1. REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR) Y
ELECTROFORESIS
ADRIANA MARIA GIL ZAPATA
Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS
BIOCIENCIAS II
2. Síntesis de ácidos nucleicos
• La hebra nueva de DNA o RNA se sintetiza en dirección
5’ 3’
• Las RNA polimerasas pueden iniciar la síntesis de una
cadena nueva utilizando una hebra molde
• Las DNA polimerasas además de la hebra molde, necesitan
un iniciador (primer o cebador de extensión)
• La Transcriptasa Reversa es una DNA polimerasa RNA-
dependiente.
3. Basta un primer
Cadena líder
(Leading Strand)
Primer (riboNTPs)
Fragmento de Okasaki
Cadena rezagada
(Lagging Strand)
→
LA SINTESIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS ES SIEMPRE DE 5´→ 3´.
4. ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN
LA SINTESIS DEL DNA POR PCR
• Hebra Templado
• Iniciador (cebador, primer): secuencia corta de
nucleótidos complementaria a la hebra templado.
La enzima DNA polimerasa sólo puede iniciar la síntesis
de una cadena de DNA a partir de un 3’OH libre.
• dNTPs : desoxirribonucleótidos tri-fosfatados
• DNA Polimerasa
5. PCR
Temperatura
100
Melting
94 oC
50
0
Tiempo
3’ 5’
DNA de 5’ 3’
cadena doble
6. PCR
Temperatura
100
Melting
94 oC
50
0
Tiempo
3’ 5’
DNA de
cadena simple
Calor
5’ 3’
7. PCR
Temperatura
100
Melting Melting
94 oC o
Extension 94 C
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC
0
Tiempo
3’ 5’
5’
Hibridación
de primers
5’
5’ 3’
8. PCR
Temperatura
100
Melting Melting 30 ciclos
94 oC o
Extension 94 C
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC
0
Tiempo
3’ 5’
Calor
5’
5’
Calor
5’
5’ 3’
9. PCR
Temperatura
100
Melting Melting 30ciclos
94 oC o
Extension 94 C
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC
0
Tiempo
3’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’ 3’
10. PCR
Temperatura
100
Melting Melting 30ciclos
94 oC o
Extension 94 C
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC
0
3’ 5’ 5’ Tiempo
5’
5’
5’ 3’
Calor
5’
5’
Calor
5’
11. PCR
Temperatura
100
Melting Melting 30ciclos
94 oC o
Extension 94 C
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC
0
3’ 5’ 5’ Tiempo
5’
5’ 5’
5’ 3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
12. PCR
Temperatura
100
Melting Melting 30ciclos
94 oC o
Extension 94 C
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC
0
3’ 5’ 5’ Tiempo
5’
5’ 5’
5’ 3’
5’
5’
Fragmentos de
tamaño definido
5’
5’
5’
5’
13. El numero de copias del DNA delimitado por los
primers se duplica en cada ciclo de PCR.
Numero de copias
1 2 4 8 16 32 64
0 1 2 3 4 5 6
# ciclos
14. VENTAJAS DE PCR SOBRE
OTRAS TECNICAS
ALTA SENSIBILIDAD
ALTA ESPECIFICIDAD
RAPIDEZ
DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA
templado específico o productos amplificados previamente)
15. REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA
PCR
Proceso que semeja “in vitro” la
replicación del ADN y que permite
obtener millones de copias iguales de
un fragmento de ADN, después de
realizar 30 o más ciclos.
16. REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA
1. DENATURACIÓN
90 a 95 ° c
CICLO 2. ANILLAMIENTO
55 a 65 ° c
3. EXTENSIÓN
72 ° c
17. DENATURACION
• El ADN sirve de molde para ser copiado.
• Un aumento de la temperatura o un pH
alcalino permite que la cadena se separe.
• Es reversible
18. HIBRIDACION
• Los primers se unen a los extremos 3 prima
de la cadena.
• La nueva hebra tiene la direccion de 5 a 3
prima.
• Le dan la especificidad a la PCR.
19. EXTENSION
• Actua la Taq (Termophilus aquaticus)
polimerasa.
• Polimerisa los dNTP‘s.
20. PCR MIX
• Buffer • Primers •ADN molde
• dNTP’s (dATP, dGTP, dTTP y dCTP)
•ADN Polimerasa (Taq polimerasa)
• Cloruro de Magnesio (MgCl2) cofactor de la
Taq.
