1. LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DAN
BIOTEKNOLOGI PERTANIAN
Disusun untuk memenuhi mata kuliah Mikrobiologi dan Bioteknologi Pertanian
Semester Ganjil / Tahun 2009
Oleh
Raden Bondan E B
1500110080162
Agroteknologi D
PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2. 2
Praktikum I
Judul
Mengamati morfologi bakteri dengan pengecatan tunggal dan gram
Tujuan
Melihat morfologi bakteri dengan menggunakan satu macam zat warna.
Teori Dasar
Bakteri bersifat transparan dan berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat terlihat dengan
mata telanjang. Untuk mengetahui struktur, morfologi, dan sifat kimia bakteri harus
dilakukan pengecatan sel bakteri. Zat warna yang digunakan antara lain methylene blue, basic
fuchsin, dan kristal violet. Zat warna ini menghasilkan ion warna yang bermuatan positif
sehingga bakteri yang bermuatan negatif menarik chromophore kationik.
Terdapat dua jenis zat warna yaitu basa(methylene blue) dan asam (eosin). Waktu pengecatan
bakteri antara 30 detik – 2 menit tergantung pada afinitas zat warna.
Beberapa pengecatan yang kita kenal yaitu pengecatan tunggal dan majemuk. Pengecatan
tunggal adalah pengecatan yang menggunakan satu macam zat warna saja, sedangkan
pengecatan majemuk merupakan pengecatan yang menggunakan lebih dari satu macam zat
warna, contoh pengecatan Gram, Ziel-Nielsen, Burn Gins, dan lain-lain.
Bahan dan Alat
a. Biakan bakteri Azotobacter chroococcum
b. Zat warna carbol fuchsin/methylene blue/safranin/carbol gentian violet.
c. Gelas objek, Ose, Lampu spirtus, botol semprot
d. Kertas saring
e. Minyak imersi
f. Mikroskop
Cara Kerja
Terdiri dari pembuatan film dan pengecatan
I. Pembuatan film
3. 3
a. Bersihkan gelas objek dengan kapas beralkhohol untuk menghilangkan lemak
dan mikroba yang menempel, lalu keringkan di udara.
b. Buat lingkaran kecil di bagian bawah gelas objek untuk membatasi film
dengan pensil gelas.
c. Ambil satu ose suspensi bakteri secara aseptik, yaitu dengan cara membakar
ose di atas lampu spiritus sampai memijar, kemudian dinginkan sebentar, lalu
tempelkan pada bagian dalam dan tabung biakan sebelum mengambil suspensi
bakteri.
d. Buat film setipis mungkin di atas gelas objek di dalam batas lingkaran
e. Lakukan fiksasi dengan cara melalukan film langsung di atas api secara cepat
dua sampai tiga kali
II. Pengecatan
a. Tambahkan salah satu warna di atas film dengan waktu yang sesuai , yaitu
untuk carbol fuchsin 15-20 detik, carbol gentian violet 30-45 detik dan
methylene blue 3-5 menit.
b. Buang zat warna lalu cuci dengan mengalirkan air menggunakan botol
semprot untuk menghilangkan zat warna yang tidak terpakai
c. Keringkan dengan kertas saring dengan cara ditempelkan perlahan ke atas film
yang telah diwarnai
d. Tambahkan satu tetes minyak imersi, lalu amati di bawah mikroskop dengan
perbesaran kuat lensa objektif 100X
e. Catat dan gambar morfologi bakteri.
Praktikum Ib
Judul
Pengecatan Gram
Tujuan
Membedakan bakterti Gram Positif dan Gram Negatif
Teori Dasar
Christian Gram (1884) menemukan prosedur pengecatan Gram. Pengecatan merupakan salah
satu prosedur yang paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Secara umum bakteri
4. 4
dapat dipisahkan secara umum menjadi dua yaitu Gram Positif (organisme yang dapat
menahan kompleks pewarna primer gentian violet sampai pada akhir prosedur sehingga sel
tampak biru gelap atau ungu) dan organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal
pada waktu pembilasan dengan alkhohol sehingga bila diperiksa ternyata kosong namun
kemudian terwarnai oleh pewarna tandingan. Contoh bakteri Gram Positif antara lain Basillus
subtilis, Streptococcus lactis, dan Staphylococcus aureus, sedangkan bakteri Gram Negatif
adalah Corynebacterium diptheri, Salmonella typhosa.
Bahan dan alat
a. Biakan murni Basillus subtilis
b. Zat warna carbol gentian violet, fuchsin/safranin
c. Larutan lugol , alkhohol 95%, minyak imersi
d. Gelas objek, Ose, Lampu spritus, kertas saring
e. Mikroskop
Cara Kerja
1. Buat film
2. Tambahkan carbol gentian violet selama 3 menit
3. Cuci dengan air dengan mengalirkan air dari botol semprot
4. Tambahkan larutan lugol selama 1 menit
5. Tambahkan 2-3 tetes alkhohol, biarkan 30 detik sampai tidak ada zat warna larut
6. Cuci dengan air, tambahkan fuchsin/ safranin selama 1-2 menit
7. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring
8. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran lensa objek 100 X
9. Catat dan gambar morfologi dan warna sel. Bakteri Gram Positif akan berwarna ungu,
sedangkan Gram Negatif berwarna merah.
5. 5
Hasil Pengamatan Praktikum Ia danIb
I. Pengecatan tunggal
Genus/Spesies Bakteri : Azotobacter chrococcum (Sumber
www.microbiologyprocedure.com)
Genus/Spesies Bakteri : Bacillus subtilis( Sumber : http://www.microbelibrary.org)
Bila dilihat dari mikroskop dengan perbesaran kuat akan tampak seperti diatas dengan zat
pewarna fuchsin. Bentuk batang/basil.
