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PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2016-1)

Aula ministrada durante a disciplina de Biologia Molecular de Microrganismos, no Programa de Pós-Graduação em Microbiologia da Universidade Federal de Minas Gerais.

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PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2016-1)

  1. 1. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Biologia Molecular de Micro-organismos (MIC842) ICB/UFMG PCR quantitativa Teoria e Aplicações Lucas Secchim Ribeiro Laboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  2. 2. SumárioSumário • PCR  Histórico  Teoria  Aplicações • Desenho de primers • qPCR  Metodologias  Cálculos  Aplicações  PCR Digital                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  3. 3. DogmaDogma central da Biologia Molecularcentral da Biologia Molecular Dogma central da Biologia Molecular • Francis Crick / 1956                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  4. 4. PCRPCR                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  5. 5. PCRPCR                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  6. 6. PCRPCR PCRPCR                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  7. 7. PCRPCR PCR - Polymerase Chain Reaction Pipetar Chorar Repetir                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  8. 8. PCRPCR Funções da PCR • Distinguir uma sequência-alvo específica de uma grande quantidade de background; • Amplificação de cópias de uma sequência específica a partir de pequenas quantidades do DNA modelo.                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  9. 9. PCRPCR convencionalconvencional Aplicações da PCR “convencional” • Diagnóstico • Avaliação de mutações • Detecção de patógenos (bactérias, fungos, vírus, protozoários) • Tipagem para transplantes - MHC • Testes forenses • Paternidade • Investigações criminais • Sequenciamento e clonagem • Epidemiologia molecular e bioinformática • Análise de OGM • ...                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  10. 10. PCR “convencional” Reagentes básicos PCRPCR Iniciadores senso/antissenso (primers forward/reverse) Cátions (Na+ /K+  e Mg2+ ) DNA polimerase com DNA modelo Deoxinucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  11. 11. Importância do tampão e íon potássio na PCR • pH 8,3  pH 7,2 a 72º C • Tris/ Tris-Cl • Função enzimática da DNA polimerase • K+ • Reduz a repulsão entre DNA/DNA e DNA/primer através da neutralização de cargas negativas. ↑ [K+ ] para fragmentos pequenos ↓ [K+ ] para fragmentos grandes PCRPCR convencionalconvencional                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  12. 12. Importância dos dNTPs e íon magnésio na PCR • Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs) • Associados ao DNA na forma de dNMPs • Sequestradores de Mg2+ • Mg2+ • Cofator da DNA polimerase • Especificidade e eficiência da enzima • Estabiliza ligação de dNTP/dNMP e primers à fita de DNA (↑ Tm) • Rendimento x Concentração crítica e empírica ↑ [Mg2+ ]  ↑eficiência ↓especificidade PCRPCR convencionalconvencional                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  13. 13. PCRPCR convencionalconvencional                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  14. 14. Função e relevância dos primers • Polinucleotídeos sintéticos de fita simples, de sequência complementar e flanqueadora à fita molde, com a extremidade 3´-OH livre PCRPCR convencionalconvencional                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  15. 15. DNA polimerase termorresistente • Antigamente: adição de enzima a cada novo ciclo • Taq DNA Polimerase • Dependente de cátions bivalentes (Mg2+ > Mn2+ >>>Ca2+ ) • Inibição por agentes quelantes (EDTA, citrato) Thermus aquaticusParque Nacional de Yellowstone / EUA PCRPCR convencionalconvencional                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  16. 16. DNA molde • Qualidade • Cuidado com resíduos de processos de extração • SDS (dodecil sulfato de sódio) • Fenol • Corantes (subprodutos de PCR) • Heparina/EDTA/Citrato • Polissacarídeos vegetais/carragenina • Poliestireno/polipropileno expostos à radiação UV • Quantidade • Excesso de DNA é prejudicial • Aumento de reação inespecífica PCRPCR convencionalconvencional                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  17. 17. PCRPCR convencionalconvencional                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  18. 18. Parâmetros de termociclagem • Temperatura de anelamento ↑ Tanelamento  ↑estringência ↓produtos inespecíficos ↓ Tanelamento  ↑rendimento ↑ produtos inespecíficos • Tempo de extensão • DNA Polimerase: 35 – 100 nt por segundo a 72º C • Ideal: entre 30 segundos e 1 minuto • Excesso  Atividade de exonuclase 5´-3´ PCRPCR convencionalconvencional                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  19. 19. Aditivos • Separação de fitas com alto conteúdo G:C • Estruturas secundárias fortes • Betaína (1 M) • DMSO (1-10%) • Formamida (1-10%) • Agentes estabilizantes da DNA polimerase • Redução da adesão de reagentes ao tubo • BSA (0,1 mg/mL) • Gelatina (0,1 – 1,0%) • Detergentes não-iônicos (<0,5%) PCRPCR convencionalconvencional                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  20. 