTC 2014
  2. 2. P á g i n a | 2 1. INTRODUCCION Los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes vegetales. Son carbohidratos los diferentes azúcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas. Los azúcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacáridos que conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Dada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios métodos para su determinación: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio: Todos los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azúcares en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los azúcares se oxidan formando mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas. Una de las técnicas analíticas más potentes consiste en determinar la cantidad de una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiación absorbida por la misma es conocida como Espectrofotometría Dentro de la bromatologia un apartado escencial son las pruebas analiticas las cuales no son otra cosa que la identificacion y cuantificacion de los diversos carbohidratos presentes en un alimento, pudiendo aprovechar un carbohidrato con fienes industriales o para aseguarar la composicion que un producto alimentario pueda tener; la analitica
  3. 3. P á g i n a | 3 permite entre otras cosas el control del estado de las materias primas o los productos durante todo el proceso de transporte almacenamiento o transformacion. El muestreo de los productos o materias primas hace uso de analisis quimicos e intrumentales que no requieren cantidades grantes de muestra para poder hacer un analisis y determinar su composicion; algunas tecnicas de espectrofotometria tienen un carácter dual, al permitir la identificacion y la cuantificacion de un compuesto de cualquier alimento; los analisis de cualificacion de la molecual de carbohidrato utiliza tecnicas quimicoas de reacciones oxidativas, adicion y demas, con lo que se logra catalogar un carbohidrato
  4. 4. P á g i n a | 4 INDICE 1. INTRODUCCION 2 2. METODOS CUANTITATIVOS 5 2.1 DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS TOTALES POR ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE FENOL-SULFURICO) 5 2.2 DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES POR ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE ACIDO DINITROSALICILICO DNS) 7 2.3 DETERMINACION DE AZUCARES POR EL METODO OPTICO DE POLARIMETRIA 10 2.4 DETERMINACION DE AZUCARES (GLUCOSA, SACAROSA Y FRUCTUOSA) POR HPLC (CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION) 12 2.5 DETERMINACION DE AZUCARES POR ESPECTROSCOPIA POR INFRARROJO CERCANO 17 2.6 ANALISIS DE POLISACARIDOS (DETERMINACION DE FIBRA DIETETICA) 20 3. METODOS CUALITATIVOS 22 3.1 PRUEBA DE MOLISCH 22 3.2 PRUEBA DE BENEDICTO 23 3.3 PRUEBA DE LUGOL 24 3.4 PRUEBA DE BIAL 24 3.5 PRUEBA DE SELIWANOFF 26 3.6 PRUEBA DE BARFOED 27 3.7 PRUEBA DE FEHLING 28 3.8 EZQUEMA DE ANALISIS CUALITATIVO PARA CARBOHIDRATOS 28 4. BIBLIOGRAFIA 29
  5. 5. P á g i n a | 5 2. METODOS CUANTITATIVOS 2.1 DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS TOTALES POR ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE FENOL-SULFURICO) INTRODUCION El metodo por espectrofotometria UV hace referencia al uso de la luz para medir las concentraciones de ciertas sustancias quimicas. Para que este fenomeno pueda llegar a medirse se debe tener presente la concentracion de las especies abosorbentes dado a que esta es proporcional a la absorbancia según la ley de lamber-bee donde: A = e × b × c  A es la absorbancia (magnitud adimensional)  e es un coeficiente de proporcionalidad denominado coeficiente de extinción molar. Indica la absorbancia de una determinada sustancia a una longitud de onda dada y se expresa en M-1 .cm-1.  b es el ancho o espesor de la celda donde se deposita la muestra y se expresa en cm.  c es la concentración expresada en moles / Litro (M) FUNDAMENTO La reaccion de color para medir la concetracion de carbohidratos solubles por espectrofotometria se basa en la utilizacion del metodo colorimetrico de fenol-sulfurico que depende de la deshidratacion de sacaridos derivados de hidrolisados a furfural que transcurre en el proceso de la reaccion. Los derivados del furfural con las formas del fenol coloreado abdorbe la luz en el rango visible a una longitud de onda de 490 nm. Reaccion: FENOL+ H2SO4 (concentrado) + CARBOHIDRATO HMF (amarillo naranja) Para hexosas (hidroximetil furfural) Para pentosas (metil furfural) METODOLOGIA  Preparacion de la muestra A 2 ml de alícuota de una solución de hidratos de carbono se mezcla con 1 ml de solución acuosa al 5% de fenol en un tubo de ensayo. Posteriormente, se añade 5 ml de ácido sulfúrico
  6. 6. P á g i n a | 6 concentrado rápidamente a la mezcla. Luego los tubos de ensayo se dejan en reposo durante 10 min, se agitan durante 30 segundos y se colocan durante 20 min en un baño de agua a temperatura ambiente para el desarrollo de color. El blanco y la solución patrón se preparan conforme al procedimiento anteriormente descrito, utilizando el carbohidrato de interés. Finalmente se lleva a una celda donde se deposita en el espectrofotómetro para programar la longitud de onda a 490 nm y se procede a leer la absorbancia (M. DuBois, K. Gilles, J. Hamilton, P. Rebers y F. Smith, 1956).  