II. Pengecatan Gram Negatif dan Positif
Genus/Spesies Bakteri : Azotobacter chrococcum (Sumber : http://filebox.vt.edu)
6. 6
Genus/Spesies Bakteri : Bacillus subtilis (Sumber : http://en.academic.ru/dic.nsf/)
Pembahasan
Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam
tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada basa olesan
yang diwarnai (Hadiotomo, 1990). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri
yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna
penutup.
Kesimpulan
Bahwa genus bakteri Azotobacter tergolong bakteri bergram positif dan berbentuk kokus
serta berwarna merah, sedangkan genus bakteri Basillus tergolong bakteri bergram negative
dan berbentuk rantai serta berwarna ungu
7. 7
Praktikum II
Judul
Mengamati morfologi bakteri dengan pengecatan spora dan kapsul
“Pengecatan spora bakteri (metode Klein dan metode Wirtz)”
Tujuan
Melihat bentuk spora di dalam sel bakteri
Teori
Bakteri dapat mengubah dirinya dari bentuk vegetatif menjadi spora apabila dalam keadaan
memburuk. Pada bentuk spora kegiatan bakteri akan berhenti, tidak bermetabolisme ataupun
bereproduksi (dorman). Dalam bentuk ini bakteri sangat resisten dan bisa tahan hidup dalam
waktu lama meskipun dalam keadaan lingkungan yang kurang baik karena panas, kekurangan
nutrien, radiasi, ultraviolet, atau adanya zat kimia toksik.
Sifat spora (endospora) yang demikian itu menyebabkan dibutuhkannya perlakuan keras
untuk mewarnainya. Hanya diberi perlakuan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat
menembus endospora. Tetapi, sekali pewarna tersebut memasuki endospora , sukar
dihilangkan. Berdasarkan letak sporanya, dibagi tiga yaitu sentral, subterminal, dan terminal.
Bahan dan Alat
1. Biakan murni Bacillus subtilis
2. Zat kimia/warna carbol fuchsin, methylene blue malachite green, safranin
3. Asam sulfat, alkhohol
4. Tabung reaksi, gelas objek, ose
5. Penangas air, termometer
6. Mikroskop
Cara Kerja
a. Metode Klein I
i. Campurkan suspensi bakteri dengan carbol fuchsin dalam tabung
reaksi (1:1;v/v)
8. 8
ii. Panaskan dalam penangas air selama 10 menit pada temperatur
800
C
iii. Buat film dari campuran suspensi di atas
iv. Celupkan ke dalam asam sulfat selama 1-2 detik
v. Cuci dengan air, tambahkan methylene blue selama 3 menit
vi. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring
vii. Amati dengan perbesaran kuat
viii. Catat dan gambar morfologi dan warna sel. Spora berwarna merah
sedangkan bentuk vegetatif berwarna biru.
b. Metode Klein II
i. Buat film dari suspensi bakteri
ii. Tambahkan carbol fuchsin, panaskan sampai keluar uap (800
C
selama 10 menit)
iii. Langkah – langkah selanjutnya sama dengan metode Klein I
c. Metode Wirtz
i. Buat film dari suspensi bakteri
ii. Tambahkan malachite green, panaskan sampai menguap kurang
lebih selama 2 menit.
iii. Cuci dengan air, tambahkan safranin selama 30 detik
iv. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring.
v. Amati dengan perbesaran kuat.
vi. Catat dan gambar morfologi sel. Spora berwarna hijau dan badan
vegetatif bakteri berwarna merah muda.
9. 9
Hasil Pengamatan
Bacillus subtillis
Metode Klein Metode Wirtz
Pembahasan
Metode Klein, spora berwarna merah, sedangkan bentuk vegetatif berwarna biru.
Metode Wirtz, spora berwarna hijau, sedangkan bentuk vegetatif berwarna merah muda
Kesimpulan
Spora terbentuk jika kondisi memburuk
Letak spora, dikenal tiga macam letak, yaitu : sentral, subterminal, dan terminal
Pengecatan spora terbagi menjadi dua, yaitu dengan metode Klein dan Wirtz
10. 10
Praktikum IIb
Judul
Pengecatan kapsul bakteri (Metode Burri-Gins dan Metode Maneval)
Tujuan
Melihat adanya kapsul bakteri
Teori
Pada bagian luar dari dinding sel beberapa jenis bakteri, terdapat suatu ekspolisakarida
seperti endir(gum). Zat tersebut dapat mengelilingi bakteri dan menyerupai kapsul, maka
struktur demikian disebut kapsul yang melekat kuat di dinding sel.
Struktur kapsul dapat tipis atau tebal tergantung pada jenis bakteri tersebut dan jenis bahan
makanan yang terkandung dalam media atau substrat. Kapsul merupakan eksresi dari dinding
sel bakteri itu sendiri dan berfungsi melindungi dirinya. Adanya kapsul pada bakteri patogen
mempunyai hubungan erat dengan virulensi bakteri itu sendiri. Bakteri dengan kapsul yang
tebal mempunyai virulensi lebih tinggi daripada bakteri dengan kapsul yang tipis atau dengan
yang tidak berkapsul sama sekali.
Pengecatan kapsul bakteri disebut pengecatan negatif, karena di sini yang diwarnai adalah
latar belakangnya, sedangkan objeknya sendiri kapsul tidak berwarnai.
Pada metode Burri-Gins dipakai tinta cina untuk mewarnai latar belakangnya, sedangkan
untuk mewarnai badan bakteri digunakan larutan fuchsin, sehingga badan bakteri berwarna
merah dan kapsulnya tidak berwarna pada latar belakang yang hitam.
Pada metode Maneval, untuk mewarnai badan bakteri digunakan Congo red, sedangkan
untuk latar belakangnya digunakan cat Maneval. Badan bakteri akan berwarna merah
sedangkan kapsul tidak berwarna pada latar belakang berwarna hijau.
