Master en Ciencia y Tecnologia Ambiental_Spain_2008_Alfredo Garcia Fernandez
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- 1. ESTUDIO DEL TAMAÑO DEL GENOMA YESTUDIO DEL TAMAÑO DEL GENOMA Y COMPOSICIÓN CROMOSÓMICA DE LASCOMPOSICIÓN CROMOSÓMICA DE LAS POBLACIONES DEPOBLACIONES DE Silene ciliataSilene ciliata EN EL PARQUEEN EL PARQUE NATURAL DE CUMBRE, CIRCO Y LAGUNAS DENATURAL DE CUMBRE, CIRCO Y LAGUNAS DE PEÑALARA.PEÑALARA. ALFREDO GARCÍA FERNÁNDEZALFREDO GARCÍA FERNÁNDEZ JUNIO 2008 MASTER EN CIENCIA Y TECNOLOGÍAJUNIO 2008 MASTER EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA AMBIENTALAMBIENTAL
- 2. INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN 1. Alta montaña mediterránea en el marco del cambio climático. 2. Montañas como refugio de la biodiversidad. 3. Gradiente altitudinal como fuente de variabilidad. 4. Gradiente altitudinal, perspectivas de estudio.
- 3. INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN 1. Tamaño del genoma: Herramienta para la genética y evolución. 2. Tamaño del genoma y citometría de flujo. 3. Tamaño del genoma: aplicaciones. 4. Tamaño del genoma, estudio en los gradientes altitudinales.
- 4. INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN 1. Silene ciliata como especie modelo y adaptación local 2. Adaptación local desde perspectiva genética. 3. Dotación cromosómica de Silene ciliata variable y tamaño del genoma desconocido. 4. Especie de alta montaña, limitaciones en su estudio.
- 5. OBJETIVOSOBJETIVOS 1. Determinación de los niveles de ploidía de Silene ciliata en las poblaciones del Sistema Central. 2. Estimar el tamaño del genoma de Silene ciliata. 3. Evaluar la variación del tamaño del genoma en las poblaciones de Silene ciliata dentro de un gradiente altitudinal. 4. Evaluar la viabilidad de almacenar tejidos en gel de sílice, como alternativa al protocolo estándar.
- 6. MATERIAL Y MÉTODOSMATERIAL Y MÉTODOS ±
- 7. MATERIAL Y MÉTODOSMATERIAL Y MÉTODOS 1. Recuentos cromosómicos. 2. Citómetro de flujo
- 8. RESULTADOS Y DISCUSIÓNRESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. RECUENTOS CROMOSÓMICOS MORRENA DOS HERMANAS PEÑALARA Familia A 2n=24 Familia A 2n=24 Familia A 2n=24 Familia B 2n=24 Familia B 2n=24 Familia B 2n=24 Familia C 2n=24 Familia C 2n=24 Familia C 2n=24 Familia D 2n=24 Familia D 2n=24 Familia D 2n=24 Familia E 2n=24 Familia E 2n=24 Familia E 2n=24 Familia F 2n=24 Familia F 2n=24 Familia G 2n=24 Familia G 2n=24 Familia H 2n=24 Familia H 2n=24
- 9. RESULTADOS Y DISCUSIÓNRESULTADOS Y DISCUSIÓN • Tamaño medio: 1.76 ± 0.06 picogramos. • 3.8% Coeficiente de variación. 2. Citometría de flujo
- 10. RESULTADOS Y DISCUSIÓNRESULTADOS Y DISCUSIÓN 2. Citometría de flujo • Variación intrapoblacional del tamaño del genoma. • Causas de variación intraespecífica desconocidas Diferentes grados y tipos de estrés Modelo de equilibrio mutacional Acción de elementos transponibles • Retrotransposón “Retand” Knight et al. 2005
- 11. RESULTADOS Y DISCUSIÓNRESULTADOS Y DISCUSIÓN 3. Tamaño del genoma analizado en gel de sílice • 1.72 ± 0.06 picogramos • 3.6% coeficiente de variación
- 12. CONCLUSIONESCONCLUSIONES • LAS POBLACIONES DE Silene ciliata EN EL SISTEMA CENTRAL SON DIPLOIDES CON DOTACIÓN CROMOSÓMICA 2n=24. NO SE OBSERVARON FENOMENOS DE ANEUPLOIDÍA O POLIPLOIDIA AUNQUE NO SON TOTALMENTE DESCARTABLES. • EL TAMAÑO DEL GENOMA DE Silene ciliata ES DE 1.76 ± 0.06 PICOGRAMOS. • OBSERVAMOS VARIACIÓN EN EL TAMAÑO DEL GENOMA ENTRE LAS POBLACIONES DEL GRADIENTE ALTITUDINAL. • ESTA VARIACIÓN SE AJUSTA A LOS MODELOS MÁS ACEPTADOS: ESTRÉS, MUTACIONES, ELEMENTOS TRANSPONIBLES O UNA COMBINACIÓN DE ELLOS • EL ALMACENAMIENTO DE TEJIDOS VEGETALES EN GEL DE SÍLICE PARA EL ANALISIS MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO NO ES RECOMENDABLE.
