D na invest-criminal-pcr-electroforese(dnafinferprint)
1. DNA e a Investigação criminal DNA Detecção da Sequência Alu (TPA-25) num dos intrões de um alelo do gene “tissueplasminogeneactivactor” (TPA) Técnica de PCR (PolimeraseChainReaction) Electroforese – Dnafingerprinting
2. 3. Replicação da informação genética 2. Localização, natureza química e estrutura 1. Ácidos nucleicos 4. Extracção de DNA 5.4. Conclusão 5. DNA e a identificação de suspeitos 5.3. Comparação de resultados 5.2. Electroforese (DNA finger printing ) 5.1. Técnica de PCR Os conteúdos ... DNA
12. Actividade PráticaExtracção de DNA de células do epitélio bucal Procedimentos 1- Preparar uma solução salina muito concentrada. 2- Colocar 20 ml dessa solução salina na boca e bochechar vigorosamente durante 2 minutos. 3- Colocar o obtido em 2 num copo e filtrar em seguida. 4- Marcar duas linhas num tubo de ensaio, uma ao meio do tubo e outra perto do bordo. 5- Transferir o filtrado para um tubo de ensaio até à primeira linha. 6- Adicionar, cuidadosamente, isopropanol até à segunda linha. 7- Observar com atenção e registar. Materiais: - Copo - Funil - Papel de filtro - Palitos Reagentes: - Água - Sal - Isopropanol
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14. Alguns sites com animações ... DNA - experiência de Hershey e Chase http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio21.swf DNA – Experiência de Meselson e Stahl http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio22.swf DNA – Replicação 1 http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swf DNA – Replicação 2 http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swf Síntese proteica http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120077/micro06.swf Síntese proteica – Célula procariótica/Eucariótica http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120077/bio25.swf Ciclo celular http://nobelprize.org/educational_games/medicine/2001/cellcycle.html Animações em Biologia celular http://www.johnkyrk.com/index.pt.html
15. O DNA e a identificação de suspeitos……DNA fingerprinting(amplificação da sequência Alu)
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18. Recolha do DNA dos eventuais suspeitos e vítima.
19. Amplificação do DNA pela técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction) .
20. Electroforese em gel de agarose (separação de fragmentos de DNA).
21. Comparação dos resultados obtidos (DNA fingerprinting).
26. (constrói uma nova cadeia de DNA por emparelhamento com a cadeia progenitora durante a replicação do DNA).
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28. Magnésio.Esta enzima é chamada de Taq polimerase, por ter sido originalmente extraída da bactéria Thermus aquaticus, que vive em águas vulcânicas cuja temperatura se situa perto da ebulição, sendo, por isso, estável e funcional a altas temperaturas). ?
29. PCR e suas aplicações Aplica-se em situações onde a quantidade de DNA disponível é reduzida. Alguns exemplos … 1 – Medicina forense (pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime . como pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pele ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada numa impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de DNA fingerprinting). 2 - Detecção de patogenes 3 - Sexagem de organismos 4 - Análise de populações 5 - Clonagem do DNA 6 - Análise de expressão de genes e proteínas 7 - Organismos geneticamente modificados
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31. A Taqpolimerase, para começar a construir a nova cadeia de DNA, tem que se ligar a um fragmento de cadeia dupla que possua uma extremidade 3’-OH livre.- Os cientistas usam primers específicos que irão ligar-se a sequências que flanqueiam a porção de DNA que lhes interessa amplificar. A temperatura utilizada é geralmente de 55°C e o processo dura entre 30-60 segundos.
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34. ELECTROFORESE (DNA fingerprinting) Consiste na migração de moléculas carregadas electricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas num gel através da aplicação de uma corrente eléctrica.
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36. DNA satélite:marcadores de variabilidade genética Verde: minissatélite Alu - DNAs satélites são sequências no DNA, que se repetem sucessivamente, e não parecem codificar proteínas essenciais. - Possuem a capacidade de “saltar”, ou de se copiarem, para outros locais do genoma, com grande frequência ao longo das gerações. - Longas repetições destas sequências estão espalhadas por todo o genoma humano (>30%), ocupando regiões de tamanhos variáveis. Mesmo no interior de intrões de genes!
37. Elemento Alu - Tamanho ~ 300 pb. - Distribuído por todo o genoma nos primatas. - 500-2000 cópias no genoma humano (alguns inseridos nos últimos mil anos). Uma cópia de Alu, denominada TPA-25, encontra-se com frequência num dos intrões de um alelo do gene “tissueplasminogeneactivactor” (TPA): Gene TPA (s/ Alu) primer primer intrão exão exão Gene TPA (c/ Alu) primer Alu TPA-25 primer Para detectar a sua presença, vamos amplificar (PCR) este intrão do gene TPA: Se contiver o TPA-25, os fragmentos de DNA serão mais longos (400pb), caso contrário serão mais curtos (100 pb).
38. Genótipos possíveis para a presença ou ausência do Alu TPA-25 900pb Marcador de peso molecular - conjunto de fragmentos de peso molecular conhecido, que servem de termo de comparação em relação à amostra. Assim, é possível estimar o tamanho dos fragmentos de DNA a analisar, comparando a distância por eles percorrida com a percorrida pelo marcador no gel de agarose. 800pb 700pb 600pb 500pb 400pb 300pb 200pb 100pb Homozigótico para presença de TPA-25 Homozigótico para ausência de TPA-25 Marcador de peso molecular Heterozigótico Esta técnica permite identificar a informação herdada do pai e da mãe e distinguir indivíduos, como na cena de um crime. Assim, será necessário utilizar não um, mas vários marcadores genéticos*, utilizando uma abordagem semelhante, a esta para cada um deles. ? *15 marcadores genéticos STR (short tandem repeat) recomendados pelo Grupo Espanhol e Português da Sociedade Internacional de Genética Forense (GEP-ISFG).
