O documento discute conceitos de genética microbiológica e biotecnologia, incluindo estrutura e função do material genético, fluxo da informação genética, regulação da expressão gênica bacteriana, mutação, transferência genética, tecnologia do DNA recombinante e suas ferramentas como enzimas de restrição, vetores e reação em cadeia da polimerase.

1. MICROBIOLOGIA GERAL
Profa. Lúcia Schuch Boeira

2. GENÉTICA MICROBIANA
1. Estrutura e função do material genético
 Genótipo e Fenótipo
 DNA e Cromossomos
2. O Fluxo da Informação Genética
 Replicação do DNA
 RNA e Síntese Protéica
3. A Regulação da Expressão Gênica Bacteriana
 Repressão e Indução
 O Modelo Operon de Expressão Gênica
4. Mutação: Alteração no Material Genético
 A Frequência de Mutação
 Identificando Mutantes
 Identificando Carcinógenos Químicos
5. Transferência Genética e Recombinação
 Transformação em Bactérias
 Conjugação em Bactérias
 Transdução em Bactérias
 Plasmídeos e Transposons
 Genes e Evolução

3. GENÉTICA MICROBIANA

4. BIOTECNOLOGIA E DNA
RECOMBINANTE
6. Tecnologia de DNA Recombinante
– Visão Geral da Metodologia do DNA Recombinante
– Ferramentas de Biotecnologia
• Seleção
• Mutação
• Enzimas de Restrição
• Vetores
• Reação em Cadeia da Polimerase
7. Técnicas de Engenharia Genética
– Introdução de DNA Exógeno nas Células
– Obtendo DNA
– Selecionando um Clone
– Fazendo um Produto Gênico

5. TECNOLOGIA DO DNA
RECOMBINANTE, MANIPULAÇÃO
GÊNICA
 O que é ?
 é o termo utilizado para descrever algumas técnicas modernas que estão
revolucionando o campo da Biotecnologia.
 consiste num conjunto de técnicas e ferramentas que permite identificar,
isolar, manipular e multiplicar os genes de organismos vivos.
 Estas técnicas incluem:
 a cultura de células,
 o uso de isótopos radioativos,
 a clonagem molecular,
 o aperfeiçoamento das técnicas de obtenção, purificação e manipulação de
enzimas.

6. TECHNOLOGIA DO DNA
RECOMBINANTE
• Refere-se a manipulação artificial de genes
• Objetivo:
• introduzir novas características ou atributos fisiológicos ou físicos
em seres vivos, como por exemplo:
– Tornar uma planta resistente a um herbicida
– Produção de insulina por bactérias
• Um gene de um animal vertebrado, inclusive do homem, pode ser inserido
no DNA de uma bactéria , o receptor pode expressar o gene e codificar um
produto comercialmente útil

8. TECHNOLOGIA DO DNA
RECOMBINANTE
 Refere-se a manipulação artificial de genes
 Utiliza várias ferramentas e técnicas

9. FERRAMENTAS
 Enzimas de restrição:
 Corta fragmentos de DNA em locais específicos
 Ligase:
 Unir os fragmentos de DNA
 Vetores:
 “Veículo” de transporte de DNA exógeno para um
organismo hospedeiro
 Reação da Cadeia da Polimerase (PCR)
 Processo que faz várias cópias de um fragmento de DNA
 Gel eletroforese
 Processo onde fragmentos de DNA são classificados de
acordo com o tamanho

10. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
 É uma das ferramentas essenciais em engenharia genética
 Apresentam a habilidade de cortar moléculas de DNA em
sequências bastante precisas de 4 a 8 pares de bases
 Sítios de restrição
 Utilizando um “kit” com mais de 400 enzimas de restrição que
reconhecem cerca de 100 sítios de restrição os geneticitas são
capazes de:
 Isolar DNA
 Sequenciar DNA
 Manipular gene individuais
Ferramentas

11. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Ferramentas

12. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Ferramentas

13. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
• Quando uma enzima de restrição digere o DNA, ela produz um
corte em cada fita, podendo resultar em:
– extremidades colantes ou adesivas
– extremidades cegas: sem bases despareadas.
• Cada vez que elas encontram um sítio de restrição que lhes é
próprio, clivam o sítio.
Ferramentas

14. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
 A enzima HaeIII reconhece uma sequência de 4 nucleótidos e
produz cortes simétricos ("blunt").
 A enzima BamHI reconhece uma sequência de 6 nucleótidos e
origina cortes assimétricos e coesivos (“sticky”).
Ferramentas

15. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
1. A enzima de restrição corta a molécula de DNA de fita
dupla nos sítios de restrição específicos
2. Os cortes produzem um fragmento de DNA com duas
extremidades adesivas
3. Quando dois fragmentos de DNA cortados pela mesma
enzima de restrição são colocados juntos, eles podem se
unir pelo pareamento de bases
Ferramentas

16. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Ferramentas

17. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
• Tesouras moleculares
• Cortam DNA em sequências específicas
– Reconhece e cliva, ou digere, somente uma
determinada sequencia de bases nucleotídicas
no DNA
Ferramentas

18. LIGAÇÃO
• Fragmentos de DNA produzidos pelas enzimas de restrição podem ser unidos pelo
processo de ligação
– Os pedaços são unidos por uma enzima denominada DNA ligase
• DNA de origens diferentes produzidos desta maneira é chamado de DNA
recombinante
– DNA combinado de origens diferentes
• A utilização das ferramentas enzimas de restrição e ligação combinadas são
técnicas básicas da engenharia genética.
Ferramentas

19. LIGAÇÃO
1. Dois pedaços de DNA são cortados usando a mesma enzima de
restrição
Ferramentas

20. VETORES
• “Veículo” de transporte de DNA exógeno para um organismo hospedeiro
• Existe um grande número de tipos diferentes de moleculas de DNA que podem ser utilizadas
como vetores
– Exemplo: plasmídeo, vírus, etc.
• A escolha de um vetor adequado depende de muitos fatores, como
– Organismo que receberá o novo gene
– Tamanho do DNA a ser clonado
• A inserção de um fragmento de DNA num vetor implica a utilização de enzimas de restrição e
ligases.
Ferramentas

21. VETORES
 Propriedade mais importante
 Auto-replicação
 Uma vez no interior de uma célula, um vetor deve ser
capaz de replicar-se
 Tamanho que permita que eles sejam manipulados fora da
célula, durante o processo de construção do DNA
recombinante
 Gene marcador para seleção (antibiótico, genes de
proteínas fluorescentes, marcadores metabólicos ou
auxotróficos)
 Quando é necessário recuperar células contendo o vetor, a
presença de um gene marcador no vetor pode muitas vezes
facilitar o processo de seleção. Genes marcadores mais
comuns:
 Genes para resistência a antibióticos
 Genes para enzimas que realizam reações facilmente identificáveis
Ferramentas

22. VETOR - PLASMÍDEO
Ferramentas

23. VETOR - PLASMÍDEO
Ferramentas
Esquema para a obtenção de
plasmídeos recombinantes, a partir
do uso de uma enzima de restrição
que cria extremidades coesivas.
Ao menos 5 produtos distintos
podem ser formados a partir
desta mistura.

24. VETOR - PLASMÍDEO
Ferramentas
O produto 1 é o desejado, no qual um inserto (verde) foi clonado
no plasmídeo (vermelho).
O produto 2 é o mais danoso ao processo, pois se trata do plasmídeo
vazio, fechado sem inserto. Ele é perfeitamente funcional e não pode
ser descartado do processo.
O produto 3 é a circularização de vários fragmentos de DNA do doador,
numa ordem qualquer. Este "lixo" não é problemático, porque não
contém uma origem de replicação bacteriana. É um DNA que será
perdido ao longo do tempo.
O produto 4 é a união de dois (ou mais) plasmídeos e não se replica
tão rápido quando o plasmídeo vazio ou carregado com apenas um
inserto, de forma que acaba desaparecendo ao longo do tempo.
O último "lixo" é o plasmídeo carregado com vários insertos
catenados (ligados em cadeia) ou com um inserto muito grande.
É uma construção instável, também, e tende a desaparecer.