Preparacion de la curva patron Se procede a determinar las diferentes concentraciones del carbohidrato partiendo de 0.01 % que indica 0.1 gramos en 1000 ml de agua. Posteriormente se toman alícuotas de 0.1; 0.2; 0.3 y se completa a volumen para 1.0 ml con agua destilada. Por último se añade el fenol y el ácido sulfúrico siguiendo la metodología anterior, para ser leídas en el espectrofotómetro (R. Matissek, F.M. Schnepel y G. Steiner, 1992). Tabla 1: Preparacion de las soluciones patrones para elaborar una curva patron. N° de tubos patrón del azúcar (0.1 g/ 1000 ml) agua (ml) fenol 5% (ml) H2SO4 (ml) Concentración μ/ml Absorbancia 1 0.1 0.9 1.0 5.0 10 μ/ml - 2 0.2 0.8 1.0 5.0 - - 3 0.3 0.7 1.0 5.0 - - 4 0.4 0.6 1.0 5.0 - - 5 0.5 0.5 1.0 5.0 - - 6 0.6 0.4 1.0 5.0 - - 7 0.7 0.3 1.0 5.0 - - 8 0.8 0.2 1.0 5.0 - - blanco 0.9 0.1 1.0 5.0 - - Fuente: Análisis de alimentos. 2da edición, Editorial Acriba S.A Zaragoza España. Se determina la concentración molar del carbohidrato patrón siguiendo la siguiente relación: Entonces: 1000 ml 0.1 gramos de X azúcar 0.1 ml X X= 0.1 x0.1/ 1000 X = 10ug/ml (así determinamos para cada una de las concentraciones del azúcar) RESULTADOS
  7. 7. P á g i n a | 7 Para leer los resultados de la muestra a analizar, es necesario contruir una curva de calibracion o curva patron a diferentes concentraciones con el carbohidrato de interes (disacaridos y monosacaridos) para determinar la absorbancia. Para calibrar el espectrofotometro se procede a ubicar el blanco que se tiene provisto en la celda, ajustandolo al 100% de transmitancia y 0,000 de absorbancia. Una vez obtenida la absorvancia de cada concentracion, se grafica sobre excel o una hoja de papel milimetrado absorvancia vs concentracion de cada solucion preparada. La ecuacion de linealidad que arroje la grafica de la curva patron se tomara como referencia para hallar matematicamente la concentracion del azucar presente en la muestra. Luego se procede a medir la absorbancia de la muestra de interes. Entonces: Se tiene que Y= mx+b (ecuacion de linealidad expresada en la curva patron) Donde Y es la absorbancia del analito m. es la pendiente (valor numerico) que tomo de la ecuacion de linealidad de la curva patron x, es el dato que no conozco b. es el intercepto (valor numerico) que tomo de la ecuacion de linealidad de la curva patron teniendo en cuenta los datos de la ecuacion lineal despejamos X (lo tomamos como concentracion del analito). Como obtenemos la concentracion diluida en ppm se realizan los calculos necesarios para determinar la concentracion en gramos de la muestra analizada en determinado alimento. O de igual manera la absorbancia que obtenemos cuando medimos la muestra se interpola o extrapola en la grafica según el valor arrojado. 2.2 DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES POR ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE ACIDO DINITROSALICILICO DNS) INTRODUCCION Los azucares reductores poseen poseen un grupo carbonilo libre formando un grupo hemiacetal que le confiere la caracteristica de poder reaccionar con otros compuestos. El metodo de miller o DNS (acido dinitrosalicilico como reactivo tiene la capacidad de oxidar los azucares reductores mostrando un comportamiento diferencial hacia mono y disacaridos, dando resultados colorimetricos que se puede medir con una longitud de onda de 575 nm.
  8. 8. P á g i n a | 8 FUNDAMENTO En disolucion alcalina el azucar se hidroliza produciendo un compuesto que se reduce a un grupo nitro del DNS, para dar el producto monoamino correspondiente. Esta reaccion da un producto colorido en solucion alcalina (SOUTHGATE, D.A.T, 1991). La reaccion que se lleva a cabo es la siguiente: Imagen 1: Reaccion de reduccion del Acido dinitrosalicilico. Fuente: Nielsen, 2003 METODOLOGIA  Preparacion del reactivo DNS Se prepara según el metodo propuesto por Coughlan y Moloney. Se añade 10 g de ácido dinitrosalicílico (DNS) y 300 g de tartrato de sodio y potasio (sal de Rochelle) a 800 ml de NaOH 0,5 N y se calienta suavemente para disolver los reactivos. El volumen se completa hasta 1,0 L con agua destilada (MP Coughlan, AP Moloney, 1988).  Preparacion de la curva patron Se implementa el mismo metodo para realizar la curva patron, como se describio en el metodo fenol-sulfurico. Emplendo una solucion patron de glucosa con una concentracion de 1.0 g/L, para la cual se disuelve 0.1 gramos de glucosa en 90 ml de agua y se lleva a volumen a 100 ml. Esta solucion patron se prepara a difentes concentraciones adicionando a cada tubo 1 ml del reactivo
  9. 9. P á g i n a | 9 de DNS con agitacion constante. Posteriormente se lleva a baño maria durante 15 minutos se deja enfriar y se añade agua destilada hasta completar el volumen respectivo. Se determina la absorbancia de cada tubo a 575 nm en el espectrofotometro UV.  Preparacion de la muestra Se toma 1 ml de la solucion acuosa de la muestra, enseguida se adiciona 1ml del reactivo de DNS y se calienta por 15 minutos en baño maria. Se deja enfriar y se diluyen con 10 ml de agua destilada. Se procede a leer la absorbancia junto con el blanco a la misma longitud de onda que las muestras para la curva patron. RESULTADOS para realizar la curva patron se grafica concentracion en ppm de la glucosa vs absorbancia de las muestras diluidas a diferentes concentraciones. Imagen 2. Cruva patron por Espectrofotometria. Fuente: Determinación de azucares reductores por la técnica de Miller. https://es.scribd.com/doc/56421369/DETERMINACION-DE-AZUCARES-REDUCTORES-POR-LA-TECNICA-DE-MILLER Para determinar la concetracion de azucares reductores en la muestra se aplica el mismo metodo matematico (con el fenol-sulfirico) utilizando la ecuacion lineal de la curva patron. Tambien se puede emplear una curva de calibracion para azucares reductores como la celobiosa u otro tipo de azucar para determinar su respectiva absorbancia y asi su concentracion.
