PPT ini merupakan salah satu materi kuliah BIOTEKNOLOGI yang ditulis oleh Trianik Widyaningrum, M.Si. (dosen Pendidikan Biologi Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta). Butuh lebih banyak materi biologi..??? http://belajar-di-rumah.blogspot.com/

1. Kloning Gen

2. Kloning - definisi
 Dari Bahasa Yunani - klon, ranting
 Kumpulan turunan suatu individu yang dihasilkan
tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika
sebagian atau seluruh makromolekul (contoh,
DNA atau antibodi)
 Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik
induknya serta memiliki identitas genetik yang
sama dengan induknya
 Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua
identitasnya sama dengan molekul atau sel
penurunnya

3. Kloning DNA
Metoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan
memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon)
yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan
DNA yang kompleks.

4. Kloning Gen
 Ketika keseluruhan
DNA dari suatu
organisme diekstraksi,
akan diperoleh seluruh
gen yang dimiliki
organisme tersebut
 Pada kloning gen,
hanya gen (DNA)
tertentu yang diisolasi,
dimurnikan, dan
diperbanyak (diklon)

5. Tujuan mengklon Gen
 Menentukan urutan basa nukleotida penyusun
gen tersebut
 Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa
nukleotida pengendali gen tersebut
 Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang
disandi gen tersebut
 Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada
kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit
bawaan
 Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu,
misalnya memproduksi insulin, ketahanan
terhadap hama, dll.

6. Sumber DNA untuk diklon
 DNA kromosom
 cDNA (complementary DNA) yang disintesis
menggunakan mRNA sebagai cetakan
(template)
 DNA yang dihasilkan dari perbanyakan
menggunakan PCR

7. Mensintesis cDNA

8. Perbanyakan DNA dengan PCR
(Polymerase Chain Reaction)

9. Bahan / Alat untuk Mengklon
 Enzim endonuklease restriksi
 Enzim ligase
 Vektors
 Inang (Host)
 Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang

10. Memotong DNA
 Menggunakan enzim
endonuklease restriksi
 Ujung “lengket” (sticky ends)
 Ujung “tumpul” (blunt ends)
 Penamaan enzim
 EcoRI
 E = genus (Escherichia)
 co = species (coli)
 R = strain
 I = # of enzyme

11. Ujung “lengket” dan “tumpul”
(Blunt & Sticky ends)

12. Penyambungan (pasting) DNA
 Pembentukan ikatan-
H pada ujung-ujung
yang komplemen
(sticky ends)
 Ligase membentuk
ikatan fosfodiester
untuk merekatkan
benang-benang DNA

14. Vektor untuk Mengklon
Diperlukan suatu wahana (vehicle)
untuk memasukkan suatu potongan
DNA ke dalam sel agar DNA
tersebut dapat disimpan dan
diperbanyak di dalam sel tersebut

15. Plasmid
DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang
secara alami dimiliki suatu jasad
 Bentuknya benang ganda (double strands DNA,
dsDNA) sirkular
Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat
dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain

16. Vektor untuk Mengklon
Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu
membawa potongan DNA lain ke dalam sel
bila memiliki:
 Replikator (origin of replication)
 Penanda (Marker) yang mudah diseleksi
(misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)
 Situs untuk mengklon (potongan DNA yang
memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi
sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di
dalam daerah replikator atau penanda

17. Plasmid yang Dimiliki oleh
Escherichia coli
Berasal dari plasmid alami E. coli
Potongan DNA tambahan
Potongan DNA tambahan

19. Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)
Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan
tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk
binatang lain
 Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu
enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki
ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan
 Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA
asing disambung, akan dihasilkan "plasmid
rekombinan"
 Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel
inang yang sesuai

21. Kloning Terorientasi
Bila diinginkan untuk menginsersikan potongan
DNA asing dengan orientasi tertentu
 Dilakukan dengan memotong DNA vektor
maupun DNA sumber gen yang dikehendaki
menggunakan dua enzim restriksi yang
berbeda

23. Vektor untuk Mengklon
1 Vektor berupa plasmid
2 Vektor berupa bakteriofaga
3 Cosmid
4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome)
& YAC (Yeast Artificial Chromosome)

24. Vektor berupa Plasmid
• Memiliki origin of replication dari inang yang
dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara
independen terhadap genom inang.
• Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel
pembawa plasmid tersisipi DNA asing
ketahanan terhadap antibiotik ganda
penapisan biru-putih
• Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple
cloning sites, MCS)
• Mudah diisolasi dari sel inang.

