1. Laboratorio
de Genética
EXTRACCION DEL ADN
ADRIANA MARIA GIL Z.
BIOCIENCIAS
Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS
LABORATORIO DE BIOCIENCIAS
2. La prueba de Laboratorio
de Genética
ADN
Los avances de la Genética Molecular
han puesto al servicio de la pericia en Medicina
Forense y por tanto
de la administración de justicia, un
sistema de pruebas enormemente
seguro, objetivo y eficaz.
3. La tecnología del Laboratorio
de Genética
ADN
fue utilizada por primera vez como método de
identificación genética en el campo forense hace
aproximadamente 15 años y con los avances y
desarrollo que ha tenido se ha convertido en una
herramienta imprescindible en el análisis de los
Indicios de interés criminal
5. CROMOSOMAS
46 CROMOSOMAS
23 PARES
DIPLOIDES
UN INDIVIDUO
TIENE 23 CROMOSOMAS
HEREDADOS DE LA
MADRE Y 23
HEREDADOS DEL PADRE
6. EL MATERIAL Laboratorio
de Genética
GENÉTICO
Es el responsable de transmitir los caracteres
heredados de una generación a otra.
Está conformado por millones de unidades
de nucleótidos
Cada nucleótido esta a su vez formado por:
Base nitrogenada, Azúcar y grupo fosfato
7. EL MATERIAL Laboratorio
de Genética
GENETICO
BN
BASES
P
NITROGENADAS
A
BN
BN ADENINA
GUANINA P
BN A
BN
BN CITOSINA
P
BN TIMINA A
8. REGIONES Laboratorio
de Genética
DEL ADN
De secuencia única (genes)
Medianamente repetitivas
Altamente Repetitivas
9. Laboratorio
CROMOSOMA de Genética
ADN
p
HETEROCROMATINA REGIONES
REPETIDAS
EUCROMATINA
GEN
q
10. REGIONES ALTAMENTE
REPETITIVAS Laboratorio
de Genética
SHORT TANDEM REPEATS (STRs)
Miles distribuidas a lo largo del genoma
Formadas por 2 a 7 nucleótidos
Los nucleótidos se repiten varias veces
uno tras otro
Regiones muy variables (polimórficas)
12. SHORT TANDEM Laboratorio
de Genética
REPEATS
STRs Localización Secuencia Tamaño
cromosómica ( pb )
D3S1358 3p (TCTA)n 114 - 142
vWA 12p (TCTG)n 152 - 197
FGA 4p (CTTT)n 219 - 167
DYS 391 Y (GCGT)n 210 - 264
13. D3S1358 Laboratorio
de Genética
TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 4
TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 5
TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 6
TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TATA … n Alelo n
POLIMORFISMO: Múltiples alelos posibles en la
población
14. Etapas de procedimiento para Laboratorio
de Genética
Extracción y Purificación de AN
Disgregación o fragmentación del tejido
Estas etapas Lisis celular
deben ir Durante todo el
acompañadas de procedimiento se
medidas o
agentes que debe usar
Clarificación
inactiven soluciones y
nucleasas
celulares material estéril, ademas
Purificación de guantes
Cuantitativo:
Cualitativo: Análisis espectrofotometría
electroforesis UV
15. Métodos fragmentación, lisis Laboratorio
de Genética
celular para extracción de ADN
El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria
para romper el material de inicio (células o tejido) y la
delicadeza requerida para preservar las moléculas de interés
(ADN o ARN).
• Métodos físicos
– Homogenización mecánica, •Métodos químicos
– Homogenización en solución – Detergentes
– Molienda manual en mortero
– Bolitas de vidrio
– Sonicación
•Métodos enzimáticos
– Lysozima: rompe enlaces β-1.4- entre N-acetil murámico y N-
acetil glucosamina de peptidoglicán de la pared celular de
bacterias
– Lyticasa: rompe enlaces β-1.3 de glucano de levaduras
– Proteasas: rompe enlaces peptídicos de prot. de pared y
membrana plasmática e interacciones célula-célula.
