El documento describe diferentes técnicas de tinción y coloración para la observación de bacterias al microscopio, incluyendo tinción simple, tinción de Gram, y tinción de Ziehl-Neelsen. Explica que la tinción de Gram permite diferenciar bacterias Gram positivas de Gram negativas, mientras que la tinción de Ziehl-Neelsen se usa para teñir micobacterias. También proporciona detalles sobre la preparación de muestras, materiales y métodos para realizar diferentes tipos de tinción bacteriana.

1. PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
(MONTAJES Y TÉCNICAS DE COLORACIÓN).
Montes Alfredo; Quintana Adriana; Palmeth Carlos.
Universidad De Cartagena
Facultad De Ciencias Exactas y Naturales
Programa de Biología
Microbiología
RESUMEN
La experiencia de este trabajo se basó en la realización de pruebas en la
elaboración de extendidos o frotis a partir de un cultivo de microorganismos,
también se llevó acabo la realización de montajes para la observación
microscópica de bacterias, utilizando las diferentes técnicas de tinción de
microorganismos y así diferenciando que tipo de bacterias pertenencia
dependiendo el tipo de tinción ya sean Gram positivas (+) o Gram Negativas (-).
Palabras clave:Tinción, Bacterias Gram positivas, Bacterias Gran negativas,
Frotis, Cristal violeta.
ABSTRACT
The experience of this work was based on the accomplishment of tests on the
production of extended or smear from a culture of microorganisms, also it removed
I end the accomplishment of assemblies for the microscopic observation of
bacteria, using the different technologies of tint of microorganisms and this way
differentiating that type of bacteria belonging depending the type of tint already be
positive Gram (+) or Gram Negatives (-).
Keywords:Tint, Bacteria positive Gram, Bacteria Great denials, Smear, violet
Crystal.
INTRODUCCIÓN
Las bacterias son organismos
unicelulares microscópicos, sin
núcleo ni clorofila, que pueden
presentarse desnudas o con una
cápsula gelatinosa, aisladas o en
grupos y que pueden tener cilios o
flagelos.

2. La bacteria es el más simple y
abundante de los organismos y
puede vivir en tierra, agua, materia
orgánica o en plantas y animales.
Tienen una gran importancia en la
naturaleza, pues están presentes en
los ciclos naturales del nitrógeno, del
carbono, del fósforo, etc. y pueden
transformar sustancias orgánicas en
inorgánicas y viceversa.La tipificación
de las bacterias se basa en el estudio
de sus características mediante
técnicas que oscilan entre las más
sencillas tinciones y los más
complejos estudios moleculares. Una
técnica útil y de bajo costo consiste
en la tinción de Gram y posterior
observación de la muestra mediante
el microscopio de luz para estudiar
las bacterias, su forma, tipo de
agrupación y color: grampositivas o
gramnegativas. La mayor parte de las
bacterias puede ser ubicada en uno
de estos dos grupos o en un tercero,
de acuerdo a la ácido-alcohol
resistencia que presenten (Ziehl-
Neelsen). Algunas propiedades
genéticas y fisiológicas constituyen
herramientas utilizadas para definir
algunas características de las cepas,
como los serotipos y biotipos,
determinación de especies en
algunos grupos de bacterias,
producción de toxinas. Los métodos
más sensibles se basan en el análisis
del material genético. Cabe
mencionar que éstos han
diversificado sus objetivos; se
emplean en la identificación de
subgrupos de genes esenciales para
el crecimiento, colonización, adhesión
e invasión
Las bacterias que tienen forma
esférica u ovoide se denominan
cocos. Y si se tiñen de azul con el
Gram, se les llama Gram positivos.
Cuando los cocos se agrupan en
cadenas, se les denomina
estreptococos y cuando lo hacen en
racimos, se les llama estafilococos;
también se pueden agrupar en pares
que reciben el nombre de diplococos.
Las bacterias en forma de bastón
reciben el nombre de bacilos. Si al
teñirlos con el Gram quedan de color
rojo, se les denomina Gramnegativos.
Los bacilos curvados que presentan
espirales se llaman espirilos, rígidos;
algunas bacterias en espiral
presentan formas fácilmente
reconocibles, como las espiroquetas,
semejantes a un tornillo o
sacacorchos, flexibles. Las bacterias
que carecen de pared celular tienen
gran plasticidad (micoplasmas) y
adoptan una variedad de formas. Las
bacterias esféricas tienen un tamaño
promedio de 1 micrómetro de
diámetro, mientras que los bacilos
miden 1.5 de ancho por 6
micrómetros de largo (2013. Kenneth
W)
MATERIALES Y MÉTODOS
Tinción Simple
Con la ayuda de un isopo se tomó
una muestra de la mucosa de la
faringe luego se colocó en un
portaobjeto con una gota de agua

