Este documento resume la transición de la biopsia de embrión a día 3 a la biopsia de blastocisto para la detección de aneuploidías en ciclos de fecundación in vitro. La biopsia de blastocisto ofrece un diagnóstico más robusto al permitir la biopsia de múltiples células del trofectodermo. Es menos dañino para los embriones y conduce a mejores resultados de embarazo. También es más económico y permite la detección de mosaicismos. Sin embargo, requiere un cultivo

1. 1
Service of Reproductive Medicine. Department of Obstetrics, Gynecology and Reproduction
Women’s Health Dexeus, Hospital Universitario Quiron Dexeus
Mònica Parriego, Lluc Coll, Montse Boada
Screening de aneuploidías en FIV,
transición a la biopsia de blastocisto

2. 2
Disclosure
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honorarium from Illumina.”

3. 3
Evolución histórica
(PGD Consortium Data Collection V-XIII)

4. 4
Evolución histórica
Obtención de un número superior de células (3-8) del trofectodermo de
blastocistos (TE) como fuente de DNA for Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD)
1990
Dokras, et al.
Número superior de células Superar las limitaciones asociadas al análisis de
una única célula
1997 Veiga, et al.
Utilización del láser para biopsiar células del TE
2004 De Boer, et al.
Implementación de la estrategia de biopsia de TE biopsy en la clínica de FIV
2015 Cambio a la estrategia de biopsia de blastocisto con transferencia diferida de
los centros de FIV
Alentados por los resultados publicados

5. 5
Enero 2014- diciembre de 2015
Experiencia I.U.Dexeus PGS D+3
59.8Tasa de ciclos con transferencia (%)
49.5Tasa de embarazo evolutivo (%)
56.1Tasa de embarazo por transferencia (%)
10.0Tasa de aborto (%)
36.5Tasa de embarazo por ciclo (%)
1.4X embriones transferidos / transfer
18.1Tasa de euploidía (%)
89.3Tasa de diagnóstico (%)
8.3X Embriones biopsiados
38.7X edad de la mujer (años)
179Ciclos PGS (#)

6. 6
¿Por qué cambiar a biopsia de TE?
Diagnóstico más robusto
Menos dañino para los embriones/ Mejores resultados
Más económico
Detección de mosaicismo

7. 7
Mayor número de células biopsiadas Resultados más fiables
Blastómero
Células del trofectodermo
3-8 células biopsiadas
¿Por qué cambiar a biopsia de TE?
Diagnóstico más robusto

8. 8
Mayor número de células Menos fallo de resultados
¿Por qué cambiar a biopsia de TE?
Diagnóstico más robusto

9. 9
0
10
20
30
40
50
1-cell
biopsy
2-cell
biopsy
no
biopsy
live birth/ transfer
¿Por qué cambiar a biopsia de TE?
Menos dañino para los embriones/ Mejores resultados

10. 10
• RCT
• Morphological selection of 2 embryos for transfer
• One embryo randomly biopsied (D+3 / D+5)
• Fingerprinting analysis to determine which embryo implanted
N= 116 (46 cleavage; 70 blastocyst)
¿Por qué cambiar a biopsia de TE?
Menos dañino para los embriones/ Mejores resultados

11. 11
N= 116 (46 cleavage; 70 blastocyst)
¿Por qué cambiar a biopsia de TE?
Menos dañino para los embriones/ Mejores resultados
• Menor proporción de células biopsiadas
• Mejor tolerancia del embrión a la
manipulación tras la activación genómica

12. 12
…BUT are TE cell results representative of the ICM ploidy status?
Estudios clásicos de Evsikov & Verlinsky (1998)
(Fragouli et al., 2008)
Elevada concordancia entre MCI y células del TE
Células del TE darán lugar a tejido extraembrionario No reducción de la MCI
¿Por qué cambiar a biopsia de TE?

