In ouchterlony double diffusion, both antigen and antibody allowed to diffuse in to the gel. This assay is frequently used for comparing different antigen preparations. the method is called double since the antigen and antibody are allowed to migrate towards each other in a gel and a line of precipitation is formed where the two reactants are meet. This precipitation is highly specific and is used by people working with diagnosis and protein detection technique.

1. Лекція 3
• Молекулярні механізми адаптації та
еволюції фітопатогенів
• Основні причини швидкої втрати новими
сортами рослин стійкості до патогенів
виникнення нових рас у фітопатогенів.
• Механізми генетичної та епігенетичної
мінливості у мікроорганізмів.

2. Першочергове значення має проблема швидкої втрати новими
сортами стійкості до патогенних мікроорганізмів і постійна поява
нових форм фітопатогенів. Гени стійкості рослин (R-гени)
забезпечують ефективний захист від патогенів, які експресують
відповідні гени авірулентності (avr-гени), але в умовах
сільськогосподарського виробництва цей захист зазвичай є
короткочасним, оскільки патогени часто модифікують або втрачають
avr-гени, змінюючи генетичну структуру своїх популяцій у відповідь
на появу нових сортів і набуваючи здатність викликати
захворювання у раніше стійких форм рослин.
Періодично відзначається поява нових захворювань, підвищення
патогенності і вірулентності відомих збудників і придбання
патогенності видами, які були відомі як сапрофіти. Зростання
інтенсивності міграційних процесів призводить до збільшення
поширення нехарактерних для певних регіонів збудників, до яких
відсутня адаптація, і підвищення ймовірності рекомбінаційних
процесів, в результаті яких можливе формування гібридних геномів,
що призводить до стрибкоподібних змін властивостей збудників
захворювань.

3. Механізми генетичної та епігенетичної
мінливості у фітопатогенних грибів
• Мутації (точкові мутації, делеції,
ампліфікації, інверсії, генетична
рекомбінація, зміни в повторюваних
послідовностях ДНК)
• Хромосомний поліморфізм
• Гетерокаріоз
• Епігенетична нестабільність

4. Мутації у грибів
• Мутаційні мінливість фітопатогенних грибів є
одним з головних факторів їх еволюції.
• Припускають, що в іржастих грибів є гени, які
регулюють частоту мутацій.
• у сажкових грибів Ustilago maydis в області
генома, що детермінує перехід від
непатогенного до патогенного способу
існування і типи спаровування, ідентифіковані
як константні, так і варіабельні ділянки.

5. Ампліфікація генів
• Ампліфікація генів (локус-специфічне збільшення кількості їх
копій) є одним із феноменів прояви загальної генетичної
нестабільності і має універсальний характер для різних класів
організмів.
• Показано, що гени, які відіграють важливу роль в інфекційному
процесі, викликаному патогенними грибами (наприклад,
контролюють синтез гідролітичних ізоензимів), часто
представлені кількома копіями.
• Вважають, що в ході каскадного мутагенезу часто виникають
хромосомні перебудови, які призводять до дуплікацій з
подвоєнням щодо великих ділянок окремих хромосом.
Внутрішньовидову диференціацію за розмірами геному і
кількості хромосом у Fusarium oxysporum можна пояснити
частково персистентною дуплікацією. Дупліковані сегменти
можуть також виникати внаслідок транслокаций в інші
хромосоми. Відновлення геномного балансу може відбуватися
шляхом делеції або мітотичного кросинговеру. Нестабільність
при мітозі у Aspergillus nidulans виявлялася як втрата
дуплікованого сегмента внаслідок делеції при мітотичній
рекомбінації.

6. Хромосомний поліморфізм
• Дестабілізація хромосом - один з основних ознак
загальної нестабільності геному. У багатьох видів
фітопатогенних грибів в нормі виявлено високий
внутрішньовидової поліморфізм за кількістю і
розмірами хромосом. Наприклад, у гриба
Colletotrichum gloeosporioides, для якого характерно
безстатеве розмноження і наявність вегетативної
несумісності, одна група ізолятів (А) мала 5 великих
хромосом, інша (В) - 3 великих і 3-5 мініхромосом.
Ізоляти Fusarium sporotrichoides різного географічного
походження та виділені з різних рослин відрізнялися
тільки по мініхромосомам, які складалися з мозаїки
диспергованих повторів і унікальних послідовностей.