  10. 10. P á g i n a | 10 2.3 DETERMINACION DE AZUCARES POR EL METODO OPTICO DE POLARIMETRIA INTRODUCCION La polarimetria es una tecnica no destructiva basada en la medicion de la rotacion optica producida sobre un haz de luz polarizada al pasar por una sustancia opticamente activa. La actividad optica rotatoria de una sustancia tiene su origen en la asimetria estructural de los atomos de carbono, nitrogeno, fosforo o azufre en la molecula, lo cual es conocido como quiralidad. La quiralidad se describe como la imagen en un espejo de una molecula la cual no puede suporponerse sobre ella misma. FUNDAMENTO Se coloca un tubo de muestra que contiene un liquido en solucion, entre dos elementos polarizantes. El primer elemento (polarizador) polariza la luz antes de que esta pase a traves de la muestra. El segundo elemento (analizador) puede girarse para contrarrestar cualquier rotacion por la muestra y por tanto, localiza la posicion angular resultante del plano de la luz, y por tanto la cantidad de rotacion causada por la muestra, donde se expresa en grados angulares. En la industria del azucar la rotacion se expresa sobre una escala diferente que se denota como °Z. A continuacion un esquema de polarizacion de una muestra de azucar en solucion. Imagen 3. Dsitribucion de la luz en polarimetria. Fuente: https://es.scribd.com/doc/89862717/Analisis-polarimetrico.
  11. 11. P á g i n a | 11 Cada sustancia opticamente activa tiene su rotacion especifica, determinada por la siguiente ecuacion: [α] (t,λ) = α (t,λ) / c I Donde: [α] =rotacion especifica a una determinada sustancia α =rotacion optica (viene determinada por la estructura) c= concentracion I = paso optico a traves de la muestra t= temperatura λ=longitud de onda Imagen 4.Esquema de un polarimetro Fuente: TECNICAÑA., Manual de laboratorio para el análisis azucarero Tecnicaña. 1986. 1 - Entrada de luz de Na 2 - Lente de iluminación 3 - Filtro de luz 4 - Polarizador
  12. 12. P á g i n a | 12 5 - Placa 6 - Cilindro conteniendo la solución a medir 7 - Analizador 8 - Objetivo para el enfoque 9 - Ocular para visualización. 10 - Lupa 11 - Panel de lectura 12 - Tornillo para la escala METODOLOGIA Se toman 13 gramos de azucar y se disuelven en 40 ml de agua en un vaso precipitado en constante agitacion, luego se traspasa a un matraz y se enraza a 50 ml con agua destilada. Posteriormente se verte el contenido a un erlenmeyer y se añade 5 ml acido concentrado. Se pone a baño maria de 7 a 15 minutos. Se deja enfriar la solucion y se procede a agregarla en el tubo polarimetrico hasta llenarlo completamente (CHEN C. P, James, 1996). Se registra la lectura del polarimetro una vez se estabiliza. RESULTADOS Se determina la concentracion del azucar según la ecuacion y el angulo de rotacion, junto con la temperatura al momento de la lectura con el equipo: [α] (t,λ) = α (t,λ) / c I la concentracion del azucar se expresa en gramos/ 100 ml de solucion. 2.4 DETERMINACION DE AZUCARES (GLUCOSA, SACAROSA Y FRUCTUOSA) POR HPLC (CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION) INTRODUCCION La HPLC o cromatografia liquida de alta resolucion es una tecnica cromatografica usada para separar componentes de una muestra que se fraccionan entre una fase movil liquida y una fase estacionaria solida compuesta por particulas muy finas contenidas en una columna, y donde se utiliza una presion muy elevada para forzar el paso del disolvente a traves de ella, consiguiendo asi separaciones de gran resolucion, permitiendo su identificacion y cuantificacion. La cromatografía líquida de alta resolución tiene ventajas en el análisis de los azúcares debido a su
  13. 13. P á g i n a | 13 gran solubilidad en agua y su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles (Chicharro, Manuel 2007). FUNDAMENTO La muestra se introduce en pequeños volumenes a la corriente de la fase movil bombeada con alta presion a una columna rellena de fase estacionaria y alli el analito se retarda preparandose por medio de interacciones quimicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna. El retardo se conoce como tiempo de retencion, unico para cada analito. Para la separacion de carbohidratos como sacarosa, glucosa y fructosa se utiliza una columna de separacion rellena de una resina de intercambio cationico con base calcica, que exhiben propiedades como intercambio de ligandos y exclusion por tamaños. La muestra diluida es previamente filtrada para la inyección en la columna, dependiendo de la geometría de los hidroxilos de los diferentes azúcares, estos interactúan con los cationes de la resina por afinidad, variando gradualmente los resultados de los tiempos de elución de las diferentes especies. El método se aplica a moléculas de bajo peso molecular relativo, que puedan entrar en los poros de la resina y establecer enlaces temporales con los iones contrarios. Las moléculas largas no entran fácilmente en los poros y ellas eluyen con mayor rapidez. La estimación exacta de la altura de pico para un azúcar se obtiene por un sistema de integración electrónico que luego lo relaciona al obtenido por un estándar (Herrera,Ana C 2011). MATERIALES Y EQUIPOS  Cromatógrafo líquido de alta resolución con detector de índice de refracción WATERS I.  Inyector de la muestra automático  Bomba isocrática de alta presión para HPLC  Columna rellena de resina de intercambio con base cálcica, con tamaño de partícula de 10 – 15 μm, longitud 250-300m (Sugar Pack I).  Calentador de columna para 90 ºC  Integrador electrónico  Instrumentos de filtración (Filtros de jeringa de 25 a 50 mm de diámetro en conjunto con membranas de filtración de 0.45 μm,)  Balanza analítica de precisión de ± 0.1 mg  Viales Reactivos  Sacarosa Grado analítico  Glucosa Grado analítico  Fructosa Grado analítico
