El documento describe los diferentes métodos para identificar microbios desconocidos, incluyendo métodos fenotípicos, genotípicos e inmunológicos. Explica los métodos fenotípicos como la morfología microscópica y macroscópica y las características bioquímicas. También describe los métodos genotípicos como el análisis de ADN y los métodos inmunológicos como la serología. Finalmente, resalta la importancia de la recolección y manejo adecuado de muestras

1. DIAGNOSTICO DE LAS
INFECCIONES
MANUEL MONTOYA MD ID TM
CURSO INFECTOLOGIA UNSAAC
UNIDAD 1
CLASE 4

2. Estudio de las enfermedades
microbianas
Los métodos para identificar los microbios
desconocidos se dividen en tres categorías:
1. Fenotípicas - microscópicas y
macroscópicas características observables
2. Genotípica - constitución genética
3. Inmunológica - Serología; reacciones
antígeno-anticuerpo

3. Métodos Fenotípicos
• Morfología Microscópica - microorganismos frescos o con
tinción; forma, tamaño, la reacción a las tinción, estructuras
celulares
• Morfología macroscópica - aparición de colonias; textura,
tamaño, forma, pigmentos, crecimiento
• Características fisiológicas / bioquímicas - detección de
la presencia o ausencia de enzimas particulares o vías
metabólicas
• Análisis químico - analizar composición química
específica; péptidos de la pared celular, lípidos de membrana
celular

4. Métodos Genotípicos
• Evaluar la composición genética.
• Cultivos nos son necesario.
• métodos automatizados,
•Resultados rápidos
•Precisos,

5. Métodos inmunológicos
• Se utilizan anticuerpos específicos para
detectar antígenos.

6. Recogida de muestras y métodos
de laboratorio
• Muestras de partes de cuerpo o fluidos de
agente infeccioso sospechoso
• Los resultados dependen de recolección,
manejo, transporte y almacenamiento.
• Deben utilizarse procedimientos asépticos.

7. Insert figure 17.1
Sampling sites

9. Métodos Fenotípicos
• Observación -
- Macroscópica - cultivo - aparición de colonias,
requisitos de crecimiento, medios apropiados
- Microscópicas diferenciales y tinciones
especiales Gram , AFB, anticuerpos fluorescentes
• Pruebas directas Antígeno / anticuerpo
• Pruebas bioquímicas - reacciones fisiológicas a
nutrientes , ausencia/ presencia de enzimas
• Importante considerar si microbio que se recuperó
e identificó , realmente está causando la
enfermedad o es flora normal

11. Métodos Genotípicos
• Análisis de ADN
Evaluar la proporción de G + C nucleótidos
respecto al contenido A + T
• Determinar ADN o secuencias de ARN
ribosomal utilizando sondas y reacciones en
cadena de la polimerasa.

12. Métodos inmunológicos
• Serología - Para detectar signos de infección en
paciente mediante la identificación de anticuerpos
específicos in vitro
• Reacciones visibles incluyen precipitados,
cambios de color, o liberación de radiactividad.
• Pruebas se pueden utilizar para identificar y
determinar la cantidad de anticuerpo en el suero -
título.

14. Reacciones
Aglutinación y precipitación
• Prueba de aglutinación- anticuerpos con enlaces
cruzados y antígenos de células enteras , dan
complejos que se depositan y forman grumos visibles
- determinación del grupo sanguíneo, algunas enfermedades
bacterianas y virales
•Pruebas de precipitación - antígeno soluble se
hace insoluble por un anticuerpo
- sífilis,
•Western blot - inmunoelectroforesis; antígenos se
separan en bandas
- VIH

16. Insert figure 17.10
Cellularmolecular view

17. Fijación del complemento
• Detección de anticuerpos que fijan el
complemento y lisan células diana
-antígenos, anticuerpos, complemento y eritrocitos
de oveja sensibilizados
-Si el complemento se fija por el Ag-Ab, los RBC no
se lisan.