21. Usos de la PCR
• Pruebas de identificación (STRs)
• Detección de enfermedades
hereditarias
• Detección de enfermedad viral
• Clonación de genes
• Mutagénesis dirigida
• Genotipificación de mutaciones
especificas (SNPs)
22. CLASES DE PCR
• PCR MISMATCH
• RT PCR
• PCR TIEMPO REAL
• PCR MULTIPLEX
• PCR NESTED
23. Consiste en dos pasos:
• Transcripción reversa
RT-PCR • PCR
mRNA
OBJETIVO:
Detección de la expresión de cDNA (simple cadena)
un gen – por presencia de
mRNA
cDNA (doble cadena)
PCR
25. MUESTRAS QUE PUEDEN PATOGENOS QUE
PUEDEN SER
SER EVALUADAS POR PCR DETECTADOS POR PCR
•Sangre - Bacterias
•Mucosa - Hongos
•Tejido - Parásitos
•Orina - Virus
•Heces - Mutaciones en Genes
•Líquido cefalorraquídeo - Ausencia /Deleción de
genes
26. USOS DE LA TECNOLOGIA MOLECULAR
EN LA SOCIEDAD
• Medicina : Diagnóstico Molecular:
Enfermedades genéticas
Enfermedades infecciosas
• Identificación genética y filiación (Pruebas de paternidad,
medicina forense, pedigree de animales, etc...)
• Mejoramiento genético en animales y plantas
• Productos biomédicos
• Terapia génica
27. REAL TIME PCR
- PCR Cuantitativo (end point analysis)
- PCR en tiempo real (análisis de la cinética de
reacción)
- ventajas
- desventajas
- aplicaciones
28. REAL TIME PCR - PCR EN TIEMPO REAL
•Cuantificación del número de copias de DNA presentes
en la muestra (diagnóstico, monitoreo de carga viral,
comparación entre número de copias en diferentes
subespecies, etc.)
•Cuantificación del mRNA por RT-PCR en tiempo real
(análisis de la expresión de genes en diferentes tejidos o
en diferentes condiciones normales vs patológicas,
efecto de drogas, etc)
•Análisis de la cinética de la reacción
29. PCR en tiempo real
• Detección y cuantificación de reporteros fluorescentes.
• La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de
producto formado en cada ciclo de PCR.
• Reporteros fluorescentes: TaqMan, Beacons moleculares,
SYBR Green
32. CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE CICLOS
Se observa diferencias en los ciclos iniciales. Relación como línea recta
al utilizar logaritmos, porque la amplificación por PCR es una reacción
logarítmica.
35. Amplification Plot of real-time PCR
DNA copy number (log) Log phase Level off/ plateau
2
4
8
16
32
PCR cycle (Ct)
36. PROBLEMAS
PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que
pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida
durante la reacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza
SYBR-green.
ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:
• Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de los
primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en
el DNA o cDNAs de la muestra
• Dímeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando
productos pequeños
37. CURVA DE DENATURACION
Muesta el perfil de denaturación de los productos amplificados.
Si un producto presenta un perfil de denaturación diferente
(valores de Tm diferentes), significa que es otro producto (no
específico) de amplificación, pueden ser dímeros.
38. CURVA DE DENATURACION DE DILUCIONES
(se observan dímeros, de menor temperatura de fusión)
dímeros
40. Ventajas del PCR en tiempo real
• Simple y rápida (semi-automatizada).
• No hay manipulación post-PCR.
• Eliminación de contaminación por amplicones.
• Cuantificación del DNA o RNA molde inicial.
• Muy sensible.
• Detección de productos inespecíficos con la
opción “curva de desnaturalización” (Melt-Curve).
• Detección de más de un producto específico en
una misma reacción.
• Extraordinariamente específico.
41. REGIONES DEL ADN
De secuencia única (genes)
Medianamente repetitivas
Altamente Repetitivas
42. CROMOSOMA
ADN
p
HETEROCROMATINA REGIONES
REPETIDAS
EUCROMATINA
GEN
q
43. REGIONES ALTAMENTE REPETITIVAS
SHORT TANDEM REPEATS (STRs)
Miles distribuidas a lo largo del genoma
Formadas por 2 a 7 nucleótidos
Los nucleótidos se repiten varias veces
uno tras otro
Regiones muy variables (polimórficas)
59. METODOLOGIA DE ANÁLISIS DEL ADN
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
CAMARA DE ELECTROFORESIS
GEL DE AGAROSA
ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS CAPILAR
EQUIPO ABI PRISM 310
60. ELECTROFORESIS
Técnica en la cual una partícula cargada se
hace desplazar a través de un medio aplicando
un campo eléctrico.
La velocidad de migración es función de la
densidad de carga y ésta a su vez es función
de una serie de parámetros que marcan las
condiciones experimentales como: pH, fuerza
iónica, voltaje, interacciones con el soporte.
