Prezentacija je u skladu sa planom i programom predmeta Biologija matčnih čelija i čelijska signalizacija na doktorskim studijama Stomatološkog fakulteta u Beogradu.

1. STOMATOLOŠKI FAKULTET
UNIVERZITET U BEOGRADU
Matične ćelije
Prof.dr Vesna Danilović

2. stem ćelije

3. definicija
Matične ćelije predstavljaju nespecijalizovane
ćelije koje imaju neograničenu sposobnost
samoobnavljanja sopstvene populacije i
mogućnost diferenciranja u veći broj
specijalizovanih ćelija.

4. Najvažnije osobine
1. Neograničena sposobnost samoobnavljanja
sopstvene populaciji
2. Mogućnost da se diferenciraju u različite ćelijske
tipove (potentnost)

5. broj deoba
fibroblasta čoveka in
vitro je ograničen
Hayflick-ov limit
Hayflick L. 1965

6. • Samoobnavljanje: obavezna asimetrična
deoba, jedna ćelija ostaje identična majci, a
druga se dalje diferencira.
• Stohastička diferencijacija: jedna ćerka ćelija
razvija se u pravcu terminalno diferencirane
ćelije, a druga se simetrično deli na dve
identične stem ćelije

7. Life Sciences-HHMI Outreach.
Copyright 2006 President and Fellows
of Harvard College.
differentiated
cell
Self-renewal
Stem Cell
CellStem
Differentiation

8. Hijerarhija stem ćelija
• Totipotentne– imaju sposobnost diferencijacije u
sve ćelijske tipove uključujuči i ekstraembrionalne
strukture.
• Pluripotentne – imaju sposobnost diferencijacije
u ćelije sva tri klicina lista.
• Multipotentne – imaju sposobnost diferencijacije
u različite somatske ćelije.
• Unipotentne – imaju sposobnost diferencijacije u
jedan tip ćelije.

10. Tipovi stem ćelija
Embrionalne – potiču iz unutrašnje ćelijske mase
blastociste.
Fetalne – potiču iz placente ili pupčane vrpce
Somatske/adultne – nediferencirane ćelije u
odredjenim delovima “zrelih” tkiva.
iPS ćelije – indukovane pluripotentne stem ćelije
generisane postupkom REPROGRAMIRANJA
diferenciranih ćelija (npr. kloniranje)

11.  embrionalne stem ćelije
 embrionalne ćelije karcinoma
 embrionalne germinativne
ćelije
Vrste pluripotentnih stem ćelija

12. PRVA NEDELJA RAZVIĆA
brazdanje zigota, morula, blastocista, decidualna
reakcija
• 1. dana – 2 blastomere
• 2. dana – 4 blastomere
• 4. dana – 16/32
blastomere, obavijene
zonom pelucidim -
morula

13. 5. dana formira se blastocista
• šupljina – blastocela
• unutrašnja ćelijska
masa - embrioblast –
embrion, amnion,
alantois i žumančana
kesa
• omotač – trofoblast –
deo placente i horion

14. Embrionalne vs adultne stem ćelije
pro et contra
• Totipotentne
• Veliki broj
• Izazivaju imunu reakciju
• Pravne i etičke dileme
• Multi/pluripotentne
• Limitiran broj, teška
izolacija
• Nema imune reakcije –
autologne ćelije

15. embrionalne stem ćelije - protiv
• Teško ih je izolovati i kultivisati in vitro
• Teško je održati čistu kulturu
• Potencijal za tumorogeni rast i destrukciju tkiva
(sličnost sa adultnim stem ćelijama)
• Problemi sa funkcionalnom diferencijacijom
• Imunološka netolerancija
• Skromni rezultati na animalnim modelima
• Etički problemi

16. • Upotreba genetski i epigenetski nestabilnih
embrionalnih stem ćelija štetna je po ljudsko
zdravlje,

17. iPS ćelije – indukovane pluripotentne
stem ćelije: reprogramiranje
Laboratorijski postupak kojim se funkcionalno
zrele ćelije “reprogramiraju” i dobijaju
karakteristike embrionalnih stem ćelija
(indukovane pluripotentne stem ćelije IPS)

18. Nobelova nagrada za fiziologiju i
medicinu 2012.

19. “Magic four”
uvodjenjem samo četiri gena: OCT3/4, Sox2,
c-Myc, Klf4 postiže se dediferenciranje
(Takahashi i Yamanaka, 2006)

20. Lokalizacija adultnih stem ćelija – uloga
“niše”
• Adultne stem ćelije i progemitorne ćelije
naseljavaju odredjena područja koja se
označavaju kao ćelijske niše
• Niše funkcionišu kao mikrosredina koja
reguliše rast i diferencijaciju rezidentnih stem
ćelija
• Mutacije ćelija, signali koje primaju i promene
u mikrosredini aktiviraju stem ćelije