Bahan dan Alat
a. Biakan murni Azotobacter chroococum
b. Tinta cina, cat Maneval, dan media cair
c. Zat kimia/warna larut fuchsin, Congo red
d. Gelas objek, ose, kertas saring, minyak imersi
11. 11
e. Lampu spiritus, Mikroskop
Cara Kerja
A. Metode Burri-Gins
a. Teteskan 3 ose suspensi bakteri di ujung gelas objek
b. Teteskan 1 – 2 ose tinta cina di dekantnya, lalu campurkan
c. Buat preparat hapus dengan cara mendorong ke depan dengan
menggunakan gelas objek lain
d. Keringkan di udara
e. Tambahkan carbol fuchsin selama 1 – 2 menit
f. Keringkan dengan kertas saring
g. Amati dengan perbesaran kuat.
h. Catat dan amati apa yang anda lihat. Kapsul tidak berwarna sedangkan
badan bakteri berwarna merah dengan latar belakang berwarna hitam.
B. Metode Maneval
a. Teteskan 5 – 6 ose Congo red pada gelas objek
b. 3 ose suspensi bakteri dicampurkan dengan congo red tadi. Buat film
setipis mungkin
c. Keringkan di udara
d. Tambahkan cat Maneval 1 menit
e. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring.
f. Amati dengan perbesaran kuat.
g. Catat dan gambar apa yang anda lihat. Kapsul tidak berwarna sedangkan
badan bakteri berwarna merah dengan latar belakang biru.
13. 13
Pembahasan
a. Metode Burri Gins dilakukan dengan
Perbesaran Objektif : 100X
Perbesaran Okuler : 10 X
Bentuk : bulat, diplococcus
Latar belakang : hitam
Warna bakteri : Pink
b. Metode Maneval dilakukan dengan
Perbesaran Objektif : 100X
Perbesaran Okuler : 10 X
Bentuk : bulat, diplococcus
Latar belakang : hijau kebiruan
Warna bakteri : merah
Kesimpulan
Pengecatan kapsul dengan metode Burri-Gins dan Maneval merupakan pengecatan
negatif, karena yang diwarnai adalah latar belakang dari bakteri tersebut.
Kapsul bakteri tidak dapat di cat karena sifatnya yang tidak permanen, sebab kapsul
tersebut merupakan ekskresi dari dinding sel bakteri.
Kapsul bakteri berfungsi sebagai pelindung dari pengaruh luar yang merugikan
bakteri tersebut.
Pada metode Burri-Gins, latar belakang berwarna biru, badan bakteri berwarna gelap
dan kapsulnya tidak berwarna.
Pada metode Maneval, latar belakang berwarna merah, badan bakteri berwarna merah
dam kapsulnya tidak berwarna.
14. 14
Praktikum III
Judul
Pengenalan struktur mikroskopis jamur.
Tujuan
Mengamati atau melihat struktur jamur yaitu bentuk hifa dan spora jamur.
Teori
Jamur adalah mikroorganisme yang sel-selnya berinti sejati atau eukariotik, berbentuk
benang, bercabang – cabang, tidak memiliki klorofil, dinding sel mengandung kitin atau
selulosa atau keduanya, heterotrof, absortif dan sebagian besar tubuhnya terdiri dari bagian
vegetatif berupa hifa dan generatif yaitu spora.
Bagian vegetatif jamur adalah hifa – hifa yang terbentuk benang – benang halus memanjang,
bersekat dan tidak bersekat. Kumpulan benang – benang hifa disebut miselium. Pada
umumnya hifa memiliki tebal 0,5 - 100µm. Hifa jamur dikelompokkan menjadi dua macam,
yaitu
1. Hifa seluler : miselium yang mempunyai sekat yang setiap selnya mengandung satu
atau dua inti.
2. Hifa senositik : miselium yang mengandung banyak inti dan keseluruhan miselium
berupa satu sel multi inti yang berkesinambungan, tubular seperti hifa, bercabang atau
tidak bercabang atau miselium dibagi beberapa dinding melintang (septa), setiap
segmen menjadi hifa multi inti.
Jamur dapat berkembang biak dengan menggunakan dan menghasilkan spora. Spora adalah
bagian reproduksi atau pembiakan yang terspesialisasi, terdiri atas satu sel atau beberapa sel.
Spora ada yang memiliki flagel yang disebut zoospora, dan yang tidak memiliki flagel atau
aplanospora. Bentuk dan warna spora dapat digunakan sebagai salah satu cara untuk
mengidentifikasi jamur
Bahan dan alat
a. Beberapa spesies jamur yang ditumbuhkan dalam media PDA, dan jamur konsumsi
antara lain Metharhizium, Sclerotium, Rhizopus, Trichoderma, Rhizoctonia,
15. 15
Paecillomyces, Fusarium, Jamur Tiram, Capnodium, Jamur Merang, Jamur Kuping,
Neurospora, Saccharomyces.
b. Jarum preparat
c. Objek gelas dan cover glass
d. Mikroskop
Cara Kerja
1. Ambillah potongan kecil dari biakan murni dan letakkan pada gelas objek yang telah
diberi satu tetes lactophenol cotton blue atau lactophenol.
2. Untuk melihat bentuk atau susunan spora maka potongan biakan dapat langsung
diamati di bawah stereoscopic microscope.
3. Untuk melihat detail bentuk sporangiofor atau konidiofor dan perlekatan pada
sporangium atau konidia, maka biakan harus ditutup dengan gelas penutup. Tekanlah
gelas penutup pada potongan biakan yang ada sehingga memudahkan pengamatan.
4. Atur jarak lensa dan gunakan lensa objek dengan perbesaran 10X. Untuk memperjelas
detail dari objek maka gunakan lensa dengan perbesaran 40X.
