Молекулярні механізми пошкодження та загибелі кардіоміоцитів при ішемії-реперфузії. Пре- та посткондиціонування. Molecular mechanisms of cardiomyocytes injury and death at hypoxia-reoxygenation. Pre- and postconditioning

1. Ішемічна хвороба серця.
Інфаркт міокарда
Лектор – к.м.н., старший науковий співробітник Інституту
фізіології імені О.О.Богомольця НАНУ
Нагібін Василь

2. William Heberden
1710 — 1801
В 1768-му році вперше дав детальний
опис симптомів стенокардії
Стенокардія (від грецького στένωσις –
звуження)
Angina pectoris (від лат. Angere -
стискати)
Грудна жаба (в англ. Quinsy – гнійний
тонзилит, протороманський gaba – зоб
у птахів, стравохід) застаріла назва

3. ІШЕМІЧНА ХВОРОБА СЕРЦЯ –
мультифакторне захворювання,
що характеризується
абсолютним або відносним
порушенням кровопостачання
міокарда внаслідок ураження
коронарних артерій серця
1. Раптова коронарна смерть
2. Стенокардія
3. Інфаркт міокарда
4. Аритмії
5. Постінфарктний кардіосклероз
КЛІНІЧНІ ФОРМИ ІХС

4. ФАКТОРИ РИЗИКУ
ІШЕМІЧНОЇ ХВОРОБИ СЕРЦЯ
ЕКЗОГЕННІ ЕНДОГЕННІ
Алельний
поліморфізм
генів - SNP
Переїдання
(дисліпідемії, ожиріння,
цукровий діабет ІІ
типу)
Стрес, “невідреаговані
емоції” (артеріальна
гіпертензія)
Паління
Гіподинамія

5. ІШЕМІЧНАІШЕМІЧНА
ХВОРОБА СЕРЦЯХВОРОБА СЕРЦЯ
ЯК ПОЛІГЕННЕЯК ПОЛІГЕННЕ
ЗАХВОРЮВАННЯЗАХВОРЮВАННЯ
PPAR-α, γ, δ
CEPT
Печінкова
ліпаза
Ліпопротеїд-
ліпаза Ангіотензиноген
AПФ
Адипонектин
5-ліпоксигеназа
Фактор
XIIIФактор V
CD14
Рецептор
ox-LDL
Параоксоназа
Апо-
ліпопротеїни
eNOS
Епоксигеназа
Рецептор
ангіотензину ІІ
Фактор VII
Toll-рецептор

6. ФУНКЦІОНАЛЬНЕ ЗНАЧЕННЯ АЛЕЛЬНОГО
ПОЛІМОРФІЗМУ (T-786
→C) ПРОМОТОРУ ГЕНА еNOS
0
10
20
30
40
50
%
T/T T/C C/C
χ2
= 10.01
P < 0.05
0
0,5
1
1,5
2
T/T T/C C/C
умовніодиниці
Розподіл алельних варіантів Рівень експресії мРНК eNOS
*
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
T/T T/C C/C
UF/10
6
клітинххв
TT
CT+CC
0 50 100 150 200 250 300 350 400
время, дни
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
%больныхбезсобытий
p=0,042
Активність продукції NO Виживання хворих
*

7. Головні ланки патогенезу ІХС
ІШЕМІЯ – це типове порушення периферічного
кровообігу, за якого зменшується
кровонаповнення органу через недостанє
надходження крові артеріальними судинами.
• Гіпоксія
• Зменшення
надходження
глюкози та інших
поживних речовин
• Зменшення
відведення
метаболітів.

8. Головні ланки патогенезу ІХС
РЕПЕРФУЗІЯ – це відновлення кровопостачання
органу
• Реоксигенація
• Утворення вільних
радикалів
•Перекисне
окиснення ліпідів і
пошкодження
мембран
• Надходження
нейтрофілів

9. Патогенез болю - головного
симптому ІХС
Пошкодження клітини і вторинна
альтерація – це запалення.
Медіатори запалення посилюють
чутливість больових рецепторів
Р2Х – рецептори до позаклітинного
АТФ та АДФ
ASIC (Acid-Sensing Ion Channels ) –
канали, чутливі до зниження рН
TRP (Transient receptor potential) –
рецептор-керовані катіонні
канали, чутливі до різних
стимулів у тому числі до
розтягнення, змін об’єму клітини,
осмотичного тиску тощо.