- 13. MUCHAS GRACIAS
Notes de l'éditeur
- 1- Alta montaña mediterránea en el marco del cambio climático: dentro del actual marco de cambio climático, las zonas de alta montaña mediterránea son una de las regiones más afectadas, por los cambios que se están produciendo, principalmente por los cambios en las precipitaciones en forma de nieve y la sequía estival 2-Montañas como refugio de la biodiversidad las montañas de la región mediterránea, junto con el resto de formaciones montañosas, son un refugio tanto para flora como fauna, albergando por ejemplo, más de un tercio de la biodiversidad terrestre en plantas, especies endémicas, de especial interés de conservación etc. 3- Gradiente altitudinal como fuente de variación, resulta obvio pensar que las montañas permitan el estudio en altura, en forma de gradientes altitudinales, que cambian los parámetros abióticos según donde se encuentren las comunidades. Además, son un punto clave para estudiar la evolución de las especies. 4-Gradiente altitudinal, perspectivas de estudio estos gradientes altitudinales se estudian tanto en montañas tropicales como polares. Poblaciones vegetales y animales y todo tipo de parámetros fisiológicos, ecológicos etc. Sin embargo, son muy numerosas las perspectivas evolutivas y genéticas que permanecen sin respuesta y que están relacionadas con los gradientes altitudinales y las montañas.
- TAMAÑO DEL GENOMA: HERRAMIENTA PARA LA GENÉTICA Y EVOLUCIÓN. En los últimos años se ha presenciado una evolución muy rápida de las técnicas relacionadas con el tamaño de los genomas y su aplicación desde una aproximación genética y evolutiva, principalmente filogeográfica TAMAÑO DEL GENOMA Y CITOMETRÍA DE FLUJO además, el estudio del tamaño del genoma se ha visto facilitado por la implantación de la citometría de flujo y de un protocolo estandar que permite medir un elevado número de muestras en un corto periodo de tiempo, con fiabilidad y bajo coste. En el caso de los genomas en plantas, se conocen tamaños de más de 3500 especies y existen varias bases de datos disponibles de forma gratuita por internet. TAMAÑO DEL GENOMA: APLICACIONES esto ha permitido que se hayan planteado posibles relaciones entre el tamaño del genoma con otros parámetros. Podríamos destacar trabajos que intentar relaciónar en tamaño del genoma con las precipitaciones, temperaturas… TAMAÑO DEL GENOMA, ESTUDIO EN LOS GRADIENTES ALTITUDINALES. En esta caso, los gradiente altitudinales no son una excepción, y son varios los estudios que se han enfocado desde esta perspectiva, aunque las conclusiones que se han obtenido han sido contradictorias. Varios autores han descrito relaciones positivas o negativas en función de la altitud, en especies y regiones diferentes. En otros casos, no se ha hallado relación alguna
- Silene ciliata COMO ESPECIE MODELO Y ADAPTACIÓN LOCAL recientemente, se han publicado varios trabajos que plantean fenómenos de adaptación local de esta especie dentro de un gradiente altitudinal. Silene ciliata es una especie perenne, de porte almohadillado, con dos cm de altura y 15 de diámetro aproximadamente que habita en las regiones montañosas del arco mediterráneo, siendo el sistema central su límite sur de distribución ADAPTACIÓN LOCAL DESDE PERSPECTIVA GENÉTICA, parece obvio intentar analizar este fenómeno de adaptación local desde una perspectiva genética, con el empleo de marcadores que nos permitan conocer la variablidad genética entre poblaciones, cambios en la expresión génica etc. DETERMINACIÓN CROMOSÓMICA DE Silene ciliata Y TAMAÑO DEL GENOMA CASOS DE POLIPLOIDÍA. Silene ciliata pose un determinación cromosómica muy amplia, desde 2n=24 hasta 2n=120. Esto dificulta enormente el análisis mediante cualquier herramienta genética, así como su interpretación, por lo que resulta indispensable conocer la dotación cromosómica de las poblaciones de Silene ciliata DIFICULTAD DE ANÁLISIS DE LOS TEJIDOS DE Silene ciliata las especies de zonas de dificil acceso resulta complicado obtener material para la determinación del tamaño del genoma, debido a que el protocolo estandarizado necesita tejidos verdes y almacenados en frio hasta su análisis, lo cual es complicado en zonas de difícil acceso como montañas.
- DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE PLOIDÍA DE Silene ciliata EN LAS POBLACIONES DEL SISTEMA CENTRAL mediante recuentos cromosómicos y citometría de flujo ESTIMAR EL TAMAÑO DEL GENOMA DE Silene ciliata según el protocolo estandarizado EVALUAR LA VARIACIÓN DEL TAMAÑO DEL GENOMA EN LAS POBLACIONES DE Silene ciliata DENTRO DE UN GRADIENTE ALTITUDINAL considerando que las poblaciones de Silene ciliata podrían tener genomas de diferente tamaño a pesar de niveles de ploidía constante EVALUAR LA VIABILIDAD DE ALMACENAR TEJIDOS EN GEL DE SÍLICE, COMO ALTERNATIVA AL PROTOCOLO ESTANDAR por la dificultad de obtener, en todos los casos, tejidos en condiciones óptimas
- RECUENTOS CROMOSÓMICOS Para determinar los cariotipos de Silene ciliata se recolectaron semillas de 3 de las poblaciones estudiadas y se agruparon por familias. Las semillas se estratificaron en frio durante dos meses y se colocaron en placas petri en una cámara de germinación. 16 horas de luz y 8 de oscuridad a 15 ºC. Cuando las semillas germinaron, se cortaron las raices de más de 2 cm. Estas se colocan en agua durante 24h en hielo fundente. Posteriormente, las raices se colocaron en una solución etanol-acido acético (3:1) en una nevera durante un mínimo de un mes. Despues, se emplearon tecnicas de contraste de fase o de fluorescencia para realizar los conteos. CITÓMETRO DE FLUJO se recolectaron hojas de Silene ciliata un mes antes del análisis y se almacenaron en gel de silice. Se realizço el mismo procedimiento una semana antes del análisis, aunque en este caso, las hojas se almacenaron en papel ligeramente humedecido. Las hojas se limpiaron y se triruraron junto a hojas de Petunia hybrida, que se empleo como planta patrón. Las hojas se trituraron embebidas en el líquido de extracción, se filtro a traves de una membrana de nylon y se tiño con yoduro de propidio
- RECUENTOS CROMOSÓMICOS Los cariotipos de Silene ciliata mostraron que todos los individuos son diploides. No se observaron fenomenos de poliploidías, aneuploidías y demás. Sin embargo, Blackburn (1933) encontró individuos con varias dotaciones cromosómicas dentro de las poblaciones de Silene ciliata en Picos de Europa. Desde una perspectiva filogeográfica, los individuos diploides serían los más sencillos y habrían permanecido en este sistema montañoso como una zona de refugio tras la última glaciación
- 2. CITOMETRÍA DE FLUJO Se muestra la salida del citómetro de flujo. Los picos de absorbancia coresponde a Silene ciliata y Petunia hybrida en fase 2C y 4C. 2.1 TAMAÑO MEDIO. COEFICIENTE DE VARIACIÓN El tamaño del genoma de Silene ciliata es de 1.76 ± 0.06 picogramos, lo que supone un valor pequeño, aunque similar al te otras especies de su genero como Silene coeli de 1 picogramo o Silene vulgaris de 2.25 picogramos. El valor del coeficiente de variación resulto ser menor al 5%, lo cual demuestra la fiabilidad de la técnica y la validez de los resultados. Las fuentes de variación pueden ser debidas a que se analicen tejidos de diferente procedencia (hojas, tallos, raices etc.) o a las afecciones de hongos en los tejidos analizados si estos no son limpiados previamente.
- VARIACIÓN INTRAPOBLACIONAL DEL TAMAÑO DEL GENOMA Se observaron diferencias significativas en el tamaño del genoma entre las poblaciones dentro del gradiente altitudinal. Las poblaciones con mayor tamaño aparecieron en las zonas intermedias del gradiente altitudinal, mientras que los genomas más pequeños aparecieron en los extremos del gradiente. La distribución del tamaño del genoma parece ajustarse a una distribución unimodal, por la cual los tamaños mayores aparecerían a una altitud intermedia, mientras que en los extremos del gradiente, los tamaños tienen a reducirse. Las posibles causas de esta distribución unimodal se desconocen.
- 3. TAMAÑO DEL GENOMA ANALIZADO EN GEL DE SÍLICE El análisis de tejidos vegetales de Silene ciliata almacenados en gel de silice obtuvo un tamaño de 1.72 ± 0.06 picogramos. Este resultado es menor que al realizado con el material almacenado según el protocolo establecido y similar a otros resultados obtenidos en trabajo anteriores. Este descenso en el tamaño es desconocido, aunque se cree que puede deberse a la degradación de los tejidos vegetales al almacenarse durante un largo periodo de tiempo. El coeficiente de variación fue similar al de tejido almacenado en fresco. El tamaño del genoma fue menor, independientemente de la población estudiada, aunque las diferencias no fueron significativas. La población “morrena” obtuvo un valor más pequeño, mientras uqe la población “Peñalara” apenas varió. La población “DosHermanas” presento en todos los casos el mayor tamaño del genoma. Estos resutados fueron similares a pesar medios de extracción más agresivos