Este documento presenta una introducción al diagnóstico de virus fitopatógenos, incluyendo técnicas como la sintomatología, el uso de plantas indicadoras y diferenciales, el análisis de ácidos nucleicos, la hibridación, la PCR, la RT-PCR, ELISA e inmunoprinting para identificar virus. También describe el uso de la microscopía electrónica para observar partículas virales.

1. Diplomado: Introducción a la Normatividad, Biología y
Epidemiología de Plagas Reglamentadas
Módulo 2. Introducción a las Plagas Fitosanitarias
Subtema 2.2. Introducción a la Biología, epidemiología y manejo de
plagas
DIAGNÓSTICO DE VIRUS
FITOPATÓGENOS
Tutor: Daniel L. Ochoa Martínez
ochoadaniel08@gmail.com
11 Noviembre 2013
www.senasica.gob.mx

2. ¿Cómo saber que se trata
de una enfermedad
causada por virus?
¿Cómo saber de qué virus
se trata?

3. DIAGNÓSTICO
Conocer la etiología de la enfermedad
IDENTIFICACIÓN
Conocer el o los virus causantes de la
enfermedad

4. Proteínas
Técnicas serológicas
ELIS
A
Inmunoimpresión
RIPA
Sintomatología
Inclusiones virales
Ácidos nucleicos
Técnicas moleculares
Análisis de
RNAbc
Hibridación
Plantas indicadoras
o diferenciales
Microscopía
electrónica
PCR

5. REVISIÓN DE LITERATURA
Virus reportados en el cultivo de
interés a nivel mundial
Página web APS
Libros de enfermedades de los
cultivos con imágenes de
síntomas
Virus reportados en el cultivo de
interés en México
Trabajos de tesis
Revista Mexicana de
Fitopatología
Publicaciones del INIFAP

6. SINTOMATOLOGÍA
Síntomas característicos de virus
fitopatógenos
Distribución de plantas con
síntomas en el cultivo
Distribución de síntomas en la
planta
Observación de condiciones
del cultivo
Plantas asintomáticas
Muestreo

7. PLANTAS INDICADORAS
Indican si la planta tiene o no virus
La mayoría de los virus fitopatógenos se transmiten mecánicamente
Transmisión por injerto o biobalística para virus no transmitidos
mecánicamente
Demuestra transmisibilidad del virus
Se prefieren plantas que originan lesiones locales
Chenopodium quinoa
Ch. amaranthicolor
Datura stramonium
D. metel
Se recomienda inocular plantas de la misma especie de
donde procede la muestra

8. PLANTAS DIFERENCIALES
Conjunto de plantas que discriminan entre diferentes virus
PVX
Nicotiana tabacum
N. clevelandii
N. glutinosa
N. debneyi
Physalis floridana
Lycopersicon esculentum
Datura stramonium
D. metel
Gomphrena globosa
Chenopodium quinoa
Ch. amaranthicolor
Phaseolus vulgaris
Clon A6 de papa
PVY
PVA
L,S
S
S
S
L,S
S
S
S
L
L
L
-L
S
S
S
S
L,S
S
-S
----L
S
S
S
S
S
S
-S
----L
PLRV
----S
-S
-------
PVS
PVM
PVT
---S
---L
L
L,-L,S
-L
---L
-S
-L
---L
--
---------S
S
L,---

9. PLANTAS DIFERENCIALES
Incluyen especies que desarrollan síntomas locales y sistémicos así como
plantas no hospedantes del virus (no se producen síntomas)
Página dpv.com se incluye lo siguiente:
Diagnostic plants: especies donde el virus
produce síntomas y tipo de
síntoma
Insusceptible hosts: plantas no hospedantes del
virus

10. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Equipo costoso
Método rápido
Personal calificado
Evidencia directa
Muestras utilizadas
Hojas, pétalos, semilla o corteza si el tejido foliar contiene sustancias como el
látex que en el caso de la yuca que dificultan la “tinción” u observación de las
partículas virales
Virus purificados o parcialmente purificados

11. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Microscopio electrónico de
transmisión
Imágenes en un solo plano
Microscopio electrónico de barrido
Imágenes tridimensionales
Microscopios actuales tienen una resolución de 1 a 2 A

12. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Rejillas de cobre
Formvar
Contrastante: ácido fosfotúngstico, acetato de uranilo
Material de superficie hidrófoba : parafilm, plástico
Pipetas Pasteur
Amortiguador de fosfatos
Papel filtro
Mortero y pistilo
Pinzas antiestáticas
Material vegetal

13. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

14. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Cubrimiento de las rejillas
Colocar una película de formvar en la rejilla de cobre para
retener el material a observar
Moler la muestra en el mortero con la solución buffer
Transferir una gota al parafim
Poner en contacto la rejilla con el macerado en el lado que
contiene la película
Colocar una gota de contrastante en el parafilm y sobre ella la rejilla
que estuvo previamente en contacto con el macerado
Quitar exceso de contrastante con papel filtro y secar rejilla
Observar al microscopio electrónico