10. ДІАГНОСТИКА
Біль
ЕКГ
Маркери некрозу клітин (ЛДГ, зараз
тропонін)

11. Новий діагностичний набір для
визначення гострого інфаркту міокарда
(B R A H M S copeptin us)
КОПЕПТИН –
маркер утворення
вазопресину
(який є
нестабільним),
що свідчить про
падіння
серцевого викиду
ТРОПОНІН –
маркер некрозу
кардіоміоцитів

12. МЕХАНІЗМИ ІШЕМІЧНОГО УШКОДЖЕННЯ
КАРДІОМІОЦИТІВ
ЗАГИБЕЛЬ КЛІТИНИЗАГИБЕЛЬ КЛІТИНИ
Зменшення надходження кисню
Пригнічення аеробних
шляхів отримання енергії
Активація гліколізу
Накопичення лактату
Ацидоз
Активація Na-H транспортеру
Активація Na-Са транспортеру
Накопичення Са++
в клітині
Контрактури
міофібрил
Накопичення жирових
кислот
Детергентоподібна дія
вільних жирових
кислот
Активація фосфоліпаз,
ліпоксигеназ та ін.
ферментів
Інактивація
мембранних
ферментів

13. МЕХАНІЗМИ РЕПЕРФУЗІЙНОГО УШКОДЖЕННЯ
КАРДІОМІОЦИТІВ
ЗАГИБЕЛЬ КЛІТИНИ
Відновлення надходження кисню
Активація аеробних
шляхів отримання енергії
Надходження активованих
лейкоцитів в осередок
ішемії
Утворення вільних радикалів
на тлі зменшення вмісту
антиоксидантних ферментів
Активація протеолізу
Ушкодження мембранних
білків
Ушкодження мембранних
ліпідів

14. ЗАГИБЕЛЬ КАРДІОМІОЦИТІВ
ЗАПРОГРАМОВАНА НЕЗАПРОГРАМОВАНА
АПОПТОЗ АУТОФАГІЧНА СМЕРТЬ ОНКОЗ
(НЕКРОЗ)
Варіанти загибелі клітин
• Всі ці види клітинної смерті спостерігаються
в міокарді при ішемії-реперфузії

15. МІТОХОНДРІЇ – ГОЛОВНІ ОРГАНЕЛИ З
“УТИЛІЗАЦІЇ” КИСНЮ – ВІДПОВІДАЮТЬ ЗА
ЗАГИБЕЛЬ КЛІТИНИ
ПОХОДЖЕННЯ МІТОХОНДРІЙ

16. Апоптоз
В перекладі з грецької – опадіння, листопад

17. Механізми розвитку
Мембранні Мітохондріальні Ядерні
•Рецептори смерті –
TNF, Fas/APO-1
(CD95), DR3/WSL
•Внутрішньоклітиннй
домен рецепторів
(DD) безпосередньо
активує каспази
•Пошкодження
генетичного матеріалу
та активація р53
•Ферменти репарації
(mismatch repair) здатні
запускати р53-
незалежний апоптоз
Апоптоз

18. Мітохондріальна пора структура, що забезпечує
перехід мембран мітохондрій у стан підвищеної
проникності
VDAC – вольтаж-
Залежний аніонний
канал;
ANT – аденін
нуклеотид
транслоказа;
Циклофілін Д,
креатинкіназа, тощо
Білки родини BCL-2 (B
cell lymphoma)
регулюють
проникність
апоптичної пори

19. Апоптоз. Мітохондріальні механізми
Ендонуклеаза G
Bcl-2,
Bcl-XL
Прокаспаза 9
Apaf
Прокаспаза 3
Апоптоз
Каспаза 3
Апоптосома
Smac/DIABLO
Htr2/Omi
Протеасома
Убіквітин
Протеасомна
деградація
інгібіторів
апоптозу
Міжнуклеосомальна
фрагментація ДНК
Bax, Bad та ін.
Ішемія-реперфузія
Окисний стрес Порушення окисного
фосфорилювання

20. Основні механізмиОсновні механізми
ушкодження клітин приушкодження клітин при
аноксії-реоксигенаціїаноксії-реоксигенації
ВІЛЬНОРАДИКАЛЬНІВІЛЬНОРАДИКАЛЬНІ ЛІПІДНІЛІПІДНІ
ПРОТЕОЛІТИЧНІПРОТЕОЛІТИЧНІ
Лізосомний
протеоліз
Протеасомний
протеоліз
КИСНЕВА ДЕПРИВАЦІЯКИСНЕВА ДЕПРИВАЦІЯ КАЛЬЦІЄВІКАЛЬЦІЄВІ

21. Відкриття убіквітин-залежного
протеасомного протеолізу
Нобелівська премія в галузі хімії за 2004 рік
Aaron
Ciechanover Avram Hershko Irwin Rose

