1) El kit de aislamiento de ADN de plantas/hongos de Norgen proporciona un método rápido para aislar y purificar ADN total de una amplia gama de especies de plantas y hongos. 2) El proceso implica triturar tejido vegetal en un mortero con nitrógeno líquido, agregar soluciones de lisis y ARNasa, y luego centrifugar el lisado a través de una columna de filtro para eliminar residuos antes de unir el ADN a la columna. 3) El ADN purificado

1. Teléfono: 866-667-4362 • (905) 227-8848
*
Fax: (905) 227-1061
Thorold, ON, Canadá L2V 4Y6
3430 Schmon Parkway
los rendimientos promedio variarán dependiendo de una serie de factores, incluidas las especies, las condiciones de crecimiento
utilizadas y la etapa de desarrollo.
Correo electrónico: techsupport@norgenbiotek.com
Inserto de producto
Kit de aislamiento de ADN de plantas/hongos
Especificaciones del juego
100 miligramos
10 µg
18 µg
4 µg
Hora de completar 10 purificaciones
A continuación, se añade Binding Buffer I al lisado seguido de otra breve incubación en hielo. Luego, el lisado se centrifuga a
través de la columna de filtro provista para eliminar cualquier residuo. Luego se agrega etanol al lisado clarificado y la solución
se carga en una columna giratoria. La resina de Norgen se une a los ácidos nucleicos de una manera que depende de las
concentraciones iónicas, por lo que solo el ADN se unirá a la columna mientras que la mayoría del ARN y las proteínas se
eliminan en el flujo. A continuación, el ADN unido se lava con la solución WN y la solución de lavado A proporcionadas para
eliminar las impurezas restantes, y el ADN total purificado se eluye con el tampón de elución B. El ADN purificado tiene la
máxima integridad y se puede utilizar en una serie de aplicaciones posteriores.
Fusarium sp. (50 mg peso húmedo)
Hongos (peso húmedo)
1,5 µg
se purifica preferentemente de otros componentes celulares, como las proteínas, sin el uso de fenol o cloroformo. El
ADN purificado tiene la máxima integridad y se puede utilizar en una serie de aplicaciones posteriores, como PCR en
tiempo real, transferencia Southern, análisis SNP y secuenciación.
650 µL
50 mg de hojas de parra
50 mg Hojas de ciruela
50 mg Agujas de pino 100
mg Hojas de frambuesa
10 µg
5 µg
45 minutos
50 µg
N.° de producto 26200, 26250
Especificaciones
100 miligramos
Aspergillus niger (50 mg de peso húmedo)
2 µg
La purificación se basa en la cromatografía en columna giratoria. El ADN se purifica preferentemente de otros
componentes celulares como las proteínas sin el uso de fenol o cloroformo. El proceso consiste en triturar tejido vegetal en
un mortero con nitrógeno líquido (o un equipo de homogeneización alternativo). A continuación, se añaden Lysis Buffer L y
RNase A, seguido de una breve incubación a 65 °C.
tejidos vegetales
Botrytis cinerea (50 mg peso húmedo)
2,5 µg
Tecnología de purificación de Norgen
Cantidad máxima de material de partida:
100 mg de hojas de fresa
10 µg
5 µg
1
El kit de aislamiento de ADN de plantas/hongos de Norgen proporciona un método rápido para el aislamiento y la
purificación del ADN total de una amplia gama de especies de plantas y hongos. Además, el kit también proporciona un
método conveniente para la detección de patógenos que pueden estar infectando una planta, ya que permite la purificación
de cualquier ADN patógeno junto con la purificación del ADN total. El ADN total se puede purificar a partir de tejidos
vegetales frescos o congelados, células vegetales o muestras de hongos con este kit. el ADN
Volumen máximo de carga de columna
Capacidad máxima de encuadernación de columnas
Rendimiento
promedio* 50 mg Hojas de tomate
50 mg de hojas de durazno
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2. 1 de 7 ml, 1 de 25 ml
Reactivos y equipos proporcionados por el cliente
Filtrar columnas
1 vial (80 µL)
• Nitrógeno líquido o cualquier homogeneizador mecánico
500
Producto # 26200 (50 preparaciones) Producto # 26250 (250 preparaciones)
• Adaptable con los métodos actuales de homogeneización celular
Este kit está diseñado únicamente con fines de investigación. No está diseñado para uso humano o de diagnóstico.