16. Etilen diamino tetracetico (EDTA).
•Quelante de iones Mg2+, baja la
concentación efectiva de este ión.
•Por lo tanto, EDTA inhibe nucleasas y
minimiza la degradacion de AN durante la
extración/purificación.
Amortiguador de pH (7-8).
SDS Triton
17. Factores que afectan el
rendimiento, calidad y pureza de Laboratorio
de Genética
ADN purificado.
• Cantidad de material de partida
– Número de copias de las moléculas de AN
– Cantidad de tejido
• Condiciones en las que se encuentra el
material de inicio (fresco, congelado, fijado)
• Contaminantes e interferentes en el material
biológico
• Hay un compromiso entre
rendimiento/calidad/pureza
18. APLICACIONES EN GENÉTICA
FORENSE Laboratorio
de Genética
Casos de Filiación
Mezcla de Fluidos
Agresiones sexuales
Violación en serie
19. AGRESIONES Laboratorio
de Genética
SEXUALES
Se denomina agresión sexual a todo
acto que atente contra la libertad
sexual de una persona, cometido sin
que medie su consentimiento; sea
éste con o sin violencia o intimidación.
20. LA RECOLECCIÓN DE Laboratorio
de Genética
LA MUESTRA
Formulario de envío de muestras
Datos de la víctima
Datos de la agresión
Listado de las muestras de referencia indicios.
Cadena de custodia
21. RECOLECCIÓN Laboratorio
de Genética
DE LA MUESTRA
Datos de la agresión
Lugar de los hechos
Fecha y hora
Tiempo transcurrido entre los hechos
y la toma de la muestra
Tipo de agresión: vaginal, anal, bucal
Número de agresores
22. MUESTRAS Laboratorio
de Genética
AGRESIÓN SEXUAL
La selección de los indicios biológicos se
realizará teniendo en cuenta los
antecedentes y datos aportados por la
víctima.
Es fundamental numerar los hisopos para
iniciar el análisis con el primero que se haya
recogido.
23. RECOGIDA DE
INDICIOS BIOLÓGICOS
Dos tomas bucales
Superficie corporal (semen o saliva
mordeduras)
Peinado de vello púbico (recogida de
pelos)
Dos tomas cervicales, dos vaginales y
una de genitales externos
Lavado vaginal
24. RECOGIDA DE MUESTRAS
INDUBITADAS Laboratorio
de Genética
MUESTRAS INDUBITADAS DE LA VÍCTIMA
Sangre
Células epiteliales bucales (saliva)
Pelos con raíz
10 a 15 vellos púbicos
MUESTRAS INDUBITADAS DELSOSPECHOSO
Sangre
Células epiteliales bucales (saliva)
Pelos con raíz
25. MUESTRAS
Laboratorio
de Genética
EXTRACCION DEL ADN
• Sangre
• Semen •Diente
• Saliva •Tejido
• Cabello
• Hueso
26. MUESTRAS PARA Laboratorio
de Genética
EXTRACCION DEL ADN
• Sangre: derivados porfirinicos de la
Hemoglobina.
• Manchas: secado.
• Residuo metanolico: Chelex.
• Soportes: Absorbente o no.
27. REMISION PARA ANALISIS DE
POLIMORFISMO MOLECULAR
Laboratorio
de Genética
• La posibilidad de extraer el material genético
en cualquier indicio biológico.
• Analisis por medio de técnicas como la PCR
,ha permitido obtener ADN a partir de
indicios biologicos en cantidades escasas
28. REMISION DE LAS MUESTRAS
PARA ANALISIS DEL ADN
• NORMAS DE BIOSEGURIDAD.
• CADENA DE CUSTODIA.
• FORMATOS EN CASOS
ESPECIFICOS.
29. PROTECCION DEL Laboratorio
de Genética
PERSONAL
• Prevenir contacto directo
• Prohibir consumo de comidas y
bebidas.
• Condiciones de asepsia y material
desechable.
• Vacunación.