39. DNA fingerprinting numa mesma família Em indivíduos não-aparentados, o número de repetições das regiões de satélites é demasiado diferente para que o padrão das várias regiões seja semelhante. O padrão transmite-se de pais para filhos, mas nunca é igual entre irmãos. Apenas gémeos verdadeiros têm padrões de bandas iguais.
47. 72ºC – 5-7min – Extensão final - Preparação do DNA a partir de amostras de cabelo 1. Remover um cabelo com folículo. 2. Inserir a folículo (ELIMINAR o resto do cabelo) num tubo de 1,5ml. 3. Incubar a folículo em 100μl de tampão de digestão (contendo ~6μg de proteinase K) durante 1 hora a 55° C, seguido de 10 minutos a 95° C 4. Usar 3μl desta solução como amostra genómica.
48. Actividade PráticaAmplificação de DNA genómico - PCR - Procedimento da reacção de PCR Misturar num tubo de PCR 50μl por reacção: - H2O..................................................................... qb 50μl - DNA.................................................................... ~250ng - primer directo...................................................... 25pmol - primer inverso .................................................... 25pmol - Tampão Taq (10x)............................................... 5μl - Mistura dos 4dNTPs 25mM cada ....................... 1μl - Taq polimerase.................................................... 1 unidade NOTA: O DNA é sempre o último a ser adicionado de modo a evitar contaminações.
52. Actividade PráticaElectroforese em Gel de Agarose - DNA fingerprinting Materiais: - Erlenmeyer de 250ml - Espátula - Balança - Microondas - Tina de electroforese - Fonte de electroforese - Micropipetas P20 e P100 - Pontas para micropipeta amarelas - Microtubos - Transiluminador de UV Reagentes: - Tampão TAE (solução 50x: trisbase242g; ácido acético glacial 57,1ml; EDTA 0,5M, pH 8,0 , 100ml; água desionizada q.b. 1000ml) - Água- ultra-pura - Tampão de amostra (solução 6x: azul de bromofenol 0,25% p/v; xileno de cianol FF; 0,25% p/v; glicerol 30% p/v) - Brometo de etídeo 0,5μg/ml
53. Actividade PráticaElectroforese em Gel de Agarose - DNA fingerprinting Preparação do gel de agarose 1 - Preparar uma solução de agarose em tampão TAE com concentração final de 1,5% (p/v). Aquecer a mistura no microondas, com agitação frequente, até toda a agarose se ter dissolvido. 2 - Colocar o tabuleiro da tina de electroforese no respectivo suporte de preparação do gel ou, na sua falta, selar com fita adesiva de autoclave. 3 - Colocar o pente em posição conveniente no tabuleiro para um correcto posicionamento dos poços: distância à extremidade e à base do gel. 4 - Verter a agarose no tabuleiro até uma altura de ~5mm. Eliminar bolhas de ar que se tenham formado, aspirando com uma micropipeta e deixar solidificar à temperatura ambiente. 5 - Quando o gel se tiver formado, retirar lentamente o pente para não danificar os poços, colocar o tabuleiro na tina de electroforese, de modo a que os poços estejam do lado do eléctrodo negativo, e adicionar tampão TAE até ~1mm acima do gel.
54. Actividade PráticaElectroforese em Gel de Agarose - DNA fingerprinting Preparação das amostras 1. Para cada amostra, misturar num microtubo: 100-500ng de DNA, 4μl de tampão de amostra (5x conc.) e água ultra-pura q.b. 20μl. 2. Aplicar as amostras nos respectivos poços, enchendo lentamente cada poço com uma micropipeta. Não deixar extravasar a amostra do poço para não contaminar os poços vizinhos. 3. Colocar a tampa da tina. Verificar que as amostras estão colocadas do lado do pólo negativo (cátodo) e que a migração será no sentido do pólo positivo (ánodo). 4. Ligar os cabos à fonte de electricidade. Ligar a fonte e regular para uma voltagem de 1-5V/cm (distância medida entre os eléctrodos). Verificar se há desprendimento de bolhas dos eléctrodos devido à electrólise e se, passados alguns minutos, o azul de bromofenol já começou a migrar no sentido correcto. 5. Após migração julgada conveniente (por avaliação da posição do azul de bromofenol a sensivelmente 3/4 do comprimento do gel), desligar a corrente eléctrica na fonte, desligar os cabos e retirar a tampa da tina. Retirar o gel cuidadosamente para não partir e corá-lo em banho numa solução de brometo de etídeo 0,5μg/ml, durante 30-45 min à temperatura ambiente.
55. Actividade PráticaElectroforese em Gel de Agarose - DNA fingerprinting Preparação das amostras (cont.) O brometo de etídeo é um agente mutagénico potente, usar sempre luvas e colocar em recipiente próprio todo o material que tenha entrado em contacto com este corante 6 - Examinar o gel à radiação ultra-violeta e fotografar para arquivar. (As radiações U.V. são extremamente perigosas, particularmente para os olhos, provocando lesões na retina. Evitar qualquer exposição dos olhos a estas radiações. Usar sempre óculos protectores ou máscaras de material opaco aos U.V).
62. Alguns sites com animações ... Técnica do PCR http://nobelprize.org/educational_games/chemistry/pcr/game/index.html DNA – dupla cadeia http://nobelprize.org/educational_games/medicine/dna_double_helix/ Código genético http://nobelprize.org/educational_games/medicine/gene-code/