7. Хромосомний поліморфізм
• Мініхромосома у Leptosphaeria maculans (анаморфа Phoma
lingam) проявляла властивості "b" хромосом. Ці необов'язкові "b"
або "laggining" хромосоми можуть подібно плазмідам бактерій
нести фактори патогенності. Наприклад, у Nectria
haematococcum (анаморфа Fusarium solani f. Sp. Pisi) на "b"
хромосомі локалізовано гени, які контролюють синтез ферменту
пізатіндеметілази, який перетворює фітоалексин гороху пізатін в
нетоксичний для гриба форму. Штами, які втратили цю
хромосому, непатогенні, але можуть існувати в грунті як
сапрофіти.
• Вважають, що додатковим хромосомами належить значна роль
в адаптації популяцій. Збільшення "b" хромосомою частоти хіазм
в великих А-хромосомах, що, поряд з можливістю транслокации
мініхромосомамі генетичного матеріалу в процесі хромосомних
перебудов, сприяє підвищенню рекомбінатівного мінливості,
збагаченню генофонду, збільшення гетерогенності популяцій і
розширенню їх адаптивних можливостей, що спостерігається,
наприклад, при антропогенному забрудненні середовища.

8. Роль повторів ДНК в геномній
нестабільності
• Показано, що в мутаційний процес, характерний для генетичної
нестабільності, включаються не тільки власне кодуючі, а й
мінісателлітние області генома. Геноми всіх організмів містять
значну кількість повторів ДНК, які є точками ризику для
генетичних змін і нестабільності. Для міні-(15-70 пар основ),
мікро- (1-10 пар основ) і макросателітів (100-300 пар основ) -
простих тандемно повторюваних нуклеотидних послідовностей,
які розподілені по геному еукаріотів, характерний високий рівень
природної варіабельності і підвищена частота мутацій. Вони
можуть містити "гарячі точки" - сайти, за якими реалізуються
рекомбінаційні та конверсійні події. Поширеними типами
мікросателітів є тандеми динуклеотидів GТ, тринуклеотидні
повтори. Наприклад, в геномі S. cerevisiae потенційним
джерелом генетичної нестабільності з утворенням делеций є
малі тандемні повтори, а у S. pombe - зміни в GT-повторах. У S.
cerevisiae стабільність по тринуклеотидних повторам CTG/CAG
залежала від їх орієнтації в хромосомі.

9. Роль повторів ДНК в геномній
нестабільності
• У патогенних мікроорганізмів інсерційні послідовності виявлені в
ділянках генома, що вимагають ефективної і мобільного
регуляції (гени вірулентності, токсигенності). Наприклад,
тринуклеотидних послідовності повторів можуть забезпечувати
антигенну варіабельність і адаптивну еволюцію у патогенів.
Тандемні повтори виявлені в геномі патогенних грибів C.
albicans. У геномі іржастих грибів Puccinia graminis f. sp. tritici
повтори можуть становити до 30%. Микросателлитная
послідовності, які містили ТС/AG тандемні повтори, були
виявлені у ізолятів грибів, патогенних для рису, непатогенних, і у
самих рослин. На основі цих даних було зроблено припущення
про можливість горизонтальної передачі генів між
фітопатогенними грибами і рослинами. У геномі мікроорганізмів
здійснюється закріплення певної частоти і спрямованості
мінливості, зокрема, за рахунок зміни структури повторів в
активних областях генома патогенів. Мінісателіти здатні активно
переміщатися по геному і впливати на експресію генів шляхом
модифікації кодують послідовностей або освіти "ламких" місць.

10. Гетерокаріоз
• У диплоїдних фітопатогенів вірулентність частіше
проявляється як рецесивний ознака і може
маскуватися домінантними алелями авірулентності.
Встановлено, що природні раси іржастих грибів
насичені рецесивними алелями зі зміненою
вірулентністю і при розщепленні утворюють нові раси.
Схрещування 2 рас сажкових грибів привело до
появи в потомстві 22 нових рас цього патогена.
Спостережуване у збудника стеблової іржі
морфологічний мінливість інфекційних структур,
сформованих паростками Уредоспори, виділених з
однієї пустули, пояснюють можливістю реципрокного
обміну хромосом в дикаріоні.