3. esterilizada y se flameo al rojo vivo
para adherir la muestra y matar
microorganismo, se llevó a realizar la
tinción cubriéndolo con varias gotas
de colorante de cristal violeta se dejó
actuar unos 45 segundos, después se
lavó con abundante agua y se dejó
secar, se examinó la muestra en el
microscopio con objetivo de
inmersión o de 100x.
Tinción diferencial
Se tomó un frotis igual al de la
muestra anterior y una muestra dada
por el docente las cuales eran de
colonias de bacterias Gram positivas
y Gram negativas las muestras se
cubrieron con cristal violeta por un (1)
minuto, se lavó y se dejó secar el
exceso de agua, luego se cubrió con
lugol por un (1) minuto, después se le
aplico el decolorante alcohol acetona
por Quince (15) segundos se lavó con
abundante agua y por último se le
aplico el colorante de contraste
safranina (rojo/rosado) por quince
(15) segundos se lavó y se secó con
ayuda del aire y gasa.Se observaron
las muestras en el microscopio con
objetivo de inmersión o de 100x.
BIBLIOGRAFÍA
 Kenneth W. Bayles. Bacterial
programmed cell death: making
sense of a paradox.
NatRevMicrobiol, december
2013;12:63-69
doi:10.1038/nrmicro3136
 Pierre-Edouard Fournier, Michel
Drancourt, Philippe Colson, Jean-
Marc Rolain, Bernard La Scola, et al.
Modern clinical microbiology: new
challenges and solutions. Nat Rev
Microbiol, 2013;11:574-585
doi:10.1038/nrmicro3068
ANEXOS
1. ¿Qué es un frotis y para que se
utiliza?
Se denomina frotis a la extensión que
se realiza sobre un portaobjetos de
una muestra o cultivo con objetivo de
separar lo más posible los
microorganismos, ya que si aparecen
agrupados en la preparación es muy
difícil obtener una imagen clara y
nítida. Este frotis debe ser
posteriormente fijado al vidrio del
portaobjetos para poder aplicar los
métodos habituales de tinción que
permiten la observación al
microscopio de las bacterias sin que
la muestra sea arrastrada en los
sucesivos lavados. La fijación de una
extensión bacteriana hace que las
bacterias queden inactivadas y
adheridas al vidrio alterando lo menos
posible la morfología y bacteriana y
las posibles agrupaciones de células
que pudiera haber.
2. ¿Qué es una tinción y cuantos
tipos existen? Escribe la técnica
de preparación de cada uno de
ellos.
Una tinción o coloración es una
técnica auxiliar utilizada en
microscopía para mejorar el
contraste en la imagen vista al