61. MOVIMIENTO DE LA PARTICULA
EN EL CAMPO ELECTRICO
Catión ( carga + ) Migra al polo negativo. CATODO
Anión ( carga - ) Migra al polo positivo. ANODO
La fuerza que ejerce el campo eléctrico sobre la
partícula cargada, es proporcional a la carga de la
partícula y al voltaje del campo eléctrico
aplicado.
F = Q X V
62. MOVIMIENTO DE LA PARTICULA
EN EL CAMPO ELECTRICO
Otra fuerza se opone al movimiento de la
partícula y es proporcional al tamaño y la
forma de ella y a la viscosidad del buffer.
Fr = F X V
Estas dos fuerzas se equilibran cuando la
partícula empieza a migrar y hace que
alcance una velocidad constante.
63. FACTORES QUE AFECTAN LA
MIGRACION DE LAS PARTICULAS
Carga neta de la partícula: Efecto
del pH del tampón.
Cuando las partículas se colocan en un
campo eléctrico, estas migrarán hacia
el ánodo o el cátodo en función de la
carga neta que posean y ésta depende
del pH de la solución en que se
encuentran.
64. FACTORES QUE AFECTAN LA
MIGRACION DE LAS PARTICULAS
Tamaño y Forma de la partícula:
Según el tipo de electroforesis, el tamaño
y la forma de la partícula pueden tener
mayor o menor importancia.
Cuando se emplean soportes que permiten
el paso selectivo de moléculas, según el
tamaño, retienen las grandes y dejan
pasar las más pequeñas.
65. FACTORES QUE AFECTAN LA
MIGRACION DE LAS PARTICULAS
Fuerza iónica del tampón:
En la electroforesis, la corriente es
llevada por los iones presentes, tanto
del tampón como de las partículas en
solución, por tanto cuanto más
concentrado es el tampón, mayor la
proporción de corriente que
transportan, menor la migración de
las partículas y peor la separación.
66. FACTORES QUE AFECTAN LA
MIGRACION DE LAS PARTICULAS
Potencial del campo eléctrico:
A mayor potencial del campo eléctrico mayor
velocidad de la partícula.
Según el método electroforético se elige
trabajar manteniendo constante el V o A.
Si aumenta el voltaje, aumenta velocidad de
separación, pero también la temperatura
aparecen efectos indeseables como:
desnaturalización de pr, evaporación del
buffer, aumento de la fuerza iónica.
67. TIPOS DE SOPORTES
El procedimiento electroforético se
lleva a cabo sobre dos soportes::
1. Soportes No Restrictivos:
Las partículas colocadas sobre ellos,
se separan únicamente en función de
su carga eléctrica. Los principales
soportes son:
Papel – Acetato de Celulosa – Agarosa
68. TIPOS DE SOPORTES
2. Soportes Restrictivos:
El soporte ejerce algún tipo de resistencia al
desplazamiento de las moléculas de la
muestra. La resistencia estará dada por el
tamaño del poro del soporte y por el tamaño
y características de las moléculas que deben
desplazarse sobre el soporte. Los principales
tipos de soportes son:
Geles de Almidón – Geles de Poliacrilamida
69. ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
AGAROSA:
Es uno de los componentes del agar. Se
prepara como un gel de concentración
entre 0.5 – 2 gr %. El tamaño del poro
es grande y permite el paso de moléculas
de peso molecular relativamente alto,
por lo cual migran tan solo en función de
su carga. Su aspecto claro y
transparente facilita la cuantificación
por densitometría.
70. ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
POLIACRILAMIDA
Se forman por polimerización de la acrilamida
con un agente enlazante. El tamaño del poro
varía, según la concentración de la acrilamida y
las moléculas puedan ser separadas por
diferencias en sus cargas y tamaños.
Soporte ideal para obtener mayor y mejor
número de separaciones electroforéticas. Se
puede leer por densitometría.
Permite introducir al gel: SDS, urea y etc.
73. ELECTROFORESIS CAPILAR
POLIMERO POP 4
Soporte restrictivo que permite la
separación de moléculas de ADN desde un
par de bases en adelante.
Se deposita en un capilar de 1 mm de
diámetro y este se introduce en un equipo
automatizado que posee una placa de
calentamiento y un laser que detecta la
señal de los fluorocromos.
77. REALIZACION DE LA ELECTROFORESIS
Obtención de la Montaje de la
Muestra jeringa
Montaje de la muestra
Electroforesis capilar
Detección por el laser
Lectura de
electroferogramas