15. INMUNOABSORCIÓN - MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
(I-ME)
Captura de la partículas virales en las rejillas recubiertas previamente con
anticuerpos específicos al virus para facilitar su observación

16. ANÁLISIS DE RNAbc
Específica para virus de RNA (≈94%)
Moléculas de RNAbc
se acumulan en tejidos
de plantas infectadas
FORMA E
INTERMEDIARIO
REPLICATIVO

17. ANÁLISIS DE RNAbc
Células sin infección viral tienen sólo moléculas de RNA monocatenario

18. CELULOSA PREFERENCIA POR RNA bc

19. ANÁLISIS DE RNAbc

20. ANÁLISIS DE RNAbc

21. HIBRIDACIÓN
Virus A
U C G G AA C C C U G U A G G
A G C C U U G G G A C A U C C
Segmento complementario

22. HIBRIDACIÓN
Segmento complementario
A G C C U U G G G A C A U C C
Sonda
Ácido nucleico que es complementario a una parte o toda la
secuencia de ácidos nucleicos del virus o viroide de interes
que ha sido marcada con un elemento radiactivo o no
radiactivo

23. HIBRIDACIÓN
Nitrocelulosa
Afinidad por ácidos nucleicos

24. HIBRIDACIÓN
Película fotográfica

25. POLIMERASE CHAIN REACTION
Multiplicación de un gran número de segmentos de
DNA
5´
3´
3´
5´
Elementos para la duplicación del
DNA
A
Helicasa
C
T
G
Deoxinucleótidos trifosfato
Polimerasa
DNA polimerasa- DNA dependiente
primers
Elementos para la PCR
A
C
T
G
Taq- polimerasa
Calor
Deoxinucleótidos trifosfato
DNA polimerasa- DNA dependiente
primers

26. POLIMERASE CHAIN REACTION
Primer ciclo
1. Desnaturalización del DNA
5´
3´
3´
5´
Separación de las dos cadenas por calor
92-96°C
5´
3´
3´
3´
3´
3´
3´
5´
5´
5´
5´
5´

27. POLIMERASE CHAIN REACTION
Primer ciclo
5´
3´
3´
5´
2. Hibridación o anillamiento de los primers
50-65°C
3. Unión de la Taq-polimerasa
4. Elongación de la cadena
72°C

28. POLIMERASE CHAIN REACTION
Segundo ciclo
5´
3´
3´
5´
1. Separación de las cadenas
5´
3´
3´
5´

29. POLIMERASE CHAIN REACTION
Segundo ciclo
5´
3´
3´
5´
2. Hibridación o anillamiento de los primers
3. Unión de Taq polimerasa
4. Elongación de la cadena

30. POLIMERASE CHAIN REACTION
Tercer ciclo
5´
3´
3´
5´

31. ¿Funciona la PCR para virus cuyo genoma es RNA?
5´
3´
3´
5´
Elementos para la PCR
A
Calor
C
T
Deoxinucleótidos trifosfato
G
Taq- polimerasa
DNA polimerasa- DNA dependiente
primers
¿Es posible obtener una cadena de DNA a partir de un molde de
RNA?
Transcriptasa inversa o retrotranscriptasa
RT

32. RETROTRANSCRIPTASE
POLIMERASE CHAIN REACTION
Multiplicación de un gran número de segmentos de cDNA
Obtención de cDNA (complementary DNA)
Retrotranscriptasa
DNA polimerasa- RNA dependiente
1. Unión de primer
2. Unión de retrotranscriptasa
3. Elongación de cadena

33. RT - PCR
Primer ciclo
1. Desnaturalización del cDNA
5´
3´
3´
5´
Separación de las dos cadenas por calor
92-96°C
5´
3´
3´
3´
3´
3´
3´
5´
5´
5´
5´
5´

34. RT - PCR
Primer ciclo
5´
3´
3´
5´
2. Hibridación o anillamiento de los primers
50-65°C
3. Unión de la Taq-polimerasa
4. Elongación de la cadena
72°C

35. RT - PCR
Segundo ciclo
5´
3´
3´
5´
1. Separación de las cadenas
5´
3´
3´
5´

36. RT - PCR
Segundo ciclo
5´
3´
3´
5´
2. Hibridación o anillamiento de los primers
3. Unión de Taq polimerasa
4. Elongación de la cadena

37. RT - PCR
Tercer ciclo
5´
3´
3´
5´

38. RT - PCR
Primer ciclo
1. Desnaturalización del cDNA
5´
3´
3´
5´
Separación de las dos cadenas por calor
92-96°C
5´
3´
3´
3´
3´
3´
3´
5´
5´
5´
5´
5´