5. Amati secara mikroskopis karakteristik spora atau konidia, ujung konidiofor dan
perlekatan antara konidia dengan konidiofor.
6. Berdasarkan karakteristik koloni dan mikroskopis maka tentukan genus jamur
tersebut.
7. Jelaskan klasifikasi dari genus tersebut serta peranan yang mungkin dilakukan oleh
jamur tersebut di bidang pertanian.
16. 16
Hasil pengamatan morfologi jamur.
Pembahasan
a. Rhizopus oligosporus
Klasifikasi
Kingdom : Fungi
Division : Zygomycota
Class : Zygomycetes
Order : Mucorales
Family : Mucoraceae
Genus : Rhizopus
Species : R. oligosporus
b. Saccharomyces cerevisiae
Klasifikasi
Kingdom : Fungi
Phylum : Ascomycota
Subphylum: Saccharomycotina
Class : Saccharomycetes
Order : Saccharomycetales
Family : Saccharomycetaceae
Genus : Saccharomyces
Species : S. cerevisiae
c. Pacecillomyces sp.
Klasifikasi
Kingdom : Fungi
Phylum : Ascomycota
Class : Eurotiomycetes
Order : Eurotiales
Family : Trichocomaceae
Genus : Paecilomyces
d. Rhizoctonia sp.
Klasifikasi
Kingdom : Fungi
Phylum : Basidiomycota
Class : Basidiomycetes
Subclass : Agaricomycetidae
Order : Polyporales
Family : Corticiaceae
Genus : Rhizoctonia
e. Sclerotium rolfsii
Klasifikasi
Kingdom : Fungi
Division : Basidiomycota
Class : Basidiomycetes
Order : Agaricales
Family : Typhulaceae
Genus : Sclerotium
Species : S. rolfsii
f. Metarhizium sp
Klasifikasi
Kingdom : Fungi
Subkingdom: Dikarya
Phylum : Ascomycota
Class : Sordariomycetes
Order : Hypocreales
Family : Clavicipitaceae
Genus : Metarhizium
g. Trichoderma sp
Klasifikasi
Kingdom : Fungi
Division : Ascomycota
Subdivision: Pezizomycotina
Class : Sordariomycetes
Order : Hypocreales
Family : Hypocreaceae
Genus : Trichoderma
h. Neurospora sitophila
Klasifikasi
Kingdom : Fungi
Phylum : Ascomycota
Subphylum: Pezizomycotina
Class : Ascomycetes
Order : Sordariales
Family : Sordariaceae
Genus : Neurospora
i. Fusarium sp
Klasifikasi
Kingdom : Fungi
Subkingdom: Dikarya
Phylum : Ascomycota
17. 17
Subphylum: Pezizomycotina
Class : Sordariomycetes
Order : Hypocreales
Family : Nectriaceae
Genus : Fusarium
j. Capnodium sp.
Klasifikasi
Kingdom : Fungi
Phylum : Ascomycota
Subphylum: Pezizomycotina
Class : Dothideomycetes
Subclass : Dothideomycetidae
Order : Capnodiales
Family : Capnodiaceae
Genus : Capnodium
k. Jamur merang
Klasifikasi
Kerajaan : Fungi
Divisi : Basidiomycota
Kelas : Homobasidiomycetes
Ordo : Agaricales
Famili : Pluteaceae
Genus : Volvariella
Spesies : V. volvacea
l. Jamur tiram
Klasifikasi
Kerajaan : Fungi
Filum : Basidiomycota
Kelas : Homobasidiomycetes
Ordo : Agaricales
Famili : Tricholomataceae
Genus : Pleurotus
Spesies : P. ostreatus
18. 18
Praktikum IV
Judul
Demonstrasi Rekayasa Genetika Bakteri
Tujuan
Mengetahui proses perbanyakan vector plasmid, transfer DNA dari plasmid Agrobacterium
ke sel tanaman, dan mekanisme kinerja PCR.
Alat
a. Laptop
b. Proyektor
c. Focus
Hasil pengamatan
I. Tahapan memperbanyak vector plasmid yang sekuen DNA-nya telah disisipi gen
asing
a. Plasmid dipotong dengan enzim restriksi yaitu bagian DNA plasmid,
sedangkan sekuen DNA yang dipotong adalah fragmen DNA.
b. Plasmid terdiri dari cloning DNA, Ampicillin Resistance, dan Replikasi
Origin.
c. Sekuen DNA asing disambung dengan enzim ligase
d. Bakteri E.coli ditambahkan ke dalam larutan yang berisi plasmid.
e. Setelah plasmid masuk dalam bakteri yang mengandung ampicilin,
diingkubasi pada suhu 370
C.
f. Bakteri yang tidak mengandung plasmid dengan gen ampicilin resisten akan
mati, sehingga hanya bakteri yang mengandung plasmid saja yang terus hidup.
g. Bakteri memperbanyak diri, termasuk plasmid membentuk koloni.
II. Transfer DNA dari Plasmid Agrobacterium ke sel tanaman
a. Agrobakterium yang mengandung plasmid yang telah disisipkan gen tertentu
tahan herbisida ditransformasikan ke sel daun dengan cara mengerat daun
dengan scalpel yang telah dicelupkan ke Agrobakterium yang mengandung
19. 19
plasmid rekombinan. Penggunaan teknologi kultur jaringan menjadikan daun
yang ditumbuhkan pada media yang mengandung zat pengatur tumbuh untuk
merangsang tunas menjadi tanaman baru. Jika disemprot herbisida tanaman
yang baru tumbuh serta mengandung sekuen DNA rekombinan akan hidup
sedangkan yang tidak mengandung DNA rekombinan akan mati. Hal ini
dikarenakan tanaman tersebut telah direkayasa genetika dengan dimasukkan
sel calus melalui T-plasmid dan T-DNA transfer. Dalam hal ini, gen yang
disisipi adalah ketahanan herbisida.