19. Inmunoensayos
• Extremadamente sensible para detectar trazas de
antígenos y anticuerpos
• Radioinmunoensayo (RIA) - antígenos y
anticuerpos marcados con isótopos radiactivos
• Enzimoinmunoensayo (ELISA) - complejo
enzima-anticuerpo produce un producto coloreado
cuando se produce una reacción enzima-sustrato

21. pruebas in vivo
• Antígenos se introducen directamente en
el cuerpo para determinar la presencia o
ausencia de anticuerpos.
- Prueba de la tuberculina, pruebas de
alergia

23. Ingeniería genética
• Directo, modificación deliberada de genoma
de un organismo
- bioingeniería
• Biotecnología - uso de las vías bioquímicas y
metabólicas de un organismo para la
producción industrial

24. Propiedades prácticas de ADN
• Las propiedades intrínsecas de ADN son
válidas incluso en un tubo de ensayo.
• ADN se calienta desde 90 ° C a 95 ° C; las dos hebras
se separan. Los nucleótidos pueden ser identificados,
reproducirse, o transcritas.
•Al enfriar lentamente el ADN permite que nucleótidos
complementarios con enlace de hidrógeno y el ADN va
a recuperar la forma de doble cadena.

26. Enzimas de corte, empalme, y
rebobinado de ácidos Nucleicos
Endonucleasas de restricción –
• Reconocen secuencias específicas de ADN y rompen los
enlaces fosfodiéster entre nucleótidos adyacentes
• Se pueden usar para escindir el ADN en sitios deseados.
• Reconocer y cortar el ADN en secuencias de bases
palíndromo.
• Se utiliza en el laboratorio para cortar el ADN en pedazos
más pequeños - fragmentos de restricción de longitud
variable (polimorfismos de longitud de fragmentos de
restricción) (RFLP).

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28. Ligasa
•Reúne con enlaces de fosfato-azúcar
(extremos pegajosos) cortadas por
endonucleasas
• Se utiliza para empalmar definitiva de los
genes en plásmidos y cromosomas
Enzimas de corte, empalme, y
rebobinado de ácidos Nucleicos

29. Transcriptasa inversa –
•Hace una copia de ADN del ARN – ADNc
•cADN se puede hacer a partir de mARN, tARN, o
rARN
•Proporciona un medio para sintetizar genes
eucariotas a partir de transcripciones de mARN
•gen sintetizado está libre de intrones
Enzimas de corte, empalme, y
rebobinado de ácidos Nucleicos

30. Métodos para análisis de ADN
Electroforesis en gel
Separa los fragmentos de ADN basada en el tamaño
- Muestras de ADN se colocan en gel de agar blando y se
someten a una corriente eléctrica.
- Carga negativa de la molécula de ADN hace que moverse
hacia el polo positivo.
- Velocidad de movimiento depende del tamaño de
fragmento fragmentos más grandes se mueven más
lentamente.
- Los fragmentos se tiñeron para la observación.
- Útil en caracterización de fragmentos ADN y comparación

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32. Métodos para análisis de ADN
Hibridación de ácidos nucleicos y sondas –
• ADN de una sola hebra puede unirse con otro similar, o ARN
puede unirse con otra ARN – hibridación
• Fundación para sondas de genes - fragmentos cortos de ADN
de secuencia conocida se aparean con segmento de ADN con
secuencia complementaria, si es que existe en la muestra
- Método Southern blot
- Fragmentos de ADN separados por electroforesis, desnaturalizados e
incubados con sondas de ADN.
- Las sondas se unirán a un segmento complementario si está presente.
-Se aisla fragmentos de una mezcla de fragmentos y busca secuencias de
genes específicos

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35. Métodos utilizados para el tamaño,
síntesis y Secuenciación de ADN
Secuenciación del ADN
-Determinar el orden real y tipo de bases del ADN
• Técnica de secuenciación de Sanger, más común
- Hebras de exámenes desnaturalizado sirven como
molde para sintetizar hebras complementarias.
- Los fragmentos se dividen en tubos que contienen los
cebadores, ADN polimerasa, los 4 nucleótidos, y marcado
fluorescente de didesoxinucleótidos.