  14. 14. P á g i n a | 14  EDTA (Cálcico) Grado analítico METODOLOGIA  Preparacion de la fase movil Se preparan 1000 ml de solución de EDTA (Sal Cálcica) de 50 ppm, se filtra por membrana de 0.45 μm y se desgasifica.  Preparacion de estandares de calibracion externos Se preparan 100 ml de soluciones para los estándares indicados en la tabla 1, registrando el peso exacto utilizado en la preparación Tabla 2. Concentraciones de estandares de calibración externos para HPLC Analito de calibracion Concentracion (ppm) Sacarosa 5 Glucosa 0.5 Fructosa 0.5  Preparacion de la muestra Se pesa aproximadamente de 0,75 g a 1.0 g de melaza de caña, registrando el peso exacto de la muestra, que se transfiere cuantitativamente a un matraz volumétrico de 100 ml y se diluye 100 ml y se homogeniza. La solución se filtra por una membrana de 0.45 μm provista de un prefiltro Sepak.  Condiciones para la operación de HPLC Velocidad de la Fase móvil : 0.5 a 0.6 ml/min en elución isocrática Presión ≤ 1300 psi Temperatura de 80 a 85 ºC Volumen de inyección de muestras 20 μL RESULTADOS Tres parametros instrumentales que afectan la sensibilidad son: la temperatura del detector, presion del gas de nebulizacion y la ganancia. La temperatura del detector se estudia a un intervalo de 40-60 °C. una temperatura de 45 es suficiente para permitir la evaporacion completa
  15. 15. P á g i n a | 15 del disolvente y por lo tanto dando un ruido insignificante. Una velocidad de flujo (presión) del sistema del aire a 3 bar y una ganancia de 5 proporcionaron una buena sensibilidad y una adecuada relación señal-ruido (Luciana C. Nogueira 2005).  Cálculos Cálculo del Porcentaje Sacarosa, Fructosa y Glucosa por HPLC El integrador suministra porcentajes de áreas y alturas con su correspondiente tiempo de retención que se relacionan con las áreas de los estándares de calibración externos de Sacarosa, Glucosa y Fructosa, con las áreas de los picos cercanos a los tiempos de retención. Cálculo del porcentaje de Sacarosa en la muestra Se toma el área de la sacarosa correspondiente a un tiempo de elución de aproximadamente 7.53 minutos y se calcula el Factor de Respuesta (FR). Donde: Area = Dada por el integrador para el estándar de Calibración de Sacarosa Concentración = Gramos exactos de Sacarosa Pesados Para hallar el % de sacarosa: % sacarosa= Area de la muestra a 7. 53 min x 100% FR x concentracion muestra Cálculo del porcentaje de Glucosa en la muestra Se procede igual que para el cálculo de la Sacarosa, teniendo en cuenta que el tiempo de elución de la glucosa es en aproximadamente 9.52 min. Se toma el área de la Glucosa correspondiente a un tiempo de elución de aproximadamente 9.52 minutos y se calcula el Factor de Respuesta (FR). Donde: Area = Dada por el integrador para el estándar de Calibración de Glucosa Concentración = Gramos exactos de Glucosa Pesados Para hallar el % de glucosa: % glucosa = Area de la muestra a 9.52 min x 100% FR x concentracion muestra
  16. 16. P á g i n a | 16 Cálculo del porcentaje de Fructosa en la muestra Se procede igual que para el cálculo del porcentaje de Sacarosa y glucosa, se identifica el área de la fructosa correspondiente a un tiempo de elución de aproximadamente 11.17 min y para el calculo el Factor de Respuesta (FR). Donde: Area = Dada por el integrador para el estándar de Calibración de fructosa Concentración = Gramos exactos de fructosa Pesados Para hallar el % de fructosa: % fructosa = Area de la muestra a 11.17 min x 100% FR x concentracion muestra Imagen 5. Muestra un cromatograma típico para la separación de los cinco hidratos de carbono utilizados en el proceso de optimización. Fuente: Journal of Chromatography A, Volume 1065, Issue 2, 2005, 207 – 210. (1) La fructosa (t R 8,76 min), (2) la glucosa (t R 9,71 min), (3) la maltosa (t R 15,45 min), (4) maltotriosa (t R 22,21 min), (5) maltotetraosa (t R 29,41 min). La concentración de los estándares en la mezcla fue de 2 g / L
  17. 17. P á g i n a | 17 La figura anterior representa el método estándar externo que se usa generalmente para calibrar el sistema cromatográfico para la cuantificación de hidratos de carbono. Para ello, las soluciones estándar azúcares con diferentes concentraciones (0,05-5,0 g / L para la fructosa, 0,05-5,0 g / L para la glucosa, 0,05 a 15,0 g / l de maltosa, 0,05 a 10,0 g / L para maltotriosa, y 0.05- Se utilizaron 5,0 g / L para la maltotetraosa), de acuerdo a la concentración de la muestra en el alimento Y. (Wei, MI Ding J. Chromatogr. A, 904 (2000)) 2.5 DETERMINACION DE AZUCARES POR ESPECTROSCOPIA POR INFRARROJO CERCANO INTRODUCCION La espectroscopia por infrarrojo cercano (NIRS) es una metodología instrumental que ha presentado un desarrollo creciente en los últimos años en la industria azucarera mundial. Se la utiliza tanto en centros de investigación como en diversas industrias, por ser una técnica no destructiva, rápida, que no emplea reactivos químicos y que requiere menos mano de obra que los métodos tradicionales empleados en el