III. PCR (Polymerase Chain Reaction)
ZmES4 adalah gen yang diisolasi dari sel telur jagung dan bertanggung jawab dalam
pembuahan atau fertilisasi tanaman jagung.
a. Jika sekuen DNA tersebut berpasangan terdapat 623 pasang basa.
b. Jika praimer yang dirancang untuk amplifikasi dari 5’ ke 3’ adalah 5’
GATATAGTTCCACCACATTA3’, annealing temperature adalah 600
C/72 0
C
c. Rancangan praimer yang harus dibuat jika DNA tersebut akan diperbanyak
dengan mesin PCR, sebutkan:
i. Susunan nukleotida praimer
ii. Annealing temperature adalah 50 – 600
C
iii. Pasangan basa hasil amplifikasi DNA
20. 20
d. Pasangan basa ukuran plasmid setelah disisipkan gen ZmES4 adalah
1.073.741.766 pasangan.
Pratikum V
Judul
Isolasi dan penentuan populasi bakteri dan jamur dari Rhizosfer, Filosfer, dan Spermosfer
Tujuan
Memisahkan bakteri dari jamur yang berasal dari alam seperti udara, air, tanah, rizosfer,
filosfer, atau spermosfer, ataupun dari suatu suspensi yang mengandung beberapa jenis
mikroba. Mengisolasi isolat bakteri dan jamur, serta mendapatkan biakan murni yaitu kultur
murni yang hanya terdiri atas satu jenis isolat bakteri dan jamur.
Teori
Tanaman dan bagian tanaman tertentu merupakan habitat bagi mikroorganisme. Bagian
tanaman yang berasosiasi spesifik dengan mikroorganisme adalah filosfer, rizosfer, dan
spermosfir. Rhizosfer adalah zona kontak antara akar dan tanah yang langsung
mempengaruhi metabolisme akar. Filosfer merupakan daerah permukaan tanaman yang
berhubungan langsung dengan udara atmosfer, yang meliputi daun, pucuk daun, helai daun,
dan kuntum bunga. Spermosfer adalah daerah yang melingkupi permukaan biji benih yang
sedang bergeminasi.
Terdapat tiga metode isolasi antara lain
A. Metode gores
Satu ose suspensi sumber isolat digoreskan ke atas permukaan plat agar,
penggoresan dilakukan beberapa kali dalam satu plat agar dengan tujuan
mendapatkan koloni terpisah. Plat kemudian diinkubasikan satu sampai dua hari
untuk memberikan kesempatan pada mikroba membentuk koloni. Setiap koloni
dianggap berasal dari satu sel mikroba. Selama masa inkubasi satu atau dua hari,
plat agar akan ditumbuhi berbagai jenis koloni dengan pola pertumbuhan koloni
sesuai dengan alur goresan kultur. Metode ini tidak dapat menghitung populasi
mikroba dalam suatu substrat.
B. Metode tuang
21. 21
Media agar steril yang belum membeku (kurang lebih 450
C) kedalam cawan petril
steril yang mengandung suspensi mikroba pada volume dan pengenceran tertentu.
Cawan petri yang berisi suspensi mikroba dan media agar digerakan ke kiri, ke
kanan dan diputarkan beberapa kali agar suspensi bakteri tersebar merata dalam
media biarkan membeku, inkubasikan selama 1 – 2 hari dengan petridish
diletakkan terbalik.
C. Metode replika bahan tanaman
Kita menempelkan bahan makanan seperti daun, batang, atau benih ke atas plat
agar selama 5 menit. Mikroba yang menempel di atas plat akan tumbuh setelah
masa inkubasi 1-3 hari.
I. Isolasi dan Penentuan Populasi Bakteri serta Jamur Rhizosfer Dengan
Metode Tuang
Tujuan
Mengisolasi dan menentukan bakteri dan jamur dari rhizosfer beberapa
tanaman
Teori
Metode perhitungan ini adalah metode tidak langsung yang banyak
digunakan untuk menentukan populasi mikroba di dalam tanah.
Langkahnya diawali dengan pengenceran suspensi tanah, lalu
menumbuhkan mikroba yang ada dalam suspensi tanah dalam media
agar. Jumlah koloni yang tumbuh menggambarkan jumlah mikroba
yang terdapat di dalam suspensi sehingga satuan dalam penghitungan
adalah CFU (Colony Forming Unit).
Dalam metode ini diasumsikan bahwa satu koloni berasal dari satu sel
mikroba. Jumlah mikroba dalam satu gram tanah (CFU/gr) dihitung
dengan membagi jumlah koloni yang tumbuh dengan faktor
pengenceran. Metode ini hanya menghitung bakteri hidup, dan tidak
selamanya satu koloni berasal dari satu sel bakteri. Selain itu, tidak
semua mikroba tanah dapat tumbuh pada media yang dipakai.
Bahan dan Alat
1. Tanah rhizosfer tanaman
2. Aquades steril
3. Pipet steril ukuran 1.0 dan 10 ml, tabung reaksi steril 18 ml, cawan
steril, kuas.