20. Inibidores • Derivados das próprias amostras ou do método de extração/purificação do ácido nucléico; • Fenol/álcoois • EDTA • Debris celular • Detergentes PCRPCR convencionalconvencional                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  21. 21. PCRPCR convencionalconvencional                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  22. 22. PCRPCR convencionalconvencional                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  23. 23. PCRPCR convencionalconvencional Fonte: Koch WH, 2004. Nature Reviews Drug Discovery 3, 749-761 (Sep 2004)                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  24. 24. PCRPCR convencionalconvencional Visualização dos resultados • Separação por peso molecular: eletroforese • Corantes/marcação fluorescente                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  25. 25. Visualização dos resultados • Sequenciamento capilar • Dideoxinucleotídeos PCRPCR convencionalconvencional                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  26. 26. PCRPCR convencionalconvencional Antes da PCR... • Clonagem!                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  27. 27. PCRPCR convencionalconvencional Antes dos termocicladores... • Banho-maria!                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  28. 28. Desenho deDesenho de primersprimers Desenho deDesenho de primersprimers                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  29. 29. Desenho deDesenho de primersprimers Características de bons primers • Tamanho adequado • 15 a 25 pares de bases • Tamanho x Temperatura de dissociação • Temperatura adequada de dissociação (Tm) • Conteúdo G:C • Diferença entre primers < 5º C • Concentração de cátions em solução                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  30. 30. Características de bons primers • Tamanho do fragmento a ser gerado • Tempo de extensão da polimerase • Especificidade  Primers específicos x degenerados Desenho deDesenho de primersprimers                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  31. 31. Características de maus primers • Inter-complementariedade • Formação de dímeros (primer dimer) • Atenção à extremidade 3´ Desenho deDesenho de primersprimers                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  32. 32. Características de maus primers • Auto-complementariedade • Formação de auto-dímeros e hairpins • ΔG (energia livre) > -9,0 kcal/mol Desenho deDesenho de primersprimers                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  33. 33. Desenho deDesenho de primersprimers                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  34. 34. Características de bons primers • Adequação para qPCR • Tamanho do amplicon • Junção exon-exon e contaminação com gDNA Desenho deDesenho de primersprimers                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  35. 35. Desenho deDesenho de primersprimers Ferramentas online de suporte • Primer-BLAST www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ • Primer3 bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3 • IDT Oligo Analyzer 3.1 www.idtdna.com/calc/analyzer • UCSC PCR in silico genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start • RT Primer DB (específico para qPCR) • medgen.ugent.be/rtprimerdb                         Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  36. 36. Problema detectado Desenho deDesenho de primersprimers Workflow para desenho de primers Verificar • Temp. de anelamento • Temp. de dissociação • Tamanho do amplicon • Estruturas secundárias • Complementaridade • EspecificidadeNãoSim PCR para confirmação de funcionamento PCR para confirmação de funcionamento GenBank/NCBI Encontrar sequência da região desejada Encontrar sequência da região desejada PrimerBLAST Primer3, etc Desenhar primersDesenhar primers Registrar e arquivar resultados obtidos Registrar e arquivar resultados obtidos Reação adequada OK?OK? CHECAR PRIMERS!CHECAR PRIMERS!                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  37. 37. PCRPCR quantitativaquantitativa PCRPCR quantitativaquantitativa                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  38. 38. PCRPCR quantitativaquantitativa PCR quantitativa • Nomenclatura • qRT-PCR • qPCR • Real-time PCR • Análise de End-point                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  39. 39. PCRPCR quantitativaquantitativa Ensaios químicos disponíveis • SYBR Green I • Ensaio para 5´-nuclease (TaqMan) • Molecular Beacons • LightCycler • LUX Detecção de fluorescência! ↑ sensibilidade                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  40. 40. PCRPCR quantitativaquantitativa SYBR Green I • Corante específico para DNA de fita dupla • Flourescência aumenta ao longo da reação • Não tem ação inibitória • Detecta produtos inespecíficos SYBR Green I Brometo de etídio                         Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  41. 