Tugas Bioteknologi Molekuler

1. JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2016
Kelompok 5 :
IRWAN (F1C1 13072)
LA ODE AGUS SALIM (F1C1 13068)
AMINA SARI MUIS (F1C1 13006)
WIWI DAYANTI (F1C1 13074)
“BIOTEKNOLOGI MOLEKULER”
SEKUENSING DNA

2. SEJARAH
SEKUENSING
SUB MATERI
PENDAHULUAN
PRINSIP
SEKUENSING
METODE
SEKUENSING

3. DNA (DEOXYRIBO NUCLEIC
ACID
PENDAHULUAN
Suatu Asam Nukleat yang
menyimpan segala informasi
biologis dari setiap makhluk
hidup yang menentukan
jenis rambut, warna kulit
dan sifat-sifat khusus dari
manusia
DNA dapat mereplikasi
membentuk salinannya sendiri
dan setiap untainya berisi atas
unit berulang yang disebut
nukleotida

4. Metode Penentukan urutan basa nukleotida,
adenin, guanin, citosin, timin pada sepotong DNA.
Sekuensing
Urutan Basa
Nukleotida
Urutan
Asam Amino
Struktur
Protein Dan
Fungsinya
Perubahan
Sequence
DNA
Perubahan
Protein
Protein Non
Fungsional

5. SEJARAH SEKUENSING DNA
Robert Holley (1965)
Cornell University di
New York, Amerika
Serikat
Mempublikasikan sekuens tRNA alanin dari
khamir yang terdiri atas 77 nukleotida selama 7
tahun dan hasilnya merupakan sekuens DNA
yang pertama kali dipubilkasikan adalah DNA
sepanjang 12 nukleotida dari bakteriofag lambda
(1971)
Federick Sanger dan
Alan Coulson (1975)
Medical Research
Council Inggris
Mempublikasikan metode sekuensing DNA
secara langsung disebut teknik plus-minus.
Dan berhasil melakukan sekuensing DNA
sebagian besar Genom bakteriofog
sepanjang 5.375 nukleotida dan dipublis
pada tahun 1977
Februari 1977, Allan Maxam
dan Waltert Gilbert dari
Harvard University
mempublikasikan sekuensing DNA mereka

6. PRINSIP DASAR
SEKUENSING DNA
DNA sequencing menggunakan metode PCR
(Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya.
DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya
dijadikan sebagai cetakan (template)
kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan
bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR,
namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu
seperti buffer, dNTPs dan ddNTP. Proses ini
dinamakan cycle sequencing

7. KOMPENEN-KOMPONEN SEQUENSING
Bahan-bahan sekuensing DNA Fungsi
DNA Template/ DNA Strand Sebagai Cetakan DNA
DNA Primer Beberapa pasang basa pada
DNA
DNA Polimerase I Enzim yang merepikasi DNA,
berfungsi memperpanjang
dNTP Bahan pembentuk sintesis DNA
ddNTPs (ddATP, ddTTP, ddCTP,
ddGTP)
Menghentikan reaksi
pemanjangan untai DNA atau
sintesis DNA

8. Maxam Gilbert Method
(REAKSI KIMIA)
Sanger Method
(REAKSI ENZIMATIK)
Next Generation
Sequensing

9. Maxam Gilbert Method
(Reaksi Kimia)
♦ Metode pengakhiran rantai (chain
termination) dan degradasi kimia.
♦ Didasarkan pada pembelahan nukleotida
oleh bahan kimia yang spesifik.
♦ tidak mmerlukan DNA untai ganda
sehingga tidak memerlukan primer untuk
mensintesi untai baru kembali.
♦ Pemotongan DNA terjadi secara kimia
sehingga reagen kimia tertentu harus
ditambahkan kedalam sistem reaksi.

10. • piperidin
• Hidrazin
• Dimetil sulfat
• Asam format
SENYAWA KIMIA METODE
MAXAM- GILBERT

11. Tahapan Metode Maxam Gilbert
► Sekuen molekul DNA untai ganda yang akan digunakan dipotong bagian posisi
ikatan antara fosfat dan guladeoksiribosa menggunakan piperidin
► Fragmen DNA diberilabel pada salah satu ujungnya atau pada nukleotida 3’
menggunakan fosfat radioaktif
► Basa dimodifikasi dengan spesifik menggunakan bahan kimia tertentu.
a.Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G
b. Asam format menyerang A dan G
c.Hidrazin akan menghidrolisis C dan T
d.Hidrazin, piperidin dan garam bekerja pada C
► Kemudian akan diperoleh empat fragmen yang berbeda masing-
masing ujungnya adalah G, A atau G, C atau T dan C.
► Dilihat laju migrasi masing-masing fragmen dalam bentuk pita. Dengan cara
membandingkan lajur pertama dan kedua, serta lajur ketiga dengan keempat.
► Diurutkan berdasarkan lajur migrasinya dari yang terkecil ke yang besar.

12. Reaksi Purin dengan dimetil sulfat Reaksi Pirimidin dengan dimetil sulfat

17. KELEBIHAN DAN
KEKURANGAN
KELEBIHAN KEKURANGAN
Memiliki Tekhnik yang Rumit
Menggunakan Bahan Kimia yang
berbahaya seperti hydrazine yang bersifat
neurotoxin
Kesulitan dalam Scale-up
Dapat digunakan baik untuk
DNA ganda maupun tunggal
Menghasilkan fragmen yang
bermacam-macam

18. Metode Sanger
Metode yang pertama kali
dikembangkan oleh Frederick
Sanger pada tahun 1975,
yaitu dengan melakukan
reaksi cycle sequencing pada
empat tabung terpisah yang
masing-masing berisi semua
pereaksi yang dibutuhkan.