21. Uloga “niše”
• Mirovanje
• Samoobnavljanje
• Diferencijacija
• Migracija
• Apoptoza

22. Uloga niše

23. Homeostaza u niši: ravnoteža izmedju
samoobnavljanja i diferencijacije
• Veza izmedju ćelija niše, stem ćelija i
komponenti matriksa ostvaruje se preko
adhezivnih proteina- kadherina i β katenina
• Niša generiše faktore koji učestvuju u kontroli
broja, proliferacija i determinacije stem ćelija.
• Razvojni signalni putevi i molekuli hh, Wnt,
BMPs, FGF i Notch imaku ključnu ulogu u
ravnoteži izmedju nediferenciranog i
diferenciranog stanja.

24. • U normalnim uslovima niša čuva stem ćelije u
“mirujućem” stanju, tako što obezbedjuje
antiproliferativne signale.
• Bilo koja mutacija koja dovodi do rezistencije
na antiproliferativne signale ili nezavisnost od
njihovog delovanja može prouzrokovati
nekontrolisanu proliferaciju ćelija i
potencijalnu tumorogenezu

25. • Signali iz niše sprečavaju proliferaciju i
diferencijaciju.
• Mutacije iz ćelija niše ili stem ćelija dovode do
nekontrolisane proliferacije i moguće tumorogeneze.

26. • TGF β (transformig growth beta) i BMP (bone
morphogenetic proteins) imaju snažan
antiproliferativni efekat na ćelije.
• Wnt molekuli promovišu proliferaciju ćelija.
• Narušavanje odnosa BMP/wnt je narušavanje
odnosa izmedju antiproliferativnih i
proliferativnih signala,

27. Hemijski faktori niše
• Hormoni (npr parathormon, koji trigeruje BMPs koji
ispoljavaju uticaj na diferencijaciju osteoblasta) Yu et
al. , 2012.
• Joni (npr. kalcijum, koji utiče na naseljavanje koštane
srži hemopoetskim ćelijama) Wang LD et al., 2011.
• ROS molekuli (reactive oxidative specimens), koji u
malim koncentracijama promovišu samoobnavljanje
progenitornih neuronskih ćelija. Kennedy et al.,
2012.

28. Fizički faktori niše
• 1. oblik ćelije (npr. okrukli oblik favorizuje
adipogenezu, dok ljuspast osteogenezu) McBeath
et al., 2004.
• 2. elasticitet ECM (npr. elasticitet koštanog tkiva
10-100 Kpa favorizuje osteogenezu, dok
elasticitet mozga od nekoliko stotina Kpa
favorizuje neurogenezu) Engler AJ, et al., 2006.
• 3, topografska površina ECM (npr.
nanotopografske karakteristike skafolda kod
koštanih supstituenata favorizuju osteogenezu)
Dalby et al., 2007.

29. Fizički faktori niše
• 1. sile istezanja i kompresije (Terraciano et al.,
2007)
• 2. hidrostatski pritisak (Liu et al., 2010)
• 3. sila gravitecije (Yuge et al., 2006)
• 4. elektromagnetno polje (Tsai et al., 2009)
• 5. parcijalni pritisak kiseonika (Serena et al.,
2009)

30. Osobine adultnih stem ćelija:
Dediferencijacija
osobina somatskih MĆ/progenitornih ćelija da se vrate
u prethodni, primitivniji stadijum, a zatim da se
difereciraju u pravcu druge ćelijske linije

31. Transdiferencijacija:
sposobnost adultnih MĆ da se direktno, bez
nakova dediferencijacije, diferenciraju u
pravcu odredjenih ćelijskih linija

32. plasticitet
Osobina MĆ da se transdiferenciraju u različite (brojne)
ćelijske tipove pod uticajem transkripcionih regulacionih
mehanizama. Heyworth C et al., 2002

33. 1961. godina, tad je počelo…
Ernest Mc Culloh i
James Till (1961) – prva
funkcionalna
klasifikacija MĆ u
hemopoetskom sistemu
što je postavilo temelj
za dalja istraživanja u
oblasti MĆ

34. Matične ćelije hematopoeze
Najbolje proučene matične ćelije
Jedine koje se primenjuju u terapijske svrhe

35. Pogled unazad
• Kleinsmith i Pierce (1964) – otkriće MĆ u
teratokarcinomima
• Evans i Kaufman (1981); Martin (1981) –
izolovane su MĆ iz mišijih embriona i opisana
je tehnika njihove kultivacije in vitro
• Thomson i sar. (1998) – izolovane su i
kultivisane MĆ iz humanih blastocista

36. Pogled unazad
• Rebinhuoff i sar (2000); Cown i sar (2004) – ćelije
iz humane blastociste koje se u diferencijacionom
medijumu razvijaju u embrioidna telašca
• Korišćenjem ove metode dobijen je veliki broj
linija embrionalnih matičnih ćelija koje imaju
normalan kariotip, imaju visoku telomeraznu
aktivnost, eksprimiraju markere karakteristične za
matične ćelije i održavaju potencijal za
diferencijaciju in vitro i in vivo.