22. Будова протеасоми
19 S субодиниця
20 S субодиниця
β - кільце
α - кільце

23. Послідовність подій при
убіквітин-залежному
протеасомному протеолізі
Убіквітин
Білок-мішень
E1
Поліубіквітинізований
протеїн
Продукти деградації

24. Протеоліз
модифікованих при
оксидативному стресі
білків
Деградація білків
цитоскелету
Протеоліз актину,
міозину
Експресія молекул
адгезії
Деградація білків з
коротким терміном
напівжиття (еNOS,
адренорецептори, Са-
канали та ін.)
Апоптоз. Участь протеасоми
Протеоліз
проапоптотичних
білків
Протеоліз
антиапоптотичних
білків

25. Апоптоз. Електронномікроскопічне
дослідження кардіоміоцитів
Контроль
Апоптоз

26. Визначення різних варіантів загибелі
клітин за допомогою флуорисцентних
барвників
АПОПТОЗ
Хьохст позитивні
фрагментовані ядра
НЕКРОЗ
Пропідіум-іодид
позитивні ядра
ЖИВІ
Хьохст позитивні
ядра

27. Подвійне забарвлення
клітин барвниками Hoechst
та пропідіум іодид.
Флуорисцентна мікроскопія,
зб. 700х
Апоптоз. Цитологічне дослідження
культури кардіоміоцитів
Контроль
Аноксія-реоксигенація Вплив інгібітору протеасоми

28. Апоптоз. Кількість загиблих клітин при
аноксії-реоксигенації та за впливу
протеасомних інгібіторів
0
2
4
6
8
10
12
Контроль Аноксія Аноксія-
реоксигенація
cL 5 μM MG-132 10
μM
Кількістьклітин,%
*
*
*

29. Аутофагія
(від грецького auto та phagos –
самопожирання)

30. Види аутофагії

32. Мітохондрії та аутофагія

33. Джерело вільних
амінокислот
Деградація
рецепторів факторів
росту
Деградація білків з
коротким терміном
напівжиття (еNOS,
адренорецептори, Са-
канали та ін.)
Аутофагія. Участь протеасоми
Протеоліз білків-
регуляторів
аутофагії ?

34. Аутофагія. Флуорисцентна мікроскопія
кардіоміоцитів (монодансилкадаверин)
Контроль Аноксія-реоксигенація
Метиладенин, 100мМІнгібітор протеасоми

35. Аутофагія. Електронна мікроскопія
кардіоміоцитів
Я
Різні стадії розвитку аутофагічної смерті.

36. Аутофагія. Кількість загиблих клітин
при аноксії-реоксигенації та за впливу
протеасомних інгібіторів
0
5
10
15
20
25
Контроль А/Р Лактацистин MG132
Аутофагическиеклетки,%
*
*
*

37. ЗНАЧЕННЯ ЗАПРОГРАМОВАНИХ ВАРІАНТІВ
КЛІТИННОЇ СМЕРТІ
Попередження вторинної альтерації (загибелі
суміжних клітин)
Локалізація ураження
“Виграш часу”

38. У пері-інфарктній ділянці на ранньому етапі
інфаркту знаходяться клітини, в процесі реалізації
апоптотичної та аутофагічної програм
Запрограмована клітинна загибель є фактором
попередження вторинної альтерації і таким чином є
протекторноим механізмом для цілого організму

39. Співвідношення різних видів
клітинної загибелі
• Інігібітор каспази 3 – N-acetyl-Asp-Glu-
Val-Asp-al (DEVD) (100 мкМ)
• Інгібітор аутофагії – N-3-метиладенін
(100мМ)
• Аноксія-реоксигенація та інгібітори
протеасоми

40. Співвідношення різних видів
клітинної загибелі
Вплив аноксії-реоксигенації
K
A/R A/R+DEVDK
A/R+DEVD+MA
A/R A/R+DEVD
A/R+DEVD
+MA

41. Різке збільшення кількості некротичних
клітин за умов блокування
програмованих шляхів клітинної загибелі
при ішемії-реперфузії кардіоміоцитів

42. Некроз

43. Некроз – трігер запалення та
вторинної альтерації

44. Некроз. Участь протеасоми
Протеоліз
супероксиддисмутази Протеоліз каталази

45. АктиваціюАктивацію
фагоцитів прифагоцитів при
асептичномуасептичному
запаленнізапаленні
забезпечуютьзабезпечують
МІТОХОНДРІЇМІТОХОНДРІЇ
Nature 464, 104-107
(4 March 2010)