13. 13
¿Por qué cambiar a biopsia de TE?
Menos dañino para los embriones/ Mejores resultados

14. 14
Menos
embriones
biopsiados
Media edad (años)
Media de embriones
biopsiados (n)
38,7 39,3
8,3 4,7
2014/15 2015/16
Batching
•No se precisa analizar cada caso a medida que se biopsia
•Se requiere menos tiempo para diagnosticar el mismo
número de casos
•Mejor organización del laboratorio
Con estrategia de transferencia diferida
-3/4
Más económico
¿Por qué cambiar a biopsia de TE?

15. 15
Biopsia de célula única (D+3)
• Hasta el 70% de embriones mosaico
• No detección mosaicismoEUPLOIDE ANEUPLOIDE
ANEUPLOIDE
EUPLOIDE
Biopsia de trofectodermo (blastocisto)
• Menor incidencia de mosaicismo (30-35%)
• Biopsia de múltiples células Detección de ciertos niveles de mosaicismo
Detección de mosaicismo
¿Por qué cambiar a biopsia de TE?

16. 16
Poder de detección superior con NGS-PGS
NGS
Detección del 48% de
mosaicismo cr.12
aCGH
Mosaicismo del
cr.12 poco claro
(Yang et al., 2015)
Detección de mosaicismo
¿Por qué cambiar a biopsia de TE?

17. 17
Detección de mosaicismo
¿Por qué cambiar a biopsia de TE?
Healthy Babies after Intrauterine Transfer of Mosaic Aneuploid
Blastocysts
Mayo 2013-Julio 2014
3802 blastocistos biopsiados y analizados mediante a-CGH
181 blastocistos diagnosticados como mosaico (4.8%)
18 pacientes sin embriones euploides, tras recibir asesoramiento y firmar un
consentimiento específico, decidieron transferirse un embrión mosaico.
Se consiguieron 6/18 embarazos evolutivos (33.3%) con cariotipos normales
confirmados en vellosidades coriales
E. Greco & MJ. Minasi
NEJM November 2015

18. 18
Detección de mosaicismo
¿Por qué cambiar a biopsia de TE?
Why do euploid embryos miscarry? A case-control study comparing the
rate of aneuploidy within presumed euploid embryos that resulted in
miscarriage or live birth using NGS
Ciclos realizados entre Enero 2013-Mayo 2015
38 pacientes con SET de un embrión euploide que resultó en aborto +
38 pacientes control con SET de un embrión euploide que resultó en un nacido sano
blastocistos biopsiados y analizados mediante a-CGH
Reanálisis del DNA mediante NGS
31.6% de los embriones que dieron lugar a aborto → mosaico
vs
15.8 % de los embriones que dieron lugar a aborto → mosaico
Maxwell et al.
F&S 2016

19. 19
PERO…
•Se desconocen las implicaciones clínicas
• LIMITACIÓN del PGS
(Taylor et al., 2014)
“…The type of mosaicism and its clinical consequence is dependent upon a variety of aspects
including when and where […] is generated.
“…the consequences of mosaicism are widespread and unique for each incident.”
“…the discarding of potentially viable, euploid embryos may be occurring due to
mosaicism.”
Detección de mosaicismo
¿Por qué cambiar a biopsia de TE?

20. 20
Requerimientos para la implementación
CULTIVO EMBRIONARIO OPTIMIZADO
TECNOLOGÍA LÁSER
EMBRIÓLOGOS ENTRENADOS

21. 21
CULTIVO EMBRIONARIO OPTIMIZADO
1. Medio de cultivo
Mejor conocimiento de los requerimientos metabólicos para el desarrollo hasta
blastocisto
Medios secuenciales mejorados
Desarrollo de medios únicos (single-step media)
Manipulación
Estabilidad de las condiciones de cultivo
Cultivo optimizado → esencial para obtener el máximo número de
blastocistos de buena calidad y unos resultados óptimos del programa de
PGS
Requerimientos para la implementación

22. 22
2. Baja tensión de oxígeno (5%)
Walderström et al., 2008
CULTIVO EMBRIONARIO OPTIMIZADO
Requerimientos para la implementación