22. 22
4. Media agar nutrisi (3 g beef extract, 5 g pepton, 15 g agar, 1 L
akuades)
5. Media Potato dextrose agar (PDA) ( 200 g kentang, 10 g dekstrosa,
15 agar-agar, 0,2 gr CaCO3, 0,2 gr MgSO47H2O, 1 L akuades)
Cara Kerja
a. Koleksi tanah rizosfer dengan cara mengambil tanah yang
menempel di perakaran dengan bantuan kuas. Tanah non rhizofer
diambil dari tanah di luar perakaran.
b. Suspensikan 1 gram tanah ke dalam 9 ml akuades sehingga didapat
suspensi tanah dengan pengenceran 10-1
. Kocok selama 5 menit
dan biarkan selama 15 detik.
c. Dengan pipet steril, ambil 1 ml suspensi tanah 10-1
dan pindahkan
ke tabung berisi 9 ml akuades steril (10-2
). Kocok sampai merata.
d. Dengan cara yang sama, lakukan pengenceran sampai 10-7
.
e. Dari pengenceran 10-6
, 10-7
ambil masing – masing 0,5 ml suspensi
masukkan ke dalam dua cawan petri steril. Tuangkan 15 ml media
agar nutrisi untuk penghitungan bakteri. Goyangkan cawan Petri
supaya suspensi dan media tercampur homogen.
f. Dari pengenceran 10-3
, 10-4
ambil masing – masing 0,5 ml suspensi
masukkan ke dalam dua cawan Petri steril. Tuangkan 15 ml media
PDA untuk penghitungan jamur. Goyangkan cawan Petri supaya
suspensi dan media tercampur homogen.
g. Inkubasikan selama 24 jam di dalam inkubator pada suhu 300
C
h. Tentukan isolat bakteri atau jamur yang tumbuh berdasarkan
karakteristik koloni
i. Hitung koloni bakteri atau jamur. Jumlah koloni yang memenuhi
syarat adalah 30 – 300 CFU/plat agar.
j. Jumlah bakteri atau jamur per gram tanah adalah rata2
koloni/pengenceran.
Hasil pengamatan populasi bakteri dan Jamur
23. 23
Hasil pengamatan karakteristik isolate bakteri dan jamur.
Mikroba
CFU / g tanah pada pengenceran Populasi Total
(CFU/g)
10 -3
10 -4
10 -6
10 -7
Bakteri
- - -
Jamur 30 - 30 x 10 3
Keterangan
Sebagian besar cawan petri telah ditumbuhi spora sehingga jumlah koloni jamur untuk
pengenceran 10 -4
, tidak dapat ditentukan. Selain itu jumlah bakteri pada pengenceran 10-6
dan 10-7 tidak dapat ditentukan dikarenakan dinding cawan petri bakteri telah ditumbuhi
spora.
Kesimpulan
PDA pada Jamur (Metode tuang) NA pada Bakteri (Metode tuang)
24. 24
Karakteristik jamur yang terbentuk :
1. Tepian : siliat
Elevasi : Timbul
Bentuk : TAk beraturan menyebar.
2. Tepian : wol
Elevasi Tomabol
Bentuk : Berbenang-benang
3. Tepian : Bercabang
Elevasi: Tetesan
Bentuk ; Bundar
4. Tepian : tak beraturan
Elevasi: seperti kawah
Bentuk : Bundar denga tepia
menyebar
5. Tepian : Tak beraturan
Elevasi: Berbukit-bukit
Bentuk : filiform
6. Tepian : Seperti ikal rambut
Elevasi: cembung
Bentuk : bundar dengan lapisan
timbul
Isolat bakteri berdasarkan karakteristik koloni :
a. Isolat yang terbentuk 1 jenis seperti tetesan air, berwarna krem, yang letaknya
menyebar
II. Isolasi bakteri dan jamur dari suspensi campuran dengan metode gores
Tujuan
Mengisolasi dan memperoleh biakan murni bakteri dan jamur dari
rizosfer beberapa jenis tanaman.
Bahan dan alat
1. Suspensi tanah dengan pengenceran 10-2
2. Media Nutrisi Agar dan Potato dextrose agar (PDA) steril.
3. Ose, Petridish steril, Lampu spiritus
4. Media agar miring NA dan PDA
Cara kerja
1. Tuangkan 10 ml Media Nutrisi agar (NA) steril yang masih panas
/mencair ke dalam petridish steril secara aseptik. Biarkan
membeku.
2. Lakukan prosedur yang sama dengan media PDA.
3. Ambil satu ose suspensi tanah, lalu buatlah goresan – goresan pada
permukaan plat agar NA dengan cara simple streak.
4. Lakukan prosedur pada point 3 ke permukaan plat agar PDA.
25. 25
5. Inkubasikan selama 24 – 48 jam sampai koloni bakteri dan jamur
tumbuh. Amati koloni yang tumbuh. Setiap koloni yang terpisah
adalah satu isolat.
6. Ambil satu isolat dengan menggunakan ose, tanamkan pada agar
miring NA untuk bakteri dan pada agar miring PDA untuk jamur.
Penanaman dilakukan dengan membuat goresan sebanyak mungkin
di permukaan agar miring.
7. Inkubasikan paling sedikit 24 jam, hasilnya adalah biakan murni
bakteri dan jamur.
Hasil Pengamatan
Kesimpulan
Penanaman dengan penggoresan dilakukan untuk mengasingkan kuman agar didapatkan
biakan murni.
Krekteristik jamur yang teridentifikasi :
Bentuk : bundar dengan lapisan timbul
Tepian : Seperti wol
Elevasi : Timbul
Keterangan
Karakteristik isolasi bakteri yang terbentuk :
Tidak dapat ditentukan dikarenakan telah tumbuh spora pada dinding cawan petri
III. Isolasi bakteri dan jamur dari filosfer dan spermosfer metode replika
a. Tujuan
Membuat dan memperoleh biakan murni bakteri dan jamur dari
filosfer dan spermosfer beberapa jenis tanaman
b. Bahan dan alat
26. 26
1. Daun dan biji tanaman yang segar
2. Media Nutrisi Agar (NA) dan PDA steril
3. Pinset steril, cawan Petri steril, Ose steril, lampu spiritus.
c. Cara kerja
1. Tuangkan 10 ml media Nutrisi agar steril yang masih
panas atau cair ke dalam cawan Petri steril secara aseptik
dan biarkan membeku.
2. Ambil satu lembar daun atau satu potongan daun dan satu
biji benih, dan letakkan berdampingan di permukaan agar.