4. microscopio. Los colorantes y
tinturas son sustancias que
usualmente se utilizan en biología y
medicina para resaltar estructuras
en tejidos biológicos que van a ser
observados con la ayuda de
diferentes tipos de microscopios.
Tipos de tinción:
Simples: se usa un solo colorante
disuelto en solución acuosa o
alcohólica, y se suplementan con un
mordiente para una mejor fijación
del colorante además de aumentar
el grosor de algunas estructuras
para su mejor visión. Sirven para ver
la morfología y las agrupaciones que
forman los microorganismos entre
ellos y con otras células.
Coloración de Gram.
Tinción compuesta: En este tipo
de tinción, se utiliza más de una
sustancia tintórea. Los colorantes se
aplican, a la preparación, separados
o juntos, formando parte de una
solución. En consecuencia se puede
determinar algunas características
propias de diversos géneros que
permiten diferenciarlo de los demás,
por lo que reciben también el
nombre de coloraciones
diferenciales. Entre los métodos
más utilizados se encuentran: La
coloración de Gram y la de Ziehl
Neelsen.
Tinción de Gram
Principios. A pesar de que esta
técnica de coloración se ha venido
empleando desde hace más de un
siglo, aún no se ha podido
determinar con exactitud la base
molecular de la reacción, existiendo
controversias al respecto. El criterio
más generalizado es que la violeta y
el lugol forman un complejo que
reacciona con los componentes
bioquímicos de la pared celular
deshidratada, fijándose en esta.
Teniendo en cuenta que la
composición química de la pared, no
es igual en todos los géneros, la
reacción resultante será obviamente
diferente, lo que da lugar, que
mientras algunos géneros retienen
firmemente el colorante al resultar el
complejo impenetrable para el
decolorante, en otros géneros la
barrera que se produce es más
permeable, lo que permite al
solvente penetrar y extraer el
complejo violeta-lugol, dejando a la
bacteria nuevamente incolora.
Fundamento técnico En el primer
paso de la coloración, cuando los
microorganismos presentes en el
frotis son expuestos a la acción
colorante de la violeta de genciana,
todos los géneros que se
encuentran en el frotis se tiñen de
color violeta. Al adicionar el lugol, no
se produce ningún cambio de color,
ya que el lugol no es un colorante,
sino un mordiente, que se adiciona
con el objetivo de formar un
complejo violeta-lugol, para fijar el
color en la bacteria. Al adicionar el
decolorante (alcohol etílico o alcohol
acetona) algunos géneros no son
afectados por estos solventes,
reteniendo por consiguiente el color
violeta aplicado inicialmente, en
tanto que otros son decolorados
quedando la bacteria nuevamente
incolora. Al echar finalmente la
solución de safranina (que es de
color rojo ) las especies que no
fueron decoloradas, mantienen la
coloración violeta ya que la
safranina es un colorante más débil
que la violeta y su adición no influye
significativamente en cambio de

5. color, en tanto que los géneros que
fueron decolorados por el alcohol,
se tiñen con la safranina,
adquiriendo un color de 199.
Coloración de "Ziehl Neelsen.
Algunos géneros microbianos dentro
de los que se incluyen las
microbacterias, tienen la propiedad
de retener el colorante con que han
sido teñidas, aunque sean
sometidos a la acción de solventes
tan fuertes como los ácidos para su
decoloración, el primer método de
coloración para este tipo de
microorganismo, fue concebido y
aplicado por Robert Koch,
descubridor del agente causal de la
tuberculosis (Mycobacterium
tuberculosis o Bacilo de Koch. Fue
modificada y perfeccionada
posteriormente por Ziehl y Neelsen.
Este método se utiliza hoy en día,
con alguna que otra modificación en
función de las particularidades de la
especie en estudio.
Principio Las microbacterias, como
el Mycobaccterium tuberculosis y
otras especies susceptibles de ser
coloreadas por esta técnica, se
caracterizan por tener una alta
proporción de ácido micolico
(lípidos) en su pared celular. La
acción del calor, introducido en este
método, hace que la misma se
permeabilice y haga accesible la
penetración de la fucsina, tiñéndose
la pared celular. Al normalizarse la
temperatura de la preparación, el
compuesto lipídico impermeabiliza la
pared a la acción del decolorante
ácido, con lo cual el microorganismo
se mantiene teñido. El resto de las
especies, así como las células
epiteliales y otros artefactos, que no
disponen de ácido micólico en su
pared o membrana, son
decolorados, después de teñidos
por la fucsina.
Fundamento técnico Al someter el
frotis a la acción de la Fucsina,
todos los microorganismos,
independientemente de que
dispongan o no de ácido micolico en
sus respectivas paredes celulares
serán coloreados de rojo. Al aplicar
el decolorante ácido, las especies
que posean el ácido micolico en la
pared, resisten la acción decolorante
y se mantienen teñidas de rojo, en
tanto que las demás se quedan
incoloras. Al aplicar la coloración de
contraste (azul de metileno) las
bacterias que retuvieron el color
proporcionado por la fucsina, no
sufren ninguna alteración
permaneciendo de color rojo, pero
las especies que si fueron
decoloradas, se tiñen de azul, al
igual que las células epiteliales y
otros artefactos presentes en la
preparación.
Coloración Fragelar de Leifson
(modicficación de Clark)
Los flagelos son estructuras, cuyo
diámetro no excede de los 30mm, lo
cual está muy por debajo del poder
de resolución del
microscópicoóptico. Para hacer
visibles a los flagelos se requiere
aumentar su grosor, para lo cual se
emplea una suspensión de
ácidotánico que al precipitarse sobre
su cubierta forman una capa que
aumenta aparentemente su
diámetro. Lo que propicia que al ser
posteriormente coloreado, tanto los
flagelos como su disposición con