laboratorio. La espectroscopia estudia la interacción de la radiación electromagnética con la materia. NIRS comprende el segmento de luz de longitudes de ondas entre 800 y 2600 nm del espectro electromagnético y analiza la absorción de energía en dicha región por los grupos funcionales de las moléculas de la muestra (ZOSSI, Silvia; RUIZ, Roberto M 2010). FUNDAMENTO La espectroscopia IR se fundamenta en la absorción de la radiación IR por las moléculas en vibración. Una molécula absorberá la energía de un haz de luz infrarroja cuando dicha energía incidente sea igual a la necesaria para que se dé una transición vibracional de la molécula. Es decir, la molécula comienza a vibrar de una determinada manera gracias a la energía que se le suministra mediante luz infrarroja. Pueden distinguirse dos categorías básicas de vibraciones: de tensión y de flexión. Las vibraciones de tensión son cambios en la distancia interatómica a lo largo del eje del enlace entre dos átomos. Las vibraciones de flexión están originadas por cambios en el ángulo que forman dos enlaces. En principio, cada molécula presenta un espectro IR característico (huella dactilar), debido a que todas las moléculas (excepto las especies diatómicas homonucleares como O2 y Br2) tienen algunas vibraciones que, al activarse, provocan la absorción de una determinada longitud de onda en la zona del espectro electromagnético correspondiente al infrarrojo. En la zona del espectro electromagnético IR con longitudes de onda del infrarrojo medio (entre 4000 y 1300 cm-1) se suelen observar una serie de bandas de absorción provocadas por las vibraciones entre únicamente dos átomos de la molécula. Estas vibraciones derivan de grupos que contienen hidrógeno o de grupos con dobles o triples enlaces aislados. (Nakamoto K., 1997).
  18. 18. P á g i n a | 18 Tabla 3. Intervalo de frecuencia de las bandas como medidas estándar Intervalo de frecuencia (cm-1) Enlace Tipo de vibración 3600-3200 O-H Tensión 3500-3200 N-H Tensión 3000-2800 C-H Tensión 1600-1700 O-H Flexión 1640-1550 N-H Flexión 1400-1200 C-H Flexión 1350-1000 C-N Flexión 900-800 As-O Tensión (simétrica) 700-750 As-O Tensión (anti-simétrica) 500-400 As-O Flexión Fuente: Rubinson K.A., Rubinson J.F., “Análisis Instrumental”, Ed. Pearson Educación, 2000 METODOLOGIA  Preparación de muestras liquidas Para medir disoluciones diluidas de muestras sólidas y liquidas disueltas en disolventes transparente al IR, se utiliza un tipo especial de celda. Los disolventes más utilizados para este tipo de muestras son el CCl4 para la región 4000-1330 cm-1 y el CS2 para la región 1330-625 cm -1. Ambos disolventes son bastante tóxicos por lo que deben manejarse con precaución o sustituirse con n-hexano o n-heptano. La preparación de disoluciones es un paso importante en los estudios por IR. Disolver muestras sólidas, reducir la viscosidad de líquidos y sobre todo, diluir la muestra para así poder usar caminos ópticos más largos y reproducibles en el análisis cuantitativo. Típicamente se analizan disoluciones de una concentración de 0,05 % a 10% en células de 0,1 a 1 mm de espesor. Una combinación práctica puede ser un 10 % de concentración y un camino óptico de 0,1 mm. Puesto que se necesitan volúmenes pequeños de muestra, se suele utilizar el método gravimétrico en su preparación (B. Stuart John Wiley & Sons 2004).  Preparación de muestras solidas Generalmente las muestras sólidas se debe pulverizar hasta que el tamaño de sus partículas sea menor que la longitud de onda de la radiación (<2 μm) para evitar los efectos de la dispersión de la misma. Una de las técnicas más populares es la formación de pastillas de KBr (también se han usado otros haluros de metales alcalinos). Las sales de haluros tienen la propiedad de flujo en frío (cold flow), por lo que, cuando se somete a la presión adecuada este material finamente pulverizado, sinteriza y forma una tableta transparente que se asemeja a un cristal. Al usar
  19. 19. P á g i n a | 19 esta técnica, se mezcla a fondo un miligramo o menos de la muestra finamente pulverizada, con aproximadamente 100-300 mg de polvo de KBr. La mezcla se puede realizar con un mortero y su mano o en un pequeño molino de bolas. Posteriormente se presiona la mezcla en un troquel especial entre 700 y 1000 kg/cm2 hasta obtener un disco transparente. Se obtienen mejores resultados si el disco se prepara a vacío para eliminar el aire ocluido. A continuación, el disco se coloca en la trayectoria del haz del instrumento para su examen espectroscópico. Los espectros obtenidos presentan a menudo bandas a 3450 y 1640 cm-1 debidas a la humedad absorbida. Imagen 6. Troquel para fabricar discos uniforme con reproducibilidad  Análisis cuantitativo Para el análisis cuantitativo en el caso del IR se utiliza la cantidad de radiación electromagnética absorbida, y el parámetro a medir es el cociente entre la intensidad de la radiación (de una longitud de onda determinada) antes y después de atravesar la muestra. La ley de Beer describe la relación entre esta magnitud determinada experimentalmente y la concentración: A = -log (I/Io) = a · b · c Donde b es el espesor de la celda que atraviesa la radiación y a, la absortividad molar, es una constante para cada sustancia a una longitud de onda. Esta relación de proporcionalidad directa motiva que sea la absorbancia la magnitud utilizada en estudios cuantitativos, mientras que la transmitancia se prefiere en los estudios cualitativos. Así pues, una representación de la absorbancia frente a la concentración debe ser lineal con una pendiente ab y debe pasar por el origen. Para analizar una disolución de concentración desconocida se deben preparar disoluciones patrón, elegir una banda adecuada, medir la absorbancia a esa longitud de onda y dibujar una