30. PROTECCION DE LA Laboratorio
de Genética
MUESTRA
• CONTAMINACION POR MATERIAL
BIOLOGICO HUMANO.
• CONTAMINACION MICROBIOLOGICA.
• CONTAMINACION QUIMICA.
• TRANSFERENCIA DE INDICIOS
BIOLOGICOS.
31. CONTAMINACION POR
MATERIAL BIOLOGICO Laboratorio
de Genética
HUMANO
Depósito de material biológico humano
sobre las muestras, con posterioridad
a la toma de las mismas.
32. CONTAMINACION Laboratorio
de Genética
MICROBIOLOGICA
Este tipo de contaminación tiene
lugar por el desarrollo de
microorganismos y suele estar
favorecida por la humedad y las
altas temperaturas.
33. CONTAMINACION Laboratorio
de Genética
QUIMICA
Presencia de productos químicos
que dificultan procesos del
análisis genético, como PCR y
extracción del ADN
34. TRANSFERENCIA DE INDICIOS
BIOLOGICOS.
Debido al traslado de los indicios de
una localización a otra puede dar
lugar a una contaminación o puede
ocasionar la pérdida de la prueba.
35. DEGRADACION DE LAS Laboratorio
de Genética
MUESTRAS
• Humedad ambiental.
• Fenómenos meteorológicos, acción de
insectos, entre otros.
• Recogida y envió al laboratorio de estas
evidencias de una manera adecuada para
evitar la proliferación bacteriana y por
consiguiente la degradación del material
genético
36. DEGRADACION DE Laboratorio
de Genética
LAS MUESTRAS
• Exponer por mucho tiempo las muestras a
los rayos ultravioleta provoca daños sobre la
estructura del ADN, o aplicar ciertos
conservantes que puedan provocar efectos
sobre la cadena del ADN.
37. DOCUMENTOS Laboratorio
de Genética
NECESARIOS
• Formulario de envio de muestras.
• Identificacion de Muestras.
• Cadena de Custodia.
38. FORMULARIO ENVIO DE
MUESTRAS
• Investigacion solicitada: Investigacion restos de
sangre.
• Antecedentes y datos sobre el caso: Causa de los
hechos, lugar, fecha.
• Datos de la victima: Edad, sexo, Grupo poblacional,
causa de la muerte, relacion con el sospechoso.
• Datos del sospechoso:
39. IDENTIFICACION DE LAS
Laboratorio
MUESTRAS de Genética
• Listado de muestras de referencia: Numero,
tipo de muestra, Nombre de la persona,
relación con el caso.
• Listado de indicios biologicos: numero de
referencia, tipo de muestra (toma vaginal), a
quien pertenece y localizacion, tipo de indicio
a estudiar.
40. CADENA DE
Laboratorio
CUSTODIA de Genética
• Nombre o identificación, firma.
• Fecha y hora de la recogida.
• Condiciones de almacenaje de las muestras
hasta su envio.
42. FENOL
Laboratorio
CLOROFORMO de Genética
• Técnica Orgánica (Solventes)
• ADN de muy buena calidad y cantidad.
• Peptidos y proteinas son extraidas en la fase
organica (Fenol), después se realiza
digestión con proteinasa K. El cloroformo
permite que todo el fenol pueda ser lavado.
DESVENTAJAS:
- Reactivos altamente tóxicos
- Perdidas significativas de ADN y mucho mas
si esta degradado.
43. CHELEX
• Resina que previene la degradación del ADN por
quelacion de los iones metalicos durante la
ebullicion a una concentracion 5%.
• La resina de chelex tiene una alta afinidad por iones
metalicos polivalentes y esta compuesta de
copolimeros de estireno dibenzeno con inones
iminodiacetato, los reactivos no son toxicos y no se
pierde ADN.
DESVENTAJAS:
• El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado en
PCR pero no en RFLPS.
44. SALTING OUT Laboratorio
de Genética
1. Lisis Celular
2. Extracción
3. Precipitación
4. Resuspensión