3. Tekan permukaan daun dan biji, tutup kembali cawan
Petri dan biarkan selama 5 menit.
4. Angkat daun dan biji dan tutup kembali cawan Petri.
5. Kultur diinkubasikan selama 1 – 2 hari dengan posisi
tutup cawan di bagian bawah.
6. Amati pertumbuhan bakteri di permukaan agar, isolat
bakteri diisolasi dari koloni yang terpisah.
7. Lakukan langkah 1 – 5 dengan menggunakan media PDA
untuk isolasi jamur.
d. Pengamatan
Gambarkan penyebaran koloni bakteri dan jamur dari
filosfer dan spermosfer di atas media agar.
Tentukan jenis koloni yang ada berdasarkan
karakteristik koloni.
Hitung jumlah koloni jika memungkinkan.
Hasil pengamatan
27. 27
Metode Replika Keterangan
Jumlah koloni
Filosphere 14 Telah ditumbuhi hifa
Spermosphere 30 Telah ditumbuhi hifa
Kesimpulan
Karakteistik koloni jamur yang terbentuk :
1. Pada biji
Bentuk: Bundar
Tepian : Bercabang
Elevasi: Cembung
2. Pada Daun
Bentuk; Kompleks
Tepian : siliat
Elevasi: Tumbuh kedalam medium
28. 28
Praktikum VI
Judul
Uji metabolisme bakteri fotosintetik pada kondisi gelap dan terang
Tujuan
Membandingkan populasi sianobakteri (bakteri fotosintesis) yang ditumbuhkan pada kondisi
tanpa dan dengan sinar matahari, serta membandingkan morfologi mikroskopis sianobakteri
yang tumbuh pada kondisi gelap dan terang.
Teori
Tipe metabolisme fotoautotropik terdapat pada sianobakteri yang memiliki pigmen klorofil
untuk menangkap energi cahaya dalam bentuk foton. Prosesnya, bakteri menfiksasi CO2
menjadi C6H12O6 melalui proses fotosintesis dan hanya berlangsung dalam satu tahap
fotosistem.
Metode untuk menentukan kemampuan proliferasi bakteri hijau adalah metode Most
Probable Number. Pada metode ini suspensi tanah diencerkan dan ditumbuhkan pada media
cair yang selektif sehingga hanya alga yang bersifat fotosintetik yang dapat tumbuh selama
inkubasi di tempat yang mendapat cahaya.
Bahan dan alat
a. Tanah sawah segar dari lapisan aerob(0-3 cm dari permukaan tanah)
b. Akuades steril
c. Pipet steri 1 ml dan 10 ml, 30 tabung reaksi 100 ml , gelas objek dan gelas penutup
d. Medium Bristol dengan N untuk menghitung sianobakteri total.
Cara kerja
a. Buat pengenceran tanah sampai 10-6 dengan metode yang dijelaskan sebelumnya
b. Pindahkan dari pengenceran 10-1
,10-2
dan 10-3
masing – masing 0,5 ml ke dalam lima
buah tabung reaksi berisi 5 ml medium Bristol.
c. Susun ke 15 tabung di tak sesuai dengan pengenceran
d. Buat dua seri kultur. Inkubasikan satu seri di tempat gelap dan lainnya di tempat
terang selama 14 hari.
29. 29
e. Amati pertumbuhan sianobakteri setiap minggu dengan mengidentifikasikan warna
hijau di dalam larutan ataupun di dasar dan permukaan larutan.
f. Catat jumlah tabung pertumbuhan positif dari setiap deret pengenceran 10-1
, 10-2
, 10-3
g. Pendugaan populasi alga ditentukan dengan metode MPN di bawah ini.
h. Ambil beberapa tetes larutan dari tabung yang menunjukkan pertumbuhan, pindahkan
ke gelas objek dan amati morfologi sianobakteri.
Metode MPN
1. Hitung dan catat jumlah tabung pada setiap pengenceran
yang menunjukkan terjadinya pertumbuhan alga.
2. Bandingkan dengan tabel probabilitas. Catat bahwa daftar
kolom sebagai kode yang terdiri atas tiga buah angka
yang menunjukkan jumlah nilai positif pada setiap
pengenceran tiga kali berturut – turut.
3. Kode berhubungan dengan nilai 40 pada tabel probabilitas
yang merupakan most probable number untuk mikroba
pada pengenceran kedua yang ditentukan menurut teori
probabilitas menurut teori probabilitas tertentu.
4. Berdasarkan tabel tersebut maka MPN untuk alga dalam 1
ml pengenceran 10-2 adalah 40 sehingga MPN
sianobakteri / g tanah adalah 100 x 40 = 4000 MPN/g.
Pengamatan.
Tabung pengenceran 10 -2
Sianobakteri pada kondisi terang
Tabung pengenceran 10 -3
Sianobakteri pada kondisi terang
30. 30
Cahaya
Tabung positif pada pengenceran
10 -1
10 -2
10 -3
Terang 5 5 5
Gelap 0 0 0
Keterangan
MPN sianobakteri ditempat terang > 1600, sedangkan MPN sianobakteri ditempat gelap <
1,8.
Tabung pengenceran 10 -3
Sianobakteri pada kondisi gelap
Tabung pengenceran 10 -1
Sianobakteri pada kondisi terang
Tabung pengenceran 10 -2
Sianobakteri pada kondisi gelap
31. 31
Morfologi Sianobakteri ditempat terang dan gelap
Kesimpulan
Pada seri yang ditempatkan di tempat terang (yang mendapatkan sinar matahari cukup),
semua tabung reaksi berwarna hijau. Ini berarti pada semua tabung terdapat sianobakteria
yang merupakan produsen makanan dan bakteri yang dapat memfiksasi N, karena media
yang digunakan pun selektif untuk bakteri yang dapat memfiksasi N.