23. 23
3.Tecnología time-lapse
Seguimiento del desarrollo embrionario sin alterar las condiciones de cultivo
Evaluación morfocinética
Observación continua que permite la biopsia embrionaria en el momento
óptimo
Modelos morfocinéticos para predecir aneuploidía (Campbell et al., 2013)
• Grupos de probabilidad (alta, media, baja)
• Resultados no reproducibles por otros grupos (Ottolini et al., 2013; Kremer et
al., 2014; Rienzi et al., 2015)
Cultivo en time-lapse + PGS = Combinación ideal
(Yang et al., 2014)
CULTIVO EMBRIONARIO OPTIMIZADO
Requerimientos para la implementación

24. 24
Realización de la transición
APERTURA DE LA ZONA PELÚCIDA
MOMENTO DE LA TRANSFERENCIA
OPTIMIZACIÓN DE LA BIOPSIA

25. 25
• Mecánicamente, químicamente o mediante termolisis con láser
• 2 estrategias posibles:
Parriego et al., 2008
5-30 µm
APERTURA DE LA ZONA PELÚCIDA
Metodología

26. 26
APERTURA DE LA ZONA PELÚCIDA
Metodología

27. 27
D+3 D+5 / +6 (MCI visible)
APERTURA DE LA ZONA PELÚCIDA
Riesgo superior de dañar las células del
TE
Doble manipulación en el mismo día
Posibilidad de MCI cerca de/en la
apertura de la ZP
Apertura en el lado opuesto de la MCI
Menos embriones a los que realizar la
apertura de la ZP
Biopsia más temprana: Eclosión de los
blastocistos a medida que expanden
Metodología

28. 28
Estrategia de transferencia
CCS Resultados en < 24h (Handyside et al., 2013)
Transferencia en fresco
Transferencia diferida
Metodología

29. 29
• Asincronía en la formación de blastocistos
• Ausencia de blastocistos en D+5
• Ausencia de blastocistos euploides de D+5
• Blastocysts left to be biopsied, analyzed and cryopreserved
• Labor intensive
Biopsia de blastocisto en D+5 Resultados y transferencia en fresco en D+6
Transferencia en fresco
• Menor duración del ciclo
Estrategia de transferencia
Metodología

30. 30
Transferencia diferida
Biopsia de blastocisto y vitrificación D+5/+6/+7 Análisis y resultados dvi y
transferencia
• Biopsia de blastocisto en el momento óptimo
• Mejor organización en el laboratorio (de genética)
• Beneficios de la transferencia en un ciclo no estimulado (¿?)
• Más trabajo para el laboratorio de embriología
• Ciclo más largo
• Necesidad de disponer de un programa de vitrificación optimizado
• Superior tasa de aborto (¿?)
(reviewed by Evans et al., 2014)
Estrategia de transferencia
Metodología

31. 31
Biopsia D+3 Todos los embriones con ≥6 blastómeros biopsiados a la vez
D+5
D+6
D+7
1.8 biopsias / ciclo
Biopsias sucesivas a medida que los blastocistos empiezan a eclosionar
Estrategia de transferencia
Transferencia diferida
Metodología
Biopsia única en D+3 vs. Múltiples biopsias D+5/6/7

32. 32
Necesidad de disponer de un programa de criopreservación óptimo
Pacientes con un único blastocisto euploide!
Embrión muy preciado!
↑ Tasa de supervivencia tras la vitrificación de blastocistos biopsiados (Schoolcraft et
al., 2010; Zhu et al., 2013; Taylor et al., 2014)
>95%
Estrategia de transferencia
Transferencia diferida
apertura de la ZP → mejor exposición al crioprotector → deshidratación más
eficiente → mejores resultados tras criopreservación (Zhang et al., 2009)
Metodología

33. 33
OPTIMIZACIÓN DE LA BIOPSIA
Metodología

34. 34
Biopsia en D+3
Baja dificultad para un embriólogo experimentado
OPTIMIZACIÓN DE LA BIOPSIA
Metodología

35. 35
Pocas células herniando
El resto del embrion se mantiene
protegido dentro de la ZP
OPTIMIZACIÓN DE LA BIOPSIA
Momento óptimo de la biopsia
Metodología