2 x 38 ml
Solución de lavado A
• Baño de hielo
Inserto de producto
50
• Altos rendimientos de ADN total
1
Debe tener lo siguiente para usar el kit de aislamiento de ADN de plantas/hongos:
Columnas giratorias
5 viales (5 x 80 µL)
2
• Sin extracciones de fenol o cloroformo
50
30ml
• 96-100 % etanol
Ventajas
Componentes del equipo
250
Tampón de lisis L
Condiciones de almacenamiento y estabilidad del producto
18ml
• Aislar ADN total de alta calidad de una variedad de especies de plantas y hongos, incluyendo cualquier
250
1 de 30 ml, 2 de 60 ml
Asegúrese de usar una bata de laboratorio adecuada, guantes desechables y gafas protectoras cuando trabaje con
productos químicos. Para obtener más información, consulte las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS)
correspondientes. Estos están disponibles en línea en forma de cómodos archivos PDF en www.norgenbiotek.com.
Tampón de elución B 15ml
• Procesamiento rápido y fácil utilizando un formato de columna giratoria rápida
100
Componente
Todas las soluciones deben mantenerse selladas herméticamente y almacenarse a temperatura ambiente, excepto la
ARNasa que debe almacenarse a -20 °C. Estos reactivos deben permanecer estables durante al menos 2 años en sus
envases sin abrir.
Tampón de unión I
1 de 18 ml, 1 de 55 ml
• Microcentrífuga de sobremesa
Tubos de recogida
50
ADN patógeno
7ml
1
ARNasa A
30ml
La solución WN contiene sales de guanidinio y debe manipularse con cuidado. Las sales de guanidinio forman
compuestos altamente reactivos cuando se combinan con lejía, por lo que se debe tener cuidado para desechar
adecuadamente cualquiera de estas soluciones.
• 70 % de etanol
Precauciones y renuncias
Solución WN
38ml
• Incubadora a 65°C
Tubos de elución (1,7 ml)
250
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3. Diagrama de flujo
Procedimiento para purificar ADN total utilizando el kit de aislamiento de ADN de plantas/hongos de Norgen
3
Agregue el tampón de unión I.
Transferir a columna de filtro
GIRAR
Eluir el ADN con
Tampón de elución B
GIRAR
GIRAR
Agregar etanol
ADN total purificado de plantas/hongos
Vincular a la columna de giro
Moler plantas u hongos utilizando nitrógeno líquido.
GIRAR
Lavar una vez con Solution WN
Añadir Lysis Buffer L y RNAse A.
Incubar a 65°C.
Incubar en hielo.
Lavar dos veces con solución de lavado A
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4. Procedimientos
Notas antes del uso
o Añada 24 mL de 96 -100%etanol (a proporcionar por el usuario) al líquido suministrado.
la solución debe dividirse en pequeñas alícuotas y almacenarse a -20 °C.
• Preparar una concentración de trabajo de Solución WN:
frascos que contienen 18 ml de solución WN concentrada. Esto dará un volumen final de 42 ml.
• Todos los pasos de centrifugación se realizan a temperatura ambiente.
Se recomienda que no se utilicen más de 100 mg de hongos (peso húmedo) o 100 mg de tejido vegetal para este
procedimiento para evitar la obstrucción de la columna. Sin embargo, en algunos casos puede ser posible aumentar la
cantidad de material vegetal procesado hasta 150 mg dependiendo del contenido de ADN de la planta. • Este kit se proporciona
con 2 columnas separadas. Cuando las columnas se extraen de las bolsas etiquetadas en las que se suministran, se pueden
identificar fácilmente de la siguiente manera:
o Columnas de filtro : contiene una junta tórica de plástico transparente
o Columnas giratorias : contiene una junta tórica de plástico gris
Frascos que contienen 55 ml de Solución WN concentrada. Esto dará un volumen final de 128 mL.
• Se debe utilizar una centrífuga de velocidad variable para obtener el máximo rendimiento del kit. Si una variable
•
centrífuga de velocidad no está disponible, se puede utilizar una centrífuga de velocidad fija, sin embargo, se pueden observar
rendimientos reducidos.