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37. Métodos utilizados para tamaño,
síntesis y Secuenciación de ADN
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
-Método para amplificar el ADN; aumenta rápidamente la
cantidad de ADN en una muestra
- Se añaden cebadores (primers) de secuencia conocida, para
indicar donde se iniciará la amplificación, a temperatura
adecuada para ADN polimerasa y nucleótidos.
- Ciclos Repetitivos de desnaturalización, cebado y extensión,
cada ciclo posterior duplica el número de copias para análisis.
- Importante en mapeo de genes, estudio de defectos genéticos
y cáncer, medicina forense, taxonomía, y estudios evolutivos

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39. Métodos en Tecnología del ADN
Recombinante
Tecnología de ADN recombinante
– Eliminación intencionada de material genético de un
organismo y la combinación con la de uno diferente
- El objetivo es la clonación, que requiere se seleccione el
gen donante deseado, escindido por endonucleasas de
restricción, y aislado.
- El gen se inserta en un vector (plásmido, virus, cósmidos)
que insertar el ADN en un huésped de clonación. que
suele ser bacteria o levadura quien puede replicar el gen y
traducirla en un producto proteico.

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41. Características de Vectores de
Clonación
• Debe ser capaz de llevar una pieza significativa de ADN
del donante
• Debe ser fácilmente aceptado por el huésped de clonación
• Plásmidos - pequeño y bien caracterizado, fácil de
manipular y puede transferirse a células huésped
apropiadas mediante la transformación
• Bacteriófagos - capacidad natural para inyectar su ADN en
huéspedes bacterianos a través de la transducción

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43. Características de huéspedes de
clonación
1. Cambio rápido, rápido ritmo de crecimiento
2. Se puede cultivar en grandes cantidades utilizando métodos
de cultivo ordinarios
3. No patógenas
4. Genoma que está bien delineado
5. Capaz de aceptar a vectores, plásmidos o bacteriófagos
6. Mantener genes foráneos por múltiples generaciones
7. Alto rendimiento de proteínas a partir de genes extraños

44. Construcción de un recombinante,
inserción y expresión genética
Preparación de los genes aislados de empalme en un
vector mediante la digestión del gen y el plásmido con
las mismas enzimas de restricción endonucleasa, e
insertar ADN.
• El gen y el plásmido se colocan juntos, sus extremos
libres de pares de bases, y la ligasa se une a ellos.
• La combinación de genes y la recombinación es un
plásmido.
• Se introduce el recombinante en un huésped de
clonación.

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Productos bioquímicos de la
tecnología del ADN recombinante
• Permite la fabricación a gran escala de
hormonas, enzimas, vacunas .
- Insulina para la diabetes
- Hormona de crecimiento humano
- La eritropoyetina
- Factor VIII para la hemofilia
- Vacuna contra el VHB

47. Organismos Genéticamente
Modificados (OGM)
• Microbios recombinantes
- Pseudomonas syringae - evita que los cristales de hielo
- Bacillus thuringienisis -encodes un insecticida
• Plantas transgénicas
- Arroz que hace que el beta-caroteno
- Resistente a los herbicidas del tabaco
- Resistente a los gorgojos guisantes
• Animales transgénicos
- Modelos de ratón para CF,anemia de células falciformes
de Alzheimer
- Ovejas o cabras que hacen de la medicina en el semen
de leche

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49. Análisis Genómico
• Huella de ADN -
- Cada individuo tiene una secuencia única de
ADN. Se usa:
• Identificar las relaciones hereditarias
• Estudio de los patrones de herencia de enfermedades
• Estudio de la evolución humana
• Identificar a los criminales o víctimas de desastres
• Análisis de ADN mitocondrial
Para rastrear orígenes evolutivos.
• Análisis de microarrays
Seguimiento de expresión de genes; para identificar y
diseñar tratamientos de enfermedades basadas en el
perfil genético de la enfermedad

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