36. 36
OPTIMIZACIÓN DE LA BIOPSIA
Impactos láser dirigidos a las uniones intercelulares conjuntamente con
tracción/aspiración
Metodología

37. 37
OPTIMIZACIÓN DE LA BIOPSIA
Impactos láser dirigidos a las uniones intercelulares conjuntamente con
tracción/aspiración
Metodología

38. 38
En algunas biopsias complicadas los disparos láser pueden no
ser suficientes debido a la dificultad de manipulación.
Flip
OPTIMIZACIÓN DE LA BIOPSIA
Metodología
IMPORTANTE !!! UN ÚNICO MOVIMIENTO SIMPLE y
CONTUNDENTE

39. 39
Hatching por la MCI
• Dejarlo desarrollar hasta un estadío más
avanzado
• Esperar hasta que esté completamente
eclosionado
• Inducir la eclosión total
Dificultades
Metodología
OPTIMIZACIÓN DE LA BIOPSIA

40. 40
Blastocisto totalmente eclosionado
• Blatocisto que no hernia en D+5 tardío
Totalmente eclosionado en D+6
• Más sensible tanto a la manipulación como a la
criopreservación
• Flip
Dificultades
Metodología
OPTIMIZACIÓN DE LA BIOPSIA

41. 41
3-8 células
Número de células biopsiadas
OPTIMIZACIÓN DE LA BIOPSIA
Metodología

42. 42
La probabilidad de disponer de blastocistos biopsiables disminuye con la edad
materna :
(Franasiak et al., 2013)
Menor cohorte
Más aneuploidías
Biopsia de TE: A tener en cuenta…
Ausencia de blastocistos biopsiables

43. 43
La acumulación de ovocitos/embriones puede suponer una mejora aumentando las
posibilidades de disponer tanto de blastocistos biopsiables como euploides
Se debe dar información completa a los pacientes acerca de la
posibilidad de no disponer de blastocistos biopsiables o euploides de
acuerdo con los datos disponibles
Ausencia de blastocistos biopsiables
Biopsia de TE: A tener en cuenta…

44. 44
Ciclos de biopsia
Experiencia I.U.Dexeus PGS Blastocisto
47.0% pacientes >1 estimulación
29.9Ciclos sin embriones transferibles (%)
4.75X blastocistos biopsiados/paciente
96Tasa de diagnóstico (%)
35.1Tasa de euploidía (%)
1510Blastocistos biopsiados (#)
49.1Tasa de blastocisto (%)
74.2Tasa de fecundación (%)
13.2X MII/paciente
2.4X punciones/paciente que acumula
39.3X edad de la mujer (años)
313Ciclos PGS (#)
Enero 2015- Junio 2016

45. 45
Resultados de las criotransferencias
53.3Tasa de embarazo evolutivo (%)
11.4Tasa de aborto (%)
89.4Gestaciones únicas (%)
58.9Tasa de implantación (%)
62.4Tasa de embarazo/transferencia (%)
1.17X blastocistos transferidos/paciente
99.1Tasa de supervivencia a la DVI (%)
1.18Blastocistos descongelados/paciente
235Blastocistos descongelados
38.4X edad de la mujer (años)
223Ciclos (#)
Experiencia I.U.Dexeus PGS Blastocisto
Enero 2015- Junio 2016

46. 46
Conclusiones
• El PGS en estadio de blastocisto ofrece un diagnóstico más fiable y mejores
resultados clínicos que el PGS en embriones tempranos, con un coste más
económico.
• Los requerimientos necesarios para obtener buenos resultados con PGS en
estadío de blastocisto son: un sistema de cultivo optimizado, tecnología laser
y embriólogos experimentados
• Existen distintas aproximaciones relacionadas con la política de
transferencia, la apertura de la ZP y las técnicas de biopsia que proporcionan
buenos resultados.
• Se han propuesto fuentes de DNA alternativas a las células del
trofectodermo (BF) .

47. 47
Thank you
monpar@dexeus.com