37. Membranski markeri embrionalnih
ćelija
1. SSEA markeri (stage specigic embryonic
antigen). SSEA-3 je najizraženiji kod
najprimitivnijih embrionalnih ćelija, dok je
SSEA -1 karakterističan za proces
diferencijacije
2. TRA (tumor rejection antigen)
3. CD9 – (cluster of diferentiation)
4. HLA-1 (human leukocyte antigen)

38. Vrste adultnih stem ćelija
Hemopoetske stem ćelije: krv i imuni sistem
Mezenhimalne stem ćelije: koštano tkivo, hrskavice,
masno tkivo, tetive/ligamenti
Neuralne stem ćelije: neuroni, glija ćelije
Epitelne stem ćelije: koža, sluznice

39. Mezenhimne matične ćelije (MMĆ)
• Freidenstain i sar, 1968 – predpostavio
postojanje multipotentnih prethodnika
nehemopoetskih MĆ
• Owen, 1985 – sistem stromalnih ćelija koje
imaju mogićnost samoobnove i diferenciranja
u različite ćelije (osteociti, hondrociti, adipociti
i glatke mišićne ćelije)
• Caplan, 1991 – prvi upotrebio termin
Mezenhimalne matične ćelije

40. Funkcionalne ososbine MMĆ
• MMĆ ne naseljavaju samo tkiva mezenhimnog
porekla, a njihov potencijal za diferencijaciju je
daleko širi (neuroni – ektoderm, insulociti -
endoderm), tako da naziv ne odražava njihovu pravu
prirodu.
• Ima ih u placenti, krvi pupčanika, masnom tkivu,
pulpi zuba, potpornom aparatu zuba, koštanoj srži.
• Pokazuju niz sličnosti, ali i značajne razlike (Kern,
2006, Stenderup, 2003.)

41. Standardi za definisanje humanih MMĆ
International Society for Cellular Therapy/
ISCT:
• 1. adherentnost za plastičnu podlogu pri
standardnim uslovima kultivisanja
• 2. specifična ekspresija površinskih markera
• 3. multipontentni potencijal diferencijacije (tri
mezenhimalne linije: osteoblasti, hondroblasti i
adipociti)

42. Funkcionalne ososbine MMĆ
• Krajem devedesetih godina prošlog veka
dokazana je njihova sposobnost diferencijacije
u ćelije mezodermalnog, ali i ektodermalnog i
endodermalnog porekla (Pittinger i sar. 1999)

43. Mobilisane MMĆ, pod uticajem faktora sredine
ispoljavaju najmanje tri uloge u regeneraciji tkiva:
• 1.uloga tkivno specifične ćelije - npr. miokardiocite,
glatke mišićne ćelije i endotelne ćelije (Gojo i sar.
2003; Psaltis i sar. 2008.)
• 2. funkcionalnih ćelija koje stvaraju mikrosredinu,
neophodnu za regeneraciju (Aronin i Tuan, 2010)
• 3. regulatorne ćelije koje ispoljavaju trofičku i
imunomodulatornu ulogu (Ankrum i Karp, 2010)

44. MMĆ poseduju antiinflmatorna i
imunomodulatorna svojstva
• Nizak stepen ekspresije histokompatibilonog
kompleksa (MHC) ima za posledicu izostanak
aktivacije limfocita (Le Blanc i Rindgen, 2007)
• MMĆ suprimiraju aktivaciju i proliferaciju T i B
Ly ( Jonnes i sar, 2007).
• MMĆ luče antiinflamatorne i antiapoptotične
molekule (Le Blanc i Rindgen, 2007)

45. Mogućnost korišćenja transplantacije
MMĆ u terapiji
• GVHD (graft versus host disease)
• Autoimune bolesti: diabetes tipa 1 (Florina i
sar., 2009); reumatoidni artritis (Bouffi i sar.,
2009); sistemski lupus eritematozus (Zhang i
sar., 2010); multipla skleroza (Martino i sar.,
2010)

46. Uloga MMĆ u regeneraciji
• Trofička uloga se ostvaruje preko trofičkih
molekula: glikoproteina EEM, citokina i faktora
rasta (Ankrum i Karp, 2010)
• Trofička uloga se ostvaruje putem direktnog
kontakta sa ćelijama tkiva koje su naselile. Taj
mehanizam nije sasvim razjašnjen (Plotnikov i
sar., 2008)
• U inicijalnim fazama povrede onemogućena je
diferencijacija MMĆ (van Poli i sar., 2008.)