39. RT - PCR
Primer ciclo
5´
3´
3´
5´
2. Hibridación o anillamiento de los primers
50-65°C
3. Unión de la Taq-polimerasa
4. Elongación de la cadena
72°C

40. RT - PCR
Segundo ciclo
5´
3´
3´
5´
1. Separación de las cadenas
5´
3´
3´
5´

41. RT - PCR
Segundo ciclo
5´
3´
3´
5´
2. Hibridación o anillamiento de los primers
3. Unión de Taq polimerasa
4. Elongación de la cadena

42. RT - PCR
Tercer ciclo
5´
3´
3´
5´

43. ELISA
(Enzime Linked ImmunoSorbent Assay)
Antígeno
(virus)
Anticuerpo
Conjugado
(Anticuerpo + Enzima)
Enzima : fosfatasa alcalina
Sustrato : p-nitrofenil fosfato

44. ELISA
1. Sensibilización
Unión del anticuerpo a la
superficie de poliestireno

45. ELISA
2. Maceración de tejido
Ruptura de células
vegetales y liberación
de partículas virales

46. ELISA
3. Adición de muestra
a) Unión virus-anticuerpo
b) No unión virus- anticuerpo

47. ELISA
4. Adición del conjugado
a) Unión virus-conjugado
b) No hay unión del conjugado

48. ELISA
5. Adición del sustrato
a) Unión enzima –
sustrato (cambio de
color –amarillo-)
b) No hay cambio de
color

49. 6. Lectura de la placa

50. ELISA directa
Y
E
Anticuerpo
producido
en conejo
S
Sustrato
- p-nitrofenil
fosfato
Enzima:
- Fosfatasa alcalina
- Peroxidasa
E
Conjugado
producido
en conejo

51. ELISA indirecta
Y
S
Anticuerpo
producido
en conejo
Sustrato
- p-nitrofenil
fosfato
E
Conjugado
“anticonejo”
producido
en carnero

52. INMUNIZACIÓN
Virus
(antígeno)

53. INMUNIZACIÓN
Anticuerpo de conejo
(antígeno)
E
Conjugado
Anticuerpo de carnero
(anticonejo)

54. ELISA indirecta
I. Colocación de muestra
Maceración de tejido
con virus
Adición del antígeno

55. ELISA indirecta
II. Adición de anticuerpo producido en conejo
que reacciona contra el virus
Virus
(antígeno)

56. ELISA indirecta
III. Adición de anticonejo
Anticuerpo de conejo
(antígeno)
E
Conjugado
(anticonejo)
Anticuerpos de
carnero
(anticonejo)

57. ELISA indirecta
IV. Adición de sustrato
S
Cambio de color

58. INMUNOIMPRESIÓN
Nitrocelulosa o nylon
Afinidad por ácidos nucleicos

59. INMUNOIMPRESIÓN
1. Adición de la muestra
Impresión directa del tejido vegetal

60. INMUNOIMPRESIÓN
2. Bloqueo de la membrana
Albúmina de suero de bovino

61. INMUNOIMPRESIÓN
3. Adición del conjugado

62. INMUNOIMPRESIÓN
4. Adición del sustrato

63. Chips de DNA
Biochip, DNA chip, DNA microarray, gene array
Detección de un gene a la vez
Detección de miles de genes a la vez

64. Fundamento
Apareamiento de bases (A-T y G-C para el DNA; A-U y
G-C para el RNA) o hibridación
Secuenciamiento
Aarreglo ordenado de muestras que permite el
apareamiento de bases de DNA de muestras conocidas o
desconocidas de acuerdo con las reglas de apareamiento
mediante un procesamiento automático.

65. Chips de DNA fabricados con robótica de alta velocidad sobre vidrio o nylonen
la que se colocan sondas de secuencia conocida para determinar la presencia de
las secuencias complementarias

66. El chip tiene el
tamaño de la uña de
un dedo pulgar
Contiene oligonucleótidos,
(secuencias cortas de DNA
que portan información
genética) fijados en las
columnas de vidrio
Hasta 256,000 oligonucleótidos
pueden estar en un chip
La unión entre los oligonucleótidos sigue
las reglas de apareamiento de bases del
DNA: el nucleótido A se aparea con T y G
con C. Se requiere el marcaje de la sonda
desconocida con una molécula fluorescente
para detectar al material unido.
Las secuencias desconocidas de
nucleótidos que entran en contacto
con el chip, se unen a su contraparte
(el oligonucleótido fijado a la columna
de vidrio) sólo si existe un
apareamiento completo.

67. Chips de genes
Emisión de fluorescencia
Detección de fluorescencia
Análisis computarizado
Secuencias
conocidas
encontradas
(patógenos)