25. Multiple Cloning Site (MCS)

26. Vektor berupa Plasmid

27. Vektor berupa Plasmid
 Keunggulan:
 Kecil, mudah pengerjaannya
 Strategi seleksi mudah
 Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran
kecil (< 10kbp)
 Kelemahan:
 Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan
DNA ukuran besar (> 10kbp)

28. Bakteriofaga (λ phage)

29. Vektor berupa bakteriofaga (λ vectors)
 Lengan kiri:
 Protein penyusun kepala
& ekor
 Lengan kanan:
 Sintesis DNA
 Pengendalian
 Lisis inang
 Daerah yang dihilangkan:
 integrasi & eksisi
 Pengendalian

30. Vektor berupa bakteriofaga (λ vectors)

31. Vektor berupa Bakteriofaga
 Keunggulan:
 Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
ukuran besar (10 - 23 kbp)
 Seleksi berdasar ukuran
 Kelemahan:
 Lebih sulit pengerjaannya

32. Vektor Cosmid
Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna
dari situs λ cos (dihilangkan pada vektor λ)
 Keunggulan:
 Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)
 Seleksi berdasar ukuran
 Pengerjaan seperti plasmid
 Kelemahan:
 Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan
plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50
kbp)

33. Vektor Cosmid

34. λ ZAP

35. Vektor BAC
 Replikasi dimediasi
oriS dan oriE
 parA and parB
mengendalikan agar
hanya terdapat satu
vektor dalam sel
 Menggunakan
penanda ketahanan
terhadap
KhloramfenikolR

36. Vecktor YAC
large
inserts
ARS URA3 HIS3
telomere centromere markers telomere
replication
origin
 Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp
dan dimasukkan ke dalam yeast

37. BACs dan YACs
BACs : Bacterial Artificial Chromosomes
YACs : Yeast Artificial Chromosomes
 Keunggulan:
 Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA
dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)
 Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa
nukleotida total genom
 Kelemahan:
 Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan
ukuran sangat besar

38. Shuttle Vector
 Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam inang
(memiliki origin of replication dari masing-masing inang)

39. Memilih Vektor
 Ukuran DNA yang
disisipkan
 Ukuran vektor
 Situs enzim restriksi
yang tersedia
 Jumlah salinan (copy
number)
 Efisiensi kloning
 Kemampuan untuk
menapis DNA sisipan
 Rencana penelitian
selanjutnya

40. Cara Mengklon DNA (1)
 Isolasi vektor kloning (plasmid
bacterial) & DNA sumber gen
 Pemotongan DNA sumber gen
& vektor kloning
menggunakan enzim restriksi
yang sama
 Penyisipan potongan DNA
sumber gen ke dalam vektor
kloning yang telah dipotong
menggunakan enzim restriksi
yang sama; potongan
disambung dengan bantuan
enzim DNA ligase

41. Cara Mengklon DNA (2)
 Vektor kloning yang telah
tersisipi potongan DNA
dimasukkan ke dalam sel
inang (transformasi sel
inang)
 Penapisan sel pengklon
(dan gen yang
dimasukkan)
 Identifikasi sel pengklon
pembawa gen yang
dikehendaki

42. Transformasi Sel Inang
Memasukkan plasmid (yang merupakan
vektor yang telah disisipi gen) ke dalam
sel inang

43. Transformasi (1)
 PRA-INKUBASI
Sel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan
kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2).
Perlakuan ini memberikan cekaman kepada
bakteri yang mengakibatkan membran sel dan
dinding sel bakteri tersebut menjadi permeabel
terhadap plasmid donor. Proses ini
mengakibatkan E. coli menjadi “kompeten"
untuk menerima plasmid .

44. Transformasi (2)
 INKUBASI
 Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E.
coli kompeten.
 Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang tidak
ditambah plasmid digunakan sebagai kontrol.

45. Transformasi (3)
 KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid
maupun kontrol) dipaparkan sejenak (90 detik)
kepada suhu 42 oC. Langkah ini
memaksimumkan masuknya plasmid
menembus membran dan dinding sel.

46. Transformasi (4)
 PENYEMBUHAN (RECOVERY)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid
maupun kontrol) ditumbuhkan dalam medium
kaya nutrisi untuk memberi kesempatan
penyembuhan setelah mengalami cekaman dan
kejutan. Masa penyembuhan biasanya
berlangsung satu waktu generasi (untuk E. coli
berkisar antara 30 hingga 45 menit)

47. Transformasi (5)
 PENAPISAN (SCREENING)
Sel kompeten yang telah mengalami
penyembuhan ditapis pada medium padat yang
mengandung senyawa penapis berdasarkan
penanda yang dibawa oleh plasmid.

48. Koloni E. coli yang membawa
plasmid dengan penanda gen pendar
fluor (pGLO)

49. E. coli yang Membawa Plasmid pGlo

50. Penanda selektif
Memudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi
DNA asing
 ketahanan terhadap antibiotik ganda
 penapisan biru-putih

51. Penapisan Klon
 Medium pertumbuhan
diberi antibiotik yang
sesuai dengan sifat
ketahanan yang digunakan
sebagai penanda, misalnya
Kanamisin
 Bakteri di paruh cawan
petri sebelah kanan
memiliki plasmid dengan
penanda ketahanan
terhadap Kanamisin(Kanr),
yang di sebelah kiri tidak
memilikinya

52. Penapisan warna koloni Biru/Putih
lacZ lacZ insert
Enzim berfungsi Enzim tidak berfungsi
X-gal produk X-gal produk

53. Penapisan Koloni Bakteri
pembawa Plasmid Rekombinan

54. Hibridisasi Koloni
 Dapat dilakukan
jika memiliki
DNA pelacak
 Bagian dari gen
yang dikehendaki
 Bagian dari gen
yang mirip dari
jasad lain
 Oligonukleotida
sintetik

55. End
Terima kasih………