Todos los pasos de centrifugación se llevan a cabo en una microcentrífuga de sobremesa. Se requieren varias velocidades
para diferentes pasos, así que verifique las especificaciones de su microcentrífuga para asegurarse de que sea capaz de alcanzar las
velocidades adecuadas. Todos los pasos de centrifugación se realizan a temperatura ambiente. Las rpm correctas se pueden calcular
usando la fórmula:
Las etiquetas de las botellas tienen una casilla que se puede marcar para indicar que se ha agregado etanol.
1. Preparación de lisado a.
Coloque ÿ100 mg de tejido vegetal u hongos húmedos en un mortero que contenga nitrógeno líquido y muela hasta obtener un
polvo. Transfiera el polvo de plantas o hongos a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml sin DNasa (no incluido) y agregue 500
ÿl de Lysis Buffer L y 1 ÿl de RNAse A.
o Añadir 73 mL de 96 -100%etanol (a cargo del usuario) al líquido suministrado.
• Asegúrese de que todas las soluciones estén a temperatura ambiente antes de su uso. Si es necesario calentar a 65°C
Como alternativa, se pueden utilizar otros métodos de homogeneización con este procedimiento, incluido un sistema de perlas.
Si se utiliza un método alternativo, agregue 500 µL de Lysis Buffer L y 1 µL de
4
para volver a disolver los precipitados.
• Prepare una concentración de trabajo de la solución de lavado A agregando 90 ml de etanol al 96 - 100 % (proporcionado por
el usuario) a las botellas suministradas que contienen la solución de lavado A concentrada. Esto dará un volumen final de
128 ml. La etiqueta de la botella tiene una casilla que se puede marcar para indicar que se ha agregado etanol.
• Guarde la solución de ARNasa A a 4 °C durante un máximo de 3 meses. Para un almacenamiento más prolongado, la RNasa A
donde RCF = aceleración gravitacional requerida (fuerza centrífuga relativa en unidades de g); r = radio del rotor en cm; y RPM = el
número de revoluciones por minuto requeridas para lograr la fuerza g necesaria.
(1.118 x 10-5) (r)
RPM = FCR
(1.118 x 10-5) (r)
RPM = FCR
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5. mi. Transfiera solo el sobrenadante claro del flujo continuo a un recipiente libre de ADNasa.
3. Lavado de columna
una. Coloque la columna en un tubo de elución nuevo de 1,7 ml proporcionado con el kit. b.
Agregue 100 µL de Elution Buffer B a la columna e incube durante 1 minuto a temperatura ambiente.
d. Monte una columna de filtro (junta tórica transparente) con uno de los tubos de recogida proporcionados.
minuto adicional.
resina. Deseche el tubo de recolección.
RNAsa A a la muestra inmediatamente después de la homogeneización y vórtice durante 20 segundos para
mezclar.
una. Monte una columna de centrifugación (junta tórica gris) con uno de los tubos de recogida
proporcionados. b. Aplique hasta 650 µL del lisado clarificado con etanol en la Spin Column y
C. Aplique 500 µL de solución de lavado A a la columna y centrifugue durante 1 minuto a 10 000 × g (~10 000 RPM).
C. Centrifugar durante 1 minuto a 10 000 x g (~10 000 RPM). Tenga en cuenta el volumen eluido de la columna. Si
no se ha eluido todo el volumen, haga girar la columna a 20 000 xg (~14 000 RPM) durante 1 minuto adicional.
5. Almacenamiento de
ADN El ADN genómico purificado se puede almacenar a 2-8°C durante unos días. Para almacenamiento a largo
plazo, se recomienda -20°C.
F. Agregue un volumen igual de etanol al 70 % (proporcionado por el usuario) al lisado recolectado anteriormente (se
agregan 100 µL de etanol por cada 100 µL de lisado). Vórtice para mezclar. Continúe con el Paso 2.
(~10.000 RPM).
tubo de microcentrífuga (no incluido) con una pipeta.
C. Dependiendo de su volumen de lisado, repita el paso 2b si es necesario.
4. elución de ADN
Pipetee el lisado en la columna de filtro y centrifugue durante 2 minutos a 20 000 xg (~14 000 RPM).