41. PCRPCR quantitativaquantitativa Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan • Atividade 5´-nucleásica da Taq DNA Polimerase • Altamente específica, sem produtos espúrios • Duas marcações simultâneas são possíveis • Tecnologia baseada em FRET • Flourescence Resonance Energy Transfer                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  42. 42. PCRPCR quantitativaquantitativa FRET - Transferência de energia por ressonância fluorescente • Fenômeno quântico entre duas moléculas muito próximas (10 – 100 Å), com bloqueio da emissão de luz • Fluoróforo x Quencher (bloqueador) • Sobreposição do λ de absorção e emissão                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  43. 43. PCRPCR quantitativaquantitativaPCRPCR quantitativaquantitativa Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  44. 44. PCRPCR quantitativaquantitativa                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  45. 45. PCRPCR quantitativaquantitativa Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan • Discriminação alélica                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  46. 46. PCRPCR quantitativaquantitativa Conceitos importantes • Fases exponencial, logarítmica e plateau • Threshold • Baseline • Cycle threshold (CT) Ciclos Flourescência (ouprodutosdePCR) Plateau Linear Exponencial Threshold                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  47. 47. PCRPCR quantitativaquantitativa Ciclos 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Amostra A 3 6 12 24 48 96 192 384 768 1536 3072 Amostra B 15 30 60 120 240 480 960 1920 3840 7680 15360 ↑ CT ↓ Qtde. inicial↑ CT ↓ Qtde. inicial ~7,05 ~9,38 Quantidade inicial CT Amostra A 3 9,38 Amostra B 15 7,05                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  48. 48. PCRPCR quantitativaquantitativa Conceitos importantes • Quantidade inicial de amostra • Relação CT x Quantidade inicial                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  49. 49. PCRPCR quantitativaquantitativa Conceitos importantes • Eficiência 2n = cópias em n ciclos Eficiência teórica= 100%                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  50. 50. PCRPCR quantitativaquantitativa Conceitos importantes • Eficiência Qtde. inicial de DNA 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  51. 51. Log 10 da qtde. inicial 0 1 2 3 4 5 6 7 8 CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1 PCRPCR quantitativaquantitativa Conceitos importantes • Eficiência                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  52. 52. E = 10(-1/slope) -1 PCRPCR quantitativaquantitativa Conceitos importantes • Eficiência Eficiência 100% = 2n a cada ciclo = log 2 x Para um aumento de 10x = log 2 10 = 3,32 Slope (inclinação)                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  53. 53. PCRPCR quantitativaquantitativa Conceitos importantes • Curva-padrão e blank sample • Gene de referência/constitutivo/normalizador • Gene de interesse Controle Infectado GAPDH IFN-γ Relação GAPDH IFN-γ Relação Amostra 1 20 20 1 5 40 8,0 Amostra 2 30 40 1,33 5 20 4,0 Amostra 3 60 80 1,33 10 50 5,0 Amostra 4 50 60 1,2 15 80 5,33 Amostra 5 40 50 1,25 10 60 6,0 Média + EPM 1,22 + 0,06 Média + EPM 5,66 + 0,67                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  54. 54. Conceitos importantes • Curva de dissociação (Curva de melting) • Indica a temperatura em que 50% dos primers estão anelados; • Ligação específica do corante à fita dupla PCRPCR quantitativaquantitativa                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  55. 55. PCRPCR quantitativaquantitativa Conceitos importantes • Curva de dissociação (Curva de melting) • Diretamente relacionada ao conteúdo G:C • Pode apontar amplificação inespecífica e dímeros de primers                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  56. 56. Conceitos importantes • Curva de dissociação (Curva de melting) • Importante para distinção de amplicons/primers em protocolos multiplex PCRPCR quantitativaquantitativa                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  57. 57. PCRPCR quantitativaquantitativa Fatores que afetam a eficiência da qPCR • DNA degradado • Produtos inespecíficos • Tamanho do amplicon • Condições de termociclagem • Prática laboratorial inadequada • Reagentes contaminados • Primers mal desenhados • Diluições mal feitas • Falta de calibração e manutenção • Pipetagem errada!                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  58. 58. PCRPCR quantitativaquantitativa Funções da PCR quantitativa • Quantificação absoluta • Curvas-padrão • Quantidade conhecida de “cópias por volume” • Semelhante a um ELISA • Exemplos: carga viral, 16S bacteriano • Avaliação relativa • Ausência de curva-padrão • Gene de referência para normalização • Apresentada em aumento/redução em relação a um controle experimental • Exemplo: expressão gênica                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  59. 