19. Metode Sanger menggunakan dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs) yang
memiliki sebuah H pada karbon-3 dari gula ribosa. Yang normal memiliki OH pada
deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).
Dideoxynucleotides merupakan penghenti rantai. Dalam reaksi sintesis jika
dideoxynucleotide ditambahkan dan bukan normal deoxynucleotide, sintesis akan
berhenti karena 3’OH yang diperlukan untuk penambahan nukleotida berikutnya
tidak ada.

20. Metode Sanger
1. DNA utas sebagai template DNA
2. Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan
template DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasi
3. DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida
baru ke ujung 3 dari template
4. Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan
pewarna fluorescent)
6.Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal tetapi secara
random dideoxy nukleotida diambil (dipasangkan).

21. 7. Penambahan dideoxynukeotida menyebabkan reaksi berhenti. Khusus
untuk ddNTP, yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap
tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C
jika ddCTP dan T jika ddTTP.
8. Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang
berbeda selama elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan
1
2
3
4

24. • kelebihAN DAN KEKURANGAN

25. • VIDEO

26. Ekstraksi DNA
Untuk
sekuensing DNA
Sekuensing
menggunakan Dye
Terminator Sekuensing
Dengan
bahan Kimia
Faktor Penentu
keberhasilan
sekuensing
DNA
FAKTOR PENENTU
KEBERHASILAN
SEKUENSING DNA
Sekuensing
menggunakan
Dye primers

27. Nex Generation
Teknik pemetaan DNA yang
berdasarkan deteksi terhadap
pirofosfat (PPi) yang dilepaskan
selama sintesis DNA.
Teknik ini memanfaatkan reaksi
enzimatik yang dikatalisis oleh ATP
sulfurilase dan luciferase untuk
pirofosfat inorganik yang
dilepaskan selama penambahan
nukleotida.
Pyrosequencing

28. Metode sekuensing ini ditemukan
oleh perusahaan Illumina.
 Sekuensing Illumina
menggunakan primer yang akan
berkomplemen dengan adaptor
yang telah disediakan oleh
perusahaan pada sebuah plat.
Proses sekuensing ini
menggunakan teknik bridge PCR,
yaitu terbentuknya jembatan pada
saat elongasi. Nukleotida penghenti
akan diberikan dan pendaranan
fluoresens akan direkam oleh
kamer
Ilumina

29. Aplikasi Sekuensing DNA
untuk menentukan
identitas maupun fungsi
gen atau fragmen DNA
lainnya dengan cara
membandingkan
sekuens-nya dengan
sekuens DNA lain yang
sudah diketahui.
riset dasar biologi
Kedokteran
bioteknologi
forensik
Sekuensing DNA dapat digunakan untuk
mengidentifikasi, mendiagnosis, dan
mengembangkan pengobatan penyakit
genetik
ilmu pengobatan
Sebagai Contoh :

30. ALAT-ALAT SEKUENSING
DNA
APPLIED BIOSYSTEMS PRISM 3100
(CAPILLARY, 16 CAPILLARIES) APPLIED BIOSYSTEMS PRISM 3700
(CAPILLARY, 96 CAPILLARIES)

31. Metode untuk sekuensing protein
umumnya melibatkan pemutusan ikatan
yang diikuti dengan identifikasi asam
amino.
SEKUENSING PROTEIN
Sekuensing protein atau sekuensing
peptida adalah penentuan urutan asam
amino pada suatu protein atau peptida
(oligopeptida maupun polipeptida
Senyawa organik kompleks
berbobot molekul tinggi dari
monomer-monomer asam
amino yang dihubungkan satu
sama lain oleh ikatan peptida
PROTEIN

32. Metode Klasik Metode Modern
Edman
Degradation
Mass
Spectrometry
Metode Sekuencing Protein

33. Setelah setiap pemotongan, residu asam amino yang
telah dipotong tersebut dapat diidentifikasi
menggunakan kromatografi
METODE KLASIK
DEGRADASI EDMAN
metode degradasi Edman, residu pada ujung-N
(ujung amino) protein dipotong satu per satu
dengan reaksi kimia

34. Metode Degradasi Edman
Reaksi Edman untuk memotong dan menderivatisasi asam amino
yang terpenggal. Derivat asam amino diidentifikasi menggunakan
kromatografi atau elektroforesis dengan standar 20 asam amino
derivat.

35. METODE MODERN
MASS SPECTROSCOPY
Metode ini memanfaatkan spektrometri massa yang mampu mengukur
massa peptida dengan tepat
Protein yang hendak di-sekuensing dipotong-potong secara enzimatik
maupun kimia menjadi peptida-peptida yang kemudian dianalisis
menggunakan spektrometri massa.
Dalam proses spektrometri massa, peptida-peptida tersebut dipecah
secara ionisasi, misalnya dengan bantuan laser

36. MS PROCEDURES FOR
SEQUENCE IDS

37. PROTEIN SEQUENCING:
OVERLAPPING SEQUENCES

38. PROTEIN SEQUENCE
FROM DNA SEQUENCE

39. APLIKASI SEKUENSING
DNA DAN PROTEIN
Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk :
-Mengidentifikasi tersangka potensial yang mungkin
cocok dengan DNA bukti di TKP
-Mencocokkan donor organ dengan penerima dalam
program transplantasi
-Menentukan silsilah untuk benih atau bibit ternak.

40. Sekian dan Terima Kasih