6. respecto al bacilo se hagan visibles
al microscopista.
Coloración de cápsula.
La cápsula es una sustancia viscosa
producida por algunas especies que
la sintetizan a partir de polipéptidos,
polímeros de glucosa u otros
aminoazúcares que contienen
nitrógeno, que después de
combinarse con el agua es
segregada por todo el contorno de la
pared celular como un moco
gelatinoso. Cuando la cápsula ha
sido producida puede observarse en
los frotis coloreado por el método de
Gram como un halo incoloro
alrededor de la bacteria. Cuando se
requiere ver la cápsula con más
detalle o inducir su producción se
recurre a coloraciones especiales.
3. ¿Qué es un colorante y como se
combinan con los diferentes
componentes celulares?
Los colorantes son sustancias de
origen químico o biológico,
generalmente tintes, pigmentos,
reactivos u otros compuestos,
empleados en la coloración de tejidos
microorganismos para exámenes
microscópicos, debiendo tener al
menos, un grupo cromóforo que le
proporcione la propiedad de teñir.
En el proceso de la coloración, ocurre
una combinación de reacciones
físicas y químicas.
Reacción física: Ocurre un
fenómeno de absorción similar al que
tiene lugar en las materias porosas,
considerando que el colorante
penetra en los intersticios del cuerpo
coloreable y se mantiene allí por la
cohesión molecular.
Reacción química:Las células
microbianas son ricas en ácidos
nucleicos que portan cargas
negativas en formas de grupos
fosfato combinándose como colorante
básicos cargados positivamente. Los
colorantes ácidos que tienen la
acción colorante en el anión no tiñen
la célula, empleándose como
colorante de contraste para colorear
su entorno, como por ejemplo: la tinta
china o la eosina que no colorea al
microorganismo, pero si el fondo del
campo microscópico.
4. ¿Qué es un mordiente?
mencione ejemplos.
Reactivos mordientes. Son los
reactivos o sustancias que preparan
al tejido para la coloración,
comunicándole las apetencias
colorantes. El uso de los reactivos
mordientes es imprescindible en
aquellos casos en que la materia
orgánica se muestra refractaria a los
colorantes. Los reactivos fijadores
pueden servir, a la vez, de
mordientes: el Alcohol Etílico, por
ejemplo, fija, deshidrata, y, si su
acción no se prolonga, viabiliza la
coloración. Del mismo modo, el
ácido crómico actúa como mordiente
y fijador. Otros fijadores, en cambio,
modifican las características
colorantes del tejido: los ácidos
pícricos y óstnico, por ejemplo,
perjudican la tonalidad de la
hematoxilina.
Muchos colorantes se aplican en
unión de sustancias que actúan
como mordientes, tales como el
alumbre, el bicromato potásico, el
tanino, y el acetato de cobre.

7. 5. Mencione ejemplos de 3
bacterias Grampositivas y 3
Gram negativas. Señale
suimportancia.