11. НЕЯДЕРНІ ГЕНЕТИЧНІ
ЕЛЕМЕНТИ ГРИБІВ
• Мітохондріальний геном
• Транспозони
• Плазміди

12. Мітохондріальний геном
• Гетерогенність грибів по мітохондріальних
генів і станом гетероплазмона може бути
одним із джерел їх нестабільності, і також
бути її наслідком. Передача мітохондріальної
ДНК з "супресивними" мутаціями і
мітохондріальних плазмід може призводити
до прояву синдрому цитоплазматичної
трансмісивною мітохондріальної
гіповірулентності і симптомів старіння у
деяких грибів, в т.ч. фітопатогенних.

13. Транспозони
• Однією з причин високої мінливості у грибів є транспозонний
мутагенез. Мобільні генетичні елементи (МГЕ) різних типів
виявлені, зокрема, у фітопатогенних грибів Сladosporium fulvum,
P. oryzae, Phytophtora infestans, Erysiphe spp., B. cinerea та ін.
Присутність транспозона в хромосомі може надавати
плейотропний ефект (інактивація гена, в який включається
транспозон, а також активація або вимкнення інших генів,
індукція всіх типів хромосомних перебудов (делецій, дуплікацій,
інверсій, транслокаций, злиття репліконов)), що вносить значний
вклад в дестабілізацію геному. При цьому МГЕ індукують
переважно регуляторні мутації. МГЕ здійснюють незаконну
рекомбінацію, що має важливе значення в управлінні
генетичною інформацією і регуляції її експресії.

14. Транспозони
• У фітопатогенних грибів виявлено значну кількість
ретротранспозонов, які реплікуються через пряму і зворотну
транскрипцію РНК-копії цього транспозона. До групи gypsy LTR-
ретротранспозонов відносяться елемент Grasshopper (198 п.н.) у
M. grisea, Cgret (7916 п.н.) у C. gloeosporioides, Воty і Skippy у B.
cinerea. Транспозон Flipper (1842 п.н.) у B. cinerea послідовністю
транспозази близький до елементів Fot1 F. oxysporum, Pot2 і
MGR586 M. grisea.
• У геномі фітопатогенів гриба C. fulvum, що викликає
захворювання томатів, виявлено Tn-подібний елемент з високою
гомологією з ретротранспозонов copia у Drosophila, зміна
локалізації якого впливає на пристосованість в інбредних лініях.
LTR- ретротранспозонов Ty-copia знайдені у різних організмів:
дріжджів (можуть становити до 2% їх загальної ДНК), у
хитридиомицетов P. infestans і у рослин вівса. Ty- транспозони
при їх встановленні та вищепленію здатні викликати різні
мутації, а також виконувати роль промоторів.

15. Плазміди
• У грибів описані численні плазміди, які розрізняються по біохімічним
характеристикам (ДНК, РНК-плазміди), структурної організації (кільцеві,
лінійні), локалізації в клітині (ядерні, мітохондріальні), впливу на фенотип
(фенотипічно значущі і нейтральні). Припускають, що вірулентність деяких
грибів може бути пов'язана з присутністю в їх цитоплазмі плазмід.
Зокрема, у гриба F. solani f. sp. cucurbitae раси 1 при звільненні від
мітохондріальних лінійних плазмід PFSC1 і pFSC2 відбувалося зниження
патогенності по відношенню до чутливих рослин-господарям. У F.
oxysporum велика кільцева ДНК, локалізована в цитоплазмі, детермінує
стійкість до похідних нітрофурану. У штаму фітопатогенів гриба Alternaria
alternata Т88-56, що містить кільцеву плазмиду pAAT56, ДНК якої не
гомологічна ядерній та мітохондріальній ДНК, виявлена тенденція до
зменшення утворення АК-токсину і ослаблення патогенних властивостей, у
порівнянні з ізолятів, такими, що втратили цю плазміду. Трансмісія
мітохондріальної плазміди pCRY1, здатної викликати атенуацію деяких
вірулентних штамів Cryphonectria parasitica, здійснювалася через контакт
гіф і мала місце як в вегетативно сумісних, так і в несумісних штамах в
природних популяціях. Зниження вірулентності у деяких штамів може мати
адаптивне значення при відсутності відповідних господарів в зв'язку з
більшою стійкістю слабовірулентних клонів у зовнішньому середовищі.