Documento que nos indica como hacer uan tincion Gram y Simple

1. PRACTICA N° 4: TECNICAS DE TINCION SIMPLE Y DIFERENCIAL.
OBJETIVOS:
 Reconocer la diferencia entre una tinción simple y diferencial.
 Aprender el procedimiento adecuado para preparar un frotis bacteriano.
 Por medio de la tinción distinguir las diferentes morfologías bacterianas.
INTRODUCCION.
Los microorganismos se colorean para aumentar el contraste de las células con el medio que las
rodea, lo cual mejora su visualización y permite distinguir formas y tamaños. También se pueden
diferenciar grupos bacterianos por su reacción frente a determinados colorantes.
Tinción simple
Se refiere al uso de un solo colorante para crear contraste entre la bacteria y el medio que la rodea. Este
tipo de tinción es sencilla y aporta información de la forma de la célula, el tamaño y su manera de
agruparse. Se emplean colorantes básicos como el cristal violeta, cabolfuscina y azul de metileno.
Tinción diferencial. Ej: Tinción Gram
La tinción Gram (llamada así por el científico danés Christian Gram, 1853-1938) es la coloración más útil
y más ampliamente usada en bacteriología y es un ejemplo de tinción diferencial porque utiliza más de
un colorante. A más de ser útil para evidenciar la forma, tamaño y la forma de agruparse de los
microorganismos sirve también para distinguirlos entre Gram positivos y Gram negativos dependiendo
del color que adoptan después de la coloración.
El primer paso consisten en colorear el frotis con un colorante básico denominado cristal violeta que
tiñe la pared celular o peptidoglicano de TODOS los microorganismos, el lugol (solución a base de iodo)
que es el segundo colorante es un mordiente cuya función es incrementar la interacción entre la pared
bacteriana y el cristal violeta. El frotis es luego decolorado con una solución de etanol 95% o
isopropanol-acetona (3:1 v/v). Los microorganismos GRAM POSITIVOS (pared celular gruesa) retienen el
complejo cristal violeta-lugol en el paso de decoloración, mientras que los GRAM NEGATIVOS (pared
celular delgada) pierden el complejo y se decoloran. Finalmente, al agregar el colorante de contraste, la
safranina de color rojo, las bacterias que dejaron ir al cristal violeta o sea las Gram negativas se tiñen
con este colorante y muestran una coloración roja o rosada.
Procedimiento:
- Se prepara el frotis (fig 3.1), lo cual comprende las siguientes etapas:
1) Extensiónde la muestra. Con un lápiz de cera se etiqueta la placa en uno de los bordes con el
número de identificación correspondiente y el nombre del microorganismo. Si se va a realizar la
coloración a partir de un cultivo en medio líquido, se coloca con el asa (previamente
esterilizada) una gota de cultivo sobre un portaobjetos limpio y se extiende. Si la muestra
proviene de un cultivo en medio sólido, se coloca primero una gota de agua estéril o solución
fisiológica estéril sobre el portaobjetos y se toma la muestra con el asa (previamente
esterilizada), se homogeniza bien con el asa y se extiende.

2. 2) Secado. Se deja secar la placa portaobjetos al aire.
3) Fijación. Un vez seco se fija el frotis por calor, para lo cual se pasa la placa portaobjetos tres
veces por la llama del mechero. La fijación por calor es el método más utilizado y su propósito es
matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la célula y adherir la preparación al
portaobjetos. Sin el proceso previo de fijación se lavaría el frotis durante el proceso de tinción.
- Tinción simple:
1. Una vez preparado el frotis se procede a realizar la coloración.
2. Se coloca la placa en un soporte para tinciones.
3. Se cubre con solución de azul de metileno y se deja actuar durante 1 min. Si se usa cristal violeta
se deja por 30 segundos.
4. Transcurrido el tiempo se lava con agua, se elimina el exceso de agua de la placa con papel
absorbente y se coloca una pequeña gota de aceite de inmersión.
5. Se observa en el microscopio óptico con el lente de 100X.
- Tinción Gram:
1. Una vez preparado el frotis, se procede a su coloración.
2. Se coloca la placa en un soporte para tinciones.
3. Se cubre con solución de cristal violeta y se deja actuar durante 1 min.
4. Transcurrido el tiempo se lava con agua.
5. Se cubre con lugol y se deja actuar durante 1 min.
6. Transcurrido el tiempo se lava con agua.
7. Se cubre la placa con alcohol-cetona y se deja actuar durante 20 segundos moviendo
suavemente la lámina. Adicionar la solución decolorante hasta que no quede cristal violeta en la
placa. *El paso de decoloración es CLAVE para lograr una tinción satisfactoria y no debe
sobrepasar el tiempo recomendado.
8. Se lavar con agua.
9. Se cubre con safranina y se deja actuar durante 30 segundos.
10. Se lavar con agua, se elimina el exceso de agua de la placa con papel absorbente y se coloca una
pequeña gota de aceite de inmersión.
11. Se observa en el microscopio óptico con el lente de 100X. Las bacterias Gram positivas se verán
de color azul-violeta y las Gram negativas rojas o rosadas.
NOTA: Los tiempos de tinción Gram serán modificados durante la práctica.

3. REPORTE DE RESULTADOS:
Tinción simple OBSERVACION AL MICROSCOPIO.
Nombre del
microorganismo:
Tipo de cultivo:
Morfología: (Cocos o Bacilos)
Forma de agrupación:
Tinción diferencial GRAM POSITIVO GRAM NEGATIVO
Tinción Gram
Nombre del
microorganismo:
Tipo de cultivo:
Morfología: (Cocos o
Bacilos)
Forma de
agrupación:
Cuestionario:
1. ¿Cuál es la diferencia entre la tinción simple y diferencial?
2. ¿Por qué para teñir los microorganismos se usan colorantes básicos?
3. En la coloración Gram indique la función y el nombre de cada reactivo:
a. colorante primario.
b. mordiente.
c. decolorante.
d. colorante de contraste.

4. 4. En la coloración Gram se recomienda el uso de cultivos de máximo 24 horas. Explique por
qué?
5. ¿Qué parte de la célula bacteriana es la más involucrada en la tinción Gram y por qué?
6. Complete la siguiente tabla dibujando lo que ocurre con las bacterias en cada paso de la
tinción Gram:
PASO GRAM NEGATIVOS GRAM POSITIVOS
Teñir con cristal violeta
Colocar solución de lugol
Decoloración con alcohol-
cetona
Contratinción con
safranina