  20. 20. P á g i n a | 20 recta de calibrado. La concentración de la muestra problema se hallará en esta recta de calibrado a partir del dato experimental de absorbancia medido en el aparato (Nakamoto, k. 2004). RESULTADOS Para los compuestos carbonilicos, como aldehídos, cetonas, ácidos carboxílicos y sus derivados, el grupo funcional principal en los carbohidratos es el que absorbe con una alta intensidad en la región del infrarrojo en la zona de 1850- 1650 cm-1. Estas vibraciones generalmente por alargamiento de este grupo específicamente. Imagen 7. Representación del espectro de la molécula de glucosa Fuente: Mc.Murry J. Química Orgánica, quinta edición .Thomson Editores México 2000). Los picos que identifican cada banda en el espectro se relaciona a la longitud de onda entre los enlaces de la molécula. Así tenemos enlace C-C, C-H etc. 2.6 ANALISIS DE POLISACARIDOS (DETERMINACION DE FIBRA DIETETICA) INTRODUCCION La fibra dietética se define como los polisacáridos y lignina que no son digeridos por enzimas humanas (Lee y Prosky, 1995). Los métodos (AOAC 985.29, 993.21, Horwitz, 2005) se fundamentan en aislar la fracción de interés con la precipitación selectiva y después determinar su peso. Una muestra gelatinizada de alimento seco, desengrasado se digiere enzimáticamente con alfa-amilasa, amiloglucosida y proteasa para hidrolizar el almidón y la proteína. El contenido total
  21. 21. P á g i n a | 21 de la fibra de la muestra se determina agregando etanol al 95% a la solución para precipitar toda la fibra. La solución entonces se filtra, se recupera, se seca y se pesa, el residuo se reporta como fibra. (Prosky et al, 1984, Prosky et al, 1985) FUNDAMENTO Muestras en duplicado de alimentos secos y desgrasados son gelatinizados con a – amilasa térmicamente estable y luego digerida enzimáticamente con proteasa y amiloglucosidasa para remover la proteína y el almidón. La fibra dietética soluble es precipitada por la adición de etanol, el residuo total se filtra, se lava, se seca y se pesa. En el residuo en duplicado se determina proteína, y en el otro cenizas (Official Methods of Analysis. A.O.A.C 1990). Fibra dietética total = Peso del residuo - Peso (proteína + cenizas). METODOLOGIA Correr un blanco a lo largo de toda la determinación. Pesar por 1g de muestra (exactitud de 0.1g) en matraces de 500 mL. El peso de las muestras no debe diferir en más de 20 mg. Adicionar 50 mL de buffer de fosfatos 0.08M pH 6 0, Medir pH y ajustar a pH 6± 0.2 si es necesario. Adicionar 0.1 mL de la solución de amilasa y cubrir el matraz con papel aluminio, colocar el matraz en un baño a ebullición durante 15 min. Agitar suavemente cada 5 minutos. Verificar con termómetro que los matraces mantengan 95-100°C durante 15 minutos. Enfriar a temperatura ambiente Ajustar a pH 7.5± 0.2 adicionando 10 mL de NaOH 0.275N, agregar 5 mg de proteasa (disolver 50 mg de proteasa en 1mL de buffer de fosfatos. Adicionar 0.1mL de la solución a cada matraz). Cubrir el matraz con papel aluminio y colocarlos en un baño a 60°C por 30 minutos con agitación continua. Enfriar a temperatura ambiente, adicionar 10 mL de HCL 0.325N. Ajustar el pH a 4.0- 4.6, adicionar 0.1mL de amiloglucosidasa, incubar a 60°C por 30 minutos con agitación continua. Adicionar 280 mL de etanol 95% precalentado a 60°C (medir el volumen antes de calentar). Dejar en reposo 1 h. Pesar el crisol conteniendo la celita, humedecer y redistribuir la cama de celita con etanol 78%. Aplicar succión. Mantener la succión y cuantitativamente transferir el precipitado de la digestión enzimática. Lavar el residuo con 3 porciones de 20 mL de etanol 78%, lavar con 2 porciones de 10 mL de etanol 95%, lavar con 2 porciones de 10 mL de acetona, si se forma una forma una goma, mover con la espátula para mejorar la filtración Secar el crisol conteniendo el residuo toda la noche a 70°C
  22. 22. P á g i n a | 22 Enfriar en desecador y pesar Restar el peso del crisol con la celita para conocer el peso del residuo RESULTADOS Cálculo de fibra dietética total: % FDT = [ (masa del residuo - P - C - B)/ masa de la muestra)] x 100 Donde: - m = masa de la muestra = promedio de la masa de 2 muestras (mg). - m1 = masa del residuo = promedio de las masas de las muestras determinadas en duplicado (mg). - P y C = masa (mg) de proteína y cenizas, respectivamente en los residuos de las muestras. Informar el % de fibra al 0,1 %, sobre la base de la muestra original considerando que ha sido desgrasada en el caso de contener más de 10 % de grasa. 3. METODOS CUALITATIVOS 3.1 PRUEBA DE MOLISCH Es la prueba específica para determinar la presencia de carbohidratos en una muestra, al deshidratar el glúcido (monosacáridos-alta reacción y disacáridos, polisacáridos-baja reacción) forma Furfural; este al reaccionar con α-Naftol produce un complejo de color morado (Condensación del Furfual) (Quesada, 2007; Amalesh, Et.Al., 2006). Imagen 8. Reacción química en la Prueba de Molisch. Fuente: Fuente: Harper College (n.d.).