59. CÁLCULOS E ANÁLISES CÁLCULOS E ANÁLISES Verificar dispersão entre replicatas biológicas e técnicas Verificar dispersão entre replicatas biológicas e técnicas Checar controles positivos (curva-padrão) e negativos (blank) Checar controles positivos (curva-padrão) e negativos (blank) Conferir curvas de dissociação (Tm)Conferir curvas de dissociação (Tm) Verificar ajuste do thresholdVerificar ajuste do threshold PCRPCR quantitativaquantitativa Análise de resultados Avaliar as curvas de amplificaçãoAvaliar as curvas de amplificação                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  60. 60. PCRPCR quantitativaquantitativa Cálculos em qPCR – Quantificação absoluta • Regressão linear simples • Método PfafflMétodo Pfaffl  Curva de cópias (plasmídeos)Curva de cópias (plasmídeos)                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  61. 61. PCRPCR quantitativaquantitativa Cálculos em qPCR – Quantificação relativa • Relação matemática entre a expressão dos genes de referência e os de interesse; • Amostras controle (não tratadas) e estimuladas • Método LivakMétodo Livak  22--ΔΔΔΔCTCT                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  62. 62. Cálculos em qPCR – Quantificação relativa • Avaliada a conformidade de todos os outros parâmetros, a única informação útil será o CT • Exemplo: Controle Infectado GAPDH IFN-γ GAPDH IFN-γ Amostra 1 15,1 32,5 14,9 29,4 Amostra 2 15,4 33,1 15,5 29,1 Amostra 3 16,0 32,8 15,1 28,8 Amostra 4 18,1 31,5 15,8 29,9 Amostra 5 15,7 32,0 15,5 28,9 PCRPCR quantitativaquantitativa                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  63. 63. PCRPCR quantitativaquantitativa GAPDH IFN-γ Amostra 1 15,1 32,5 17,4 1,08 0,47 Amostra 2 15,4 33,1 17,7 1,38 0,38 Amostra 3 16 32,8 16,8 0,48 0,72 Amostra 4 18,1 31,5 13,4 -2,92 7,57 Amostra 5 15,7 32 16,3 -0,02 1,01 GAPDH IFN-γ Amostra 1 14,9 29,4 14,5 - -1,82 3,53 Amostra 2 15,5 29,1 13,6 - -2,72 6,59 Amostra 3 15,1 28,8 13,7 - -2,62 6,15 Amostra 4 15,8 29,9 14,1 - -2,22 4,66 Amostra 5 15,5 28,9 13,4 - -2,92 7,57 Controle Infectado ΔCT ΔΔCT 2 -ΔΔCT ΔCT Média ΔCT 16,32 Média ΔCT ΔΔCT 2 -ΔΔCT 0                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  64. 64. PCRPCR quantitativaquantitativa                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  65. 65. DicasDicas Extração e manuseio de ácidos nucléicos • RNA = extremamente lábil! • Extração e armazenamento correto • Dosagem e normalização das amostras • A260/280 e A260/230 > 1,8 • Contaminação com DNA genômico Confecção de cDNA • Normalizar a mesma quantidade (p.e. 1 µg) de RNA para todas as amostras; • Todo o procedimento deve ser realizado no gelo; • Evitar ciclos de congelamento/descongelamento.                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  66. 66. Escolha do gene de referência • É necessário ter opções! • Ex.: 18S, GAPDH, RPL4, HPRT para camundongo • Diferentes estímulos/tecidos/tratamentos podem ter a expressão do gene constitutivo alterada; •Preparar um pool com amostras-controle • 6 diluições em triplicata • Diferença entre o CT mínimo e máximo < 1,0 •Algoritmos gratuitos na internet! • Ref Finder: Cotton EST Database • NormFinder: macro para Excel DicasDicas                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  67. 67. PCRPCR quantitativaquantitativa Antes da qPCR... • Northern Blotting (RNA) • Southern Blotting (DNA)                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  68. 68. PCRPCR digitaldigital PCRPCR digitaldigital                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  69. 69. PCRPCR digitaldigital PCR digital (dPCR) Baseada na compartimentalização da amostra • Gotículas (droplets) em emulsão = microfluidos • Chips com nanopoços Individualização das moléculas! Distribuição de Poisson Aplicações • Quantificação absoluta sem curva-padrão • Expressão gênica • Detecção de alelos raros e/ou mutações • Discriminação de baixas diferenças para CNV                         Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  70. 70. PCRPCR digitaldigital Sample DNA Target                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  71. 71. PCRPCR digitaldigital Fonte: Baker M, 2012. Nature Methods 9, 541 (Jun 2012)                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  72. 72. http://www.gene-quantification.de/ DicasDicas                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  73. 73. DicasDicas                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  74. 74. DicasDicas                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  75. 75. DicasDicas                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  76. 76. PCRPCR O que é importante saber? • Teoria e suas diferenças entre as técnicas • Vantagens e desvantagens de cada uma • Como aplicar a PCR ao seu projeto • Aplicações gerais e específicas • Boas práticas laboratoriais                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro
  77. 77. Lucas Secchim Ribeiro Dpto. Microbiologia Laboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro Sala C4 191 – Ramal 2735 secchimribeiro@gmail.com Aula disponível pelo endereço http://bit.do/qPCR-UFMG2016                          Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.  2016 © Lucas Secchim Ribeiro

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