Nota: Asegúrese de que todo el volumen de lisado haya pasado al tubo de recolección inspeccionando la
columna. Si no ha pasado todo el volumen de lisado, centrifugue durante
F. Haga girar la columna durante 2 minutos a 20 000 xg (~14 000 RPM) para secar completamente el
C. Agregue 100 µL de Binding Buffer I, mezcle bien e incube durante 5 minutos en hielo.
b. Incubar a 65ºC durante 10 minutos. Ocasionalmente mezcle el lisado 2 o 3 veces durante la incubación
invirtiendo el tubo.
centrifugar durante 1 minuto a 10.000 × g (~ 10.000 RPM). Deseche el fluido y vuelva a montar la
columna de centrifugación con el tubo de recogida.
d. Deseche el fluido y vuelva a montar la columna de centrifugación con su tubo de recogida. mi. Repita los
pasos 3c y 3d.
5
2. Enlace a la columna
b. Deseche el fluido y vuelva a montar la columna de centrifugación con su tubo de recogida.
una. Aplicar 500 µL de Solución WN a la columna y centrifugar por 1 minuto a 10,000 × g
temperatura.
d. (Opcional): se puede realizar una elución adicional si se desea repitiendo los pasos 4b y 4c usando 50 µL de
Elution Buffer en un tubo de elución diferente. El rendimiento total se puede mejorar en un 20-30% adicional
cuando se realiza esta segunda elución.
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6. Guía para resolver problemas
La columna se
ha obstruido
Asegúrese de agregar la cantidad indicada de 96 - 100 % de etanol a la
solución WN y la solución de lavado A suministradas antes de su uso.
Tampón de unión I
aplicaciones
El ADN no se
lavó con el lavado
proporcionado.
Solución y explicación
No se agregó etanol
al lavado.
Tome medidas para optimizar las condiciones de PCR que se utilizan,
incluida la variación de la cantidad de plantilla de ADN, el cambio de la
fuente de la polimerasa Taq , el análisis del diseño del cebador y el ajuste
de la condición de hibridación.
El ADN no
funciona
Recuperación
Centrifugar el lisado a 20 000 xg (~14 000 RPM) durante 5 minutos
después del paso 1c y continuar con el Paso 1d utilizando el sobrenadante
limpio.
Asegúrese de que el Binding Buffer I se agregue al lisado y que se
incube en hielo durante 5 minutos antes de centrifugar el lisado.
Asegúrese de realizar el centrifugado en seco bajo el
procedimiento de lavado de columna para eliminar los restos de
etanol antes de la elución. Se sabe que el etanol interfiere con muchas
aplicaciones posteriores.
Solución A
6
Se recomienda utilizar el tampón de elución B suministrado con este kit
para obtener la máxima recuperación de ADN.
La cantidad máxima de
tejido supera las
especificaciones del kit
Se utilizó un
tampón de elución
alternativo
No exceda las cantidades recomendadas de materiales de partida. Es
posible que sea necesario reducir la cantidad de material de partida si la
columna muestra obstrucciones por debajo de los niveles recomendados.
Consulte también "Columna obstruida" a continuación.
Se necesita
optimizar la condición de
reacción de PCR
Solución
bien
aguas abajo
Causa posible
La temperatura
de la centrífuga es
demasiado baja
Asegúrese de agregar la misma cantidad de etanol al 70 % al lisado
antes de unirlo a la columna.
Columna
Problema
No se añadió etanol al
70 % al lisado.
Asegúrese de que la centrífuga permanezca a temperatura ambiente
durante todo el procedimiento. Las temperaturas inferiores a 20 °C
pueden provocar la formación de precipitados que pueden obstruir las
columnas.
obstruido
Remanente de etanol
ADN pobre
Demasiados
restos celulares en el
sobrenadante del lisado
El aporte óptimo es de 100 mg de tejido vegetal u hongos (peso húmedo).
Sin embargo, para algunas especies, se pueden procesar hasta 150 mg
de tejido dependiendo del contenido de ADN de la muestra.
no se añadió al lisado
Pueden quedar rastros de sal del paso de unión en la muestra si la
columna no se lava dos veces con la solución de lavado A. La sal puede
interferir con las aplicaciones posteriores y, por lo tanto, debe lavarse de
la columna.
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7. 25600
Kit de aislamiento de ADN de plantas/hongos
También se puede obtener soporte técnico en nuestro sitio web (www.norgenbiotek.com) o por correo electrónico a
techsupport@norgenbiotek.com.
Kit de purificación de ARN/ADN de plantas
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Producto #
26200
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24400
7
25800
11900
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al número gratuito 1-866-667-4362.
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