  23. 23. P á g i n a | 23 Método: se colocan 1-2 mililitros (ml) de una solución “muestra” en un tubo de ensayo, se añaden dos gotas de reactivo de Molisch (una solución de α-napthol en etanol al 95%). se vierte luego lentamente por la pared del tubo (Quesada, 2007) 1-2 ml de ácido sulfúrico concentrado de (Harpercollege, n.d.). Resultados: la formación de una capa intermedia de color Purpura es indicativo de la presencia de furfural (Glúcido deshidratado) condensados; el tiempo que demore la reacción es indicativo del número de carbonos que tenga el glúcido, así, una pentosa (5c) tiene una alta reacción y por el contrario una hexosa (6c) tiene una baja reacción (Harpercollege, n.d.). 3.2 PRUEBA DE BENEDICTO Cuando un carbohidrato posee en su estructura un grupo carbonilo libre (C=O) esta reducirá el reactivo de Benedicto por oxidación con los iones cobre en una solución de pH alcalino y la acción del calor (Punto de ebullición); y formara acido carboxílico; al reaccionar se puede denominar como azúcar reductor (Sakuta, n.d.). Imagen 9. Reacción de Oxidación del cobre en presencia del glúcido-reductor Fuente: Fuente: Harper College (n.d.). Método: Coloque 2-5 ml de solución de Benedicto en un tubo de ensayo pequeño y el calor en un baño de agua hirviendo suavemente durante 2-3 minutos. Añadir 10 gotas de la solución de hidratos de carbono a ensayar, mezclar bien, y colocan de nuevo en el baño de agua hirviendo durante 5 minutos adicionales (Universidad Nacional, n.d.; Firdouse y Alam, 2011). Un cambio de color de azul a verde a rojo ladrillo amarillo y finalmente (Cu2O) indica que el hidrato de carbono es un azúcar reductor. La velocidad de reacción es muy importante. La fructosa reacciona muy rápidamente, glucosa y galactosa más lentamente. Incluso el almidón y la celulosa darán resultados débiles si la solución se calienta ampliamente (UNIVERSIDAD NACIONAL, n.d.). Resultados: la reacción positiva es una coloración que va desde verde, amarillo, naranja y rojizo, el grado de coloración y el tono radica en la concentración de cobre oxidado (Cu2O); esta reacción indica que es un azúcar reducido.
  24. 24. P á g i n a | 24 3.3 PRUEBA DE LUGOL La interacción del yodo o yodo potásico con el almidón forma coloraciones azules oscuras, debido a la ocupación de los espacios libres del glúcido, este es un glúcido alterado, al cual, sus propiedades físicas son modificadas, como la no absorción lumínica Método: se toman 2 ml de la solución de muestra, se colocan en un tubo de ensayo; se agrega dos gotas de lugol y 1 ml de agua (HARPER COLLEGE, n.d.); o agregar 1 ml de reactivo para un peso de muestra de 100 mgr (Girish, Et.Al., 2009). Resultados: la formación de un complejo azul oscuro, debido a la adhesión del colorante a la molécula de azúcar. Imagen 10. Resultados negativos de la prueba de Lugol Fuente: HARPER COLLEGE, n.d. Imagen 11. Resultado positivo de la prueba de Lugol Fuente: HARPER COLLEGE, n.d. 3.4 PRUEBA DE BIAL Esta prueba detecta las pentosas. El reactivo deshidrata las pentosas formando furfural (derivados de las pentosas). Estos derivados de las pentosas además reaccionan con orcinol y los
  25. 25. P á g i n a | 25 iones de hierro presentes en el test reactivo, generan productos de color azul (HARPER COLLEGE, n.d.). Imagen 12. Reacción de deshidratación y formación de furfural. Fuente: Fuente: Harper College (n.d.). Método: tomar dos ml o 1-2 gotas (Mahesh, Murugesh y Mohana, 2006) de una muestra de solución y colocarla en un tubo. Tomar dos ml del reactivo de Bial (solución de orcinol, HCl y cloruro férrico) y adicionarlo en el tubo. Entonces calentar la solución lentamente con un mechero Bunsen o en baño de María (HARPER COLLEGE, n.d.). Se debe calentar a 60 º C durante 10 minutos (Díaz, Jorrín y Bárcena). Resultados: es positivo si se observa un derivado azulado. Otros colores indican negativo (ver imagen 13). Las hexosas generalmente producen un resultado de color verde, rojo o café (HARPER COLLEGE, n.d.). Imagen 13. Resultados negativos de la prueba de Bial Fuente: HARPER COLLEGE, n.d. Imagen 14. Resultado positivo de la prueba de Bial Fuente: HARPER COLLEGE, n.d.