46. Запалення та ІХС
нейтрофільні позаклітинні пастки

47. Інфаркт міокарду та NETs
“There is an
inflammation, lets
go there”
Proinflammatory
factors
Normal
conditions
Myocardial
infarction
Situation after myocardial
infarction
“There is an
inflammation, lets
go there”
Proinflammatory
factorsThrombosis
induction

48. Fluorescent microscopy of PMN using Hoechst dye
control PMA
PMA
PMA was used for activatio9n of
NETs formation in dose 5 nM for 3
hours
Hoechst was used for detection of
DNA at fluorescent microscopy
40x

49. DNA concentration in media after cultivation of
200 000 neutrophils without (control) or with
PMA
0
5
10
15
20
25
30
35
control PMA
%ofDNAreleased

50. The percentage of necrotic cardiomyocytes in coculture
with PMN at different conditions of NETs formation (%)
0
5
10
15
20
25
30
контроль PMA лактацистин PMA+лактацистин

51. Запалення та ІХС: ліпоксигеназа

52. РНК-інтерференція – новий метод
лікування інфаркту міокарда
Silencing ALOX5 siRNA 5`-GUACAGGAAGGGAACAUUUUU-3` 5`-UUCAUGUCCUUCCCUUGUAAA-3`
Вперше розроблено метод специфічного заглушення гена 5-ліпоксигенази таВперше розроблено метод специфічного заглушення гена 5-ліпоксигенази та
доведено його протективне значення при експериментальному інфаркті міокардадоведено його протективне значення при експериментальному інфаркті міокарда
0
10
20
30
40
Control
Scrambled
Control
interference
A-R
scrambled
А-R
interference
Кількістьклітин,%
Некротичні клітини
1 2
Відноснийрівень
ALOX-5mRNA
Scrembled ALOX5 siRNA
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Площанекротичноїділянки,
%
Уявна
операція
Ішемія-
реперфузія
І-Р +
scrembled
siRNA
І-Р + ALOX5
siRNA
Розмір зони інфаркту
*
*
*
Рівень експресії мРНК

53. Лікування
• СПОСІБ ЖИТТЯ
• МЕДИКАМЕНТОЗНЕ
• Нітрогліцерин
• Блокатори кальцієвих каналів
• Бета-адрено блокатори
• Антиаґреганти (інгібітори циклооксигенази,
рецепторів АДФ на тромбоцитах, тощо)
• ХІРУРГІЧНЕ (стентування, шунтування)

54. Явища прекондиціонування
та посткондиціонування

55. ЕНДОГЕННІ ПРОГРАМИ ЗАХИСТУ СЕРЦЯ
ПРЕКОНДИЦІОНУВАННЯ - феномен підвищеної
стійкості міокарда до ішемії-реперфузії, який виникає
за рахунок попереднього впливу которкочасної ішемії
або інших ушкоджуючих факторів
ПОСТКОНДИЦІОНУВАННЯ - феномен підвищеної
стійкості міокарда до реперфузії, який виникає за
рахунок впливу ушкоджуючих факторів після ішемії
(перед початком тривалої реперфузії)

56. ХІМІЧНІ
засоби для інгаляційного наркозу (десфлуран,
ізофлуран, галотан), опіати, інгібітори протеасоми
активатори АТФ-чутливих калієвих каналів та ін.
ФАКТОРИ ІНДУКЦІЇ
ПРЕ- ТА ПОСТКОНДИЦІОНУВАННЯ
ФІЗИЧНІ
гіпоксія, гіпероксія, гіпертермія
БІОЛОГІЧНІ
ліпополісахариди бактерій
ЕНДОГЕННІ:
ішемія, ішемія-реперфузія, аденозин, NO, брадикінін,
ацетилхолін та ін.
ЕКЗОГЕННІ:

57. АТФ-чутливі калієві канали
мітохондріальної мембрани

58. Наслідки відкриття АТФ-чутливих
калієвих каналів мітохондрій
За умов ішемії:
• Гіперполяризація зовнішньої мембрани
• Підвищення порогу збудливості
• Скорочення тривалості фази плато ПД
• Зменшення функціонального навантаження
За умов прекондиціонування:
• Деполяризація мітохондріальної внутрішньої
мембрани
• “набухання” мітохондрій (свелінг)
• Зменшення концентрації кальцію

59. Свелінг мітохондрій з одного боку оптимізує дихальний
ланцюг, а з іншого призводить до утворення невеликої
кількості вільних радикалів, що стимулює антиоксидантні
системи перед ішемією

60. О.О.МойбенкоО.О.Мойбенко

61. Дякую за увагуДякую за увагу