32. 32
Praktikum VII
Judul
Perbanyakkan bakteri dan jamur
Tujuan
Untuk memproduksi inokulan bakteri dan jamur.
Teori
Pada prinsipnya bahwa perbanyakan bakteri dan jamur adalah menumbuhkan mikroba
tersebut di dalama media cair selektif. Untuk memperbanyak bakteri heterotrof umumnya
digunakan media nutrisi Azotobacter chroococcum digunakan media Ashby bebas N karena
bakteri ini dapat mengikat N dari udara.
Kualitas inokulan selain ditentukan oleh metabolit sekunder di dalamnya, dipengaruhi juga
oleh populasi bakteri/jamurnya. Populasi bakteri diukur berdasarkan jumlah colony forming
unit (CFU) per ml inokulan sedangkan populasi jamur diukur berdasarkan jumlah spora per
ml inokulan.
A. Perbanyakan Bakteri
a. Tujuan
Memproduksi inokulan bakteri pada fermentor dan menentukan populasi
bakteri di dalam inokulan.
b. Bahan dan Alat
i. Biakan murni Bacillus subtilis / Pseudomonas sp berumur 72 jam
ii. Media cair Nutrisi steril sebanyak 500 ml
iii. Alkhohol 70 %
iv. Ose, lampu spiritus, tabung reaksi untuk pengenceran
v. Fermentor 2,5 L dilengkapi dengan pengaduk pada suhu kamar
c. Cara kerja
i. Masing – masing sebanyak 10 ml akuades steril ditambahkan ke dalam
2 agar miring biakan murni Bakteri, lalu keruk dengan ose permukaan
koloni dan kocok dengan vortex sehingga didapatkan suspensi jamur.
ii. Sterilkan fermentor dengan alkhohol 70%.
33. 33
iii. Masukkan 500 ml media nutrisi cair steril ke dalam tabung fermentor
yang telah disterilkan , tambahkan suspensi bakteri sehingga
didapatkan konsentrasi inokulan sebesar 4%. Pasang tutup fermentor
dengan pengaduk dan set kecepatan pengaduk.
iv. Inkubasikan selama 72 jam pada suhu kamar.
v. Ambil sampel dari pipa di dasar tabung fermentor.
vi. Lakukan pengenceran dari 1ml sampai 10-8
vii. Tuangkan 1 ml sampel dengan pengenceran 10-8
ke dalam cawan Petri
steril dan tambahkan 15 ml media nutrisi agar (NA) pada suhu 450
C.
Lakukan dua kali dan inkubasikan kultur di inkubator pada suhu 300
C
selama 1 – 2 hari sampai terbentuk koloni bakteri.
viii. Hitung jumlah koloni di setiap plot agar.
d. Pengamatan
Hasil
Tabung Fermentor yang telah terisi
inokulan bakteri Basillus subtillis
34. 34
Genus/spesies bakteri : Bacillus subtilis
Gambar Plat 1 Gambar Plat 2
Jumlah koloni Populasi bakteri di
dalam inokulan
(CFU/g)Plat agar 1 Plat agar 2
200
100
Plat I : 200/ 10-8
= 200x108
Plat II : 100/ 10-8
=
100x108
B. Perbanyakkan Jamur
a. Tujuan
Memproduksi inokulan jamur pada fermentor dan menentukan populasi jamur
pada inokulan
b. Bahan dan alat
i. Biakan murni Trichoderma berumur 72 jam
ii. Media Cair PDA
iii. Alkhohol 70%
iv. Ose, Lampu spiritus, tabung reaksi untuk pengenceran
v. Fermentor 2,5 L dilengkapi dengan pengaduk
c. Cara kerja
i. Masing – masing sebanyak 10 ml akuades steril ditambahkan ke dalam
agar miring biakan murni jamur. Keruk dengan ose permukaan koloni
dan kocok dengan vorteks sehingga didapatkan suspensi jamur.
35. 35
ii. Masukkan masing – masing 500 ml media Ashby cair ke dalam dua
tabung fermentor yang telah disterilkan dengan alkhohol 70%
iii. Ke dalam fermentor tersebut ditambahkan 20 ml suspensi jamur
sehingga didapatkan konsentrasi inokulan sebesar 4%. Pasang tutup
dengan pengaduk.
iv. Inkubasikan selama 72 jam pada suhu kamar
v. Ambil sampel dari pipa di dasar tabung fermentor
vi. Lakukan pengenceran dari 1 ml sampel sampai 10-6
vii. Hitung populasi jamur di dalam suspensi pengenceran 10-6
dengan
metode pengenceran plat pada media PDA.
viii. Lakukan dua kali , inkubasikan kultur di inkubator pada suhu 300
C
selama 1 – 2 hari sampai terbentuk koloni jamur.
ix. Hitung jumlah koloni di setiap plat agar.
d. Pengamatan
C. Hasil
Genus/ spesies jamur : Trichoderma sp.
D.
E.
F.
G.
H. Plat 1 Plat 2
Jumlah koloni Populasi jamur di
dalam inokulanPlat agar 1 Plat agar 2
4 5
36. 36
DAFTAR PUSTAKA
Alexopoulos,C.J.,C.W.Mims, and M. Blackwell.1996. Introductory Mycology.John Wiley
adn Sons. New York
Schinner,F.,R. Ohlinger,E. Kandeler,R. Margesin.1995. Methods in Soil Biology. Springer.
Berlin
Davet, P. and F. Rouxel. 2000. Detection and Isolation of Soil Fungi. Science Publisher, Inc.
Einfield Schinner, F., R. Ohlinger, E. Kandeler, R. Margesin. 1995. Methods in
Soil Biology. Springer. Berlin.
Warner, D. 1992. Sybiosis of Plants and Microbes. Chapman & Hall. London.