  26. 26. P á g i n a | 26 3.5 PRUEBA DE SELIWANOFF Esta prueba detecta cetosas (hexosas). En el test se provoca una reacción de deshidratación de cetohexosas para formar 5 hidroximetilfurfural. La formar 5 hidroximetilfurfural además reacciona con el resorcinol presente en el test (HARPER COLLEGE, n.d.). Imagen 15. Reacción de deshidratación de Cetohexosas Fuente: Fuente: Harper College (n.d.). Metodo: tomar 0.5-2 ml (CRUZADO, GUTIERREZ y RUIZ, 2007) de muestra de solución y colocarla en un tubo. Tomar 1-2 ml del reactivo de Seliwanoff (solución de resorcinol y HCl) y adicionarlo. Calentar la solución en un baño de Maria por dos minutos (HARPER COLLEGE, n.d.) o llevar la muestra son reactivo a ebullición y luego adicionar el reactivo y observar (CRUZADO, GUTIERREZ y RUIZ, 2007). Resultados: Un producto rojo indica un resultado positivo; debido a la formacion de 5 hidroximetilfurfural, reaccionando junto con el resorcinol. Imagen 16. Resultado positivo de la prueba de Seliwanoff Fuente: HARPER COLLEGE, n.d. Imagen 17. Resultado negativo de la prueba de Seliwanoff Fuente: HARPER COLLEGE, n.d.
  27. 27. P á g i n a | 27 3.6 PRUEBA DE BARFOED Se utiliza para detectar monosacaridos reductores en disolución. Los monosacaridos reductores son oxidados por el ion de cobre, formandose ácido carboxilico y una precipitacion rojiza de ion cobre. Los disacaridos reductores tiene la misma reacción pero lo hacen mas lento (HARPER COLLEGE, n.d.). Imagen 18. Reacción de oxidación y formación de ácidos carboxílicos. Fuente: Fuente: Harper College (n.d.). Metodo. Tomar 1 ml de la solución y colocarla en un tubo. adicionar 1-3 ml del reactivo de Barfoed (Danmalam, Et. Al., 2009) (solución de acetato cúprico y ácido acético) y adicionarla. Calentar la solucion al baño de maria durante tres minutos (HARPER COLLEGE, n.d.). Resultados: la formacion de precipitaciones rojizas dentro de los tres minutos indican un resultado positivo (HARPER COLLEGE, n.d.). Imagen 19. Resultado positivo de la prueba de Barfoed Fuente: HARPER COLLEGE, n.d. Imagen 20. Resultado negativo de la prueba de Barfoed Fuente: HARPER COLLEGE, n.d.
  28. 28. P á g i n a | 28 3.7 PRUEBA DE FEHLING La prueba hace reduce el cobre (Cu++) por oxidacion con los todos los azucares reductores, siempre que este en medio alcalino con una presencia de tartrato de sodio y potasio para permitir la estabilizacion del cobre (De, Dey y Ghosh, 2010); (ver imagen 9). Metodo: se llevan las dos fracciones del reactivo a un tubo de enzayo; la fraccion A es el sulfato de cobre 7% disuelto en agua y la fraccion B es el Tartrato de potacio 35% y hidroxido de sodio 10% diluidos en agua, una vez completado el reactivo (A:1-2ml+B:1-2ml) (UNIVERSIDAD DE LA LAGUNA, n.d.) se mescla bien y se adicionan 1-5 ml del la muestra al tubo de enzayo y se lleva al baño de maria por 5 minutos (Danmalam, Et. Al., 2009) Resultado: la reaccion positiva forma un presipitado de color rojo ladrillo por la oxidacion del cobre (reduccion). Imagen 21. Coloracion positiva (derecha) y negativa (Izquierda) de Fehling. Fuente: University of Oregon (n.d.) 3.8 EZQUEMA DE ANALISIS CUALITATIVO PARA CARBOHIDRATOS La secuencia de analisi cualitativo a carbohidratos en cadena e identifica las cualidades de los carbohidratos analisados, una vez es terminado el esquema puede ser determinadas algunas propiedades y estrcutura de varios glucidos. Imagen 22. Ezquema de analisis a carbohidratos.
  29. 29. P á g i n a | 29 Fuente: Fuente: Harper College (n.d.). 4. BIBLIOGRAFIA 1. AMALESH, Asamanta; Et.Al. (2006). Gum Odina-A New Tablet Binder. En: Trends in Applied Sciences Research. Vol 1, N° 4. P. 310 2. B. Stuart John Wiley & Sons. Infrared Spectroscopy: Fundamentals and Applications, Ed 2004. 3. .CHEN C. P, James. Manual del azúcar de caña: para fabricantes de la caña de azúcar y químicos especializados. México: editorial Limusa 1996. P 1203.ISBN 0-471866504. Disponible en http://repositorio.utp.edu.co/dspace/bitstream/11059/2085/1/6641227H565.pdf.
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