Continuación de la primera parte. Métodos de amplificación de ácidos nucleicos, detección, visualización,

1. BIOLOGIA MOLECULAR PARA
PROFESIONALES DE LA SALUD II
Luz Esmeralda Murcia Urrego
Bacterióloga Esp. Administración en salud

2. Retomando…
•
•
•
•
•
•
•
Estructura celular, organelos y funciones.
Estructura del ADN y ARN.
Replicación .
Transcripción.
Traducción.
Postraducción.
Técnicas: electroforésis y PCR.

3. Pendientes
• Telómeros. Telomerasa, ARN.
Diskeratosis congénita, síndromes mielodisplásicos, histiocitosis.
Neuroblastoma.

4. Pendientes
• ADN ribosomal ADNr.
Secuencia de ADN contenida en los
cromosomas del núcleolo que
codifica ARN ribosomal, muy utilizado en
estudios filogenéticos por su bajo
porlimorfismo genético.

5. MUTACIONES MOLECULARES
• Silenciosas
• Neutra
• Cambio de sentido o
missense (cancer
colorectal)
• Sin sentido o non sense
(Talasemia)
• Adición deleción o
frame shift (Fibrosis
quistica)
• AGG x CGG (Arg)
• AAA x AGA (Lys – Arg)
• UCA x UUA (Ser – Leu)
• AGA x STOP
• AGA TCT AGG GAA
• AGA TCC TAG GGA AT…
• AGA TTA GGG AAT

6. Programas para biomodelos
• Jmol, Chime, RasMol.
• http://www.biorom.uma.es/contenido/bi
omodel/model1j/dna/inicio.htm

7. AMPLIFICACION DE ACIDOS
NUCLEICOS

8. Clonado ADN
•
•
-
- ADN
- Vector (plásmido)
Ligación (ADN ligasa)
Inserción (Transformación o
transfección).
- Propagación (selección, miniprep)
- Purificación

9. AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS IN VITRO
• Amplificación del ADN diana. Reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), la
autorreplicación de la secuencia (3SR) y la
amplificación por desplazamiento de la hebra
(SDA).
• Amplificación de la sonda, que incluye la
replicasa Qß o la reacción en cadena de la
ligasa (LCR).
• Amplificación de la señal, en los cuales la señal
generada por cada sonda es aumentada.

10. Variaciones de la PCR RT-PCR
• RT-PCR
http://www.biorom.uma.es/contenido/U
IB/pcresp/index.html
• Q-PCR
http://www.youtube.com/watch?v=e74Y
YdSHraY

11. Variaciones de la PCR
PCR
DESCRIPCCION
PCR anidada
A partir de un amplicón se aplican nuevos
primes. Aumenta la sensibilidad.
PCR de extensión solapada
Cambios de secuencia introducidos dentro de
fragmentos (clonados) de ADN. 4 primers con
productos de ADN mutado solapados.
PCR in situ
En portaobjetos sobre tejido o células. Se hace
amplificación del ADN e hibridación in situ.
PCR múltiple
Amplificación simultánea de más de una
secuencia.
RT-PCR
ARN es el molde inicial y la enzima es
transcriptasa inversa que forma cADN.
Q -PCR
Cuantifica ADN o ARN en tiempo real. Se
detecta basándose en fluorocromos o sondas.
Otras
e-PCR, AFLP, Colonia, Asimétrica, Específica de
alelo, Hot start, ISSR, Touchdown, Tail, MLPA,
Inversa.

13. VISUALIZACION DEL AMPLIFICADO

14. VISUALIZACION DEL AMPLIFICADO
• Electroforésis de
agarosa.
• Southern blot

15. VISUALIZACION DEL AMPLIFICADO
• Hibridación en micro placas de ELISA.

17. Amplificación isotérmica
de ácidos nucleicos
LAMP
“Sistema que utiliza una polimerasa
con alta actividad de desplazamiento
de cadena (Bst) y un sistema de dos
cebadores internos y dos cebadores
externos para reconocer un total de
seis secuencias distintas en el ADN
blanco”
-producción material inicial
-Ciclos de amplificación y elongación.
-Reciclaje.

19. LAMP

20. Detección por bioluminiscencia

21. OTRAS
• NASBA (Nucleic Acid Sequence Based
Amplification) 3SR.

22. SECUENCIACION DE ACIDOS
NUCLEICOS

23. SECUENCIACION
• Determinación de la
secuencia de nucleótidos
de una molécula
específica.
• -Método químico
• -Método enzimático
• Detección de
mutaciones, aplicaciones
forenses, ADN fósiles,
diagnóstico de
enfermedades.

24. SECUENCIACION
• Di-deoxi-nucleótidos
• http://www.youtube.com/watch?v=fNIG
2KROxYA
• Pirosecuenciación
• http://www.youtube.com/watch?v=a0qB
RjwGAbE

25. REFERENCIAS ADICIONALES
•
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/PCR/Aplicaciones-PCRAmplificacion%20de%20acidos%20nucleicos%20in%20vitro.pdf
•
http://www.fiiaiafp.com/neo_2012/pdf/presentaciones/Sesion%20Paralela%208%20Los
%20peligros%20en%20alimentacion/Deteccion%20Molecular%20de%20p
atogenos%20por%20amplificacion%20isotermica%20Alejandro%20Rojas.
pdf
•
http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S071610182002000100003&script=sci_arttext