25. REAÇÃO DA CADEIA DA POLIMERASE
(PCR)
 Amplificação de DNA
 Vários procedimentos na tecnologia do DNA
exigem uma grande quantidade de DNA, como:
Sequenciamento de DNA
DNA fingerprinting
Clonagem de gene
Ferramentas

26. REAÇÃO DA CADEIA DA POLIMERASE
(PCR)
 Pequenas amostras de DNA podem ser rapidamente
amplificadas
 Iniciando com somente um fragmento de DNA, a PCR
pode ser utilizada para produzir literalmente bilhões
de cópias em poucas horas
Ferramentas

27. PROCESSO - PCR
1. Amostra de DNA - chamada de DNA alvo
2. DNA é desnaturado (separado) pelo aquecimento a
98ºC por 5 min
3. Primer é ligado a fita de DNA
4. A amostra é resfriada a 60ºC. A enzima DNA
polimerase se liga a cada uma das fitas de DNA
expostos. Esta enzima sintetisa a fita complementar
de DNA utilizando nucleotídeos livres.
5. Após um ciclo, existem duas cópias da amostra
original
Ferramentas

28. PROCESSO - PCR
 Termociclador
 Pode ser ajustado para temperatura, tempo e número de ciclos
desejados
Ferramentas

29. PASSOS NO PROCESSO PCR
 Passo 1: separar as fitas de DNA
 Aquecimento a 98ºC por 5 min
 Passo 2: adicionar a mistura de reação
 Primers, nucleotídeos e a enzima DNA polimerase
 Passo 3: incubação
 Resfriar a 60ºC e incubar por alguns minutes. Durante este
tempo, os primers se unem as fita simples de DNA. DNA
polimerase sintetiza a fita complementar
Repetir várias vezes (cerca de 25 ciclos)
Repetir o ciclo (aquecer e resfriar) até que cópias suficientes de DNA tenham sido produzidas
Ferramentas

30. REAÇÃO DA CADEIA DA POLIMERASE
(PCR)
Ciclos
PCR
Nº de
fitas de
DNA
1 2
2 4
3 8
10 1.024
12 4.096
16 65.536
18 262.144
20 1.048.536
25 33.554.432
Os fragmentos amplificados acumulam exponencialmente na reação.
Ferramentas

31. ELETROFORESE
 Já conhecida desde 1930
 Difundida em 1950-1960
 Movimentação de moléculas submetidas a campo elétrico
 Usa um substrato: papel, agarose, poliacrilamida
 Separa proteínas por cargas e peso molecular
 Separa ácido nucléicos por peso molecular
Ferramentas

32. ELETROFORESE
 Os fragmentos de DNA formados com a ação das enzimas
de restrição possuem tamanhos diferentes.
 A técnica de separação dos fragmentos de DNA mais
utilizada é a eletroforese através de géis de agarose.
 Agarose: é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que dissolve em
água fervente e então gelifica quando esfria como a gelatina.
 Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é preparado.
 DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma
corrente elétrica é aplicada através do gel.
 Como o DNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo
eletrodo positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o
DNA deve migrar através do gel de agarose.
Ferramentas

33. ELETROFORESE
Ferramentas

34. Ferramentas

35. ELETROFORESE EM GEL DE
AGAROSE
Ferramentas

36. ELETROFORESE EM GEL DE
AGAROSE
Visualização do DNA em luz ultravioleta
Ferramentas

37. ELETROFORESE
 Separa os fragmentos de DNA de acordo com tamanho
 Os fragmentos de DNA menores podem migrar através
de um gel de agarose mais rapidamente que os
fragmentos de DNA maiores.
Ferramentas

38. ELETROFORESE
É possível calcular o
tamanho exato de
um dado fragmento
com base na sua
razão de migração.
Ferramentas

39. TÉCNICAS DE ENGENHARIA
GENÉTICA
 Introdução de DNA exógeno nas células
 Obtenção de DNA
 Selecionando um clone
 Fazendo um produto gênico

40. INTRODUÇÃO DE DNA EXÓGENO NAS
CÉLULAS
 Natureza:
 Os plasmídeos são geralmente transferidos entre microrganismos de
parentesco próximo por contato célula-célula, como na conjugação.
 Engenharia genético:
 Um plasmídeo deve ser inserido em uma célula por transformação, um
processo durante o quel as células podem captar DNA do ambiente
circundante.
 Muitos tipos celulares não são competentes para a
transformação, incluindo células:
 E. Coli
 Leveduras
 Mamíferos

41. INTRODUÇÃO DE DNA EXÓGENO NAS
CÉLULAS
 Existem vários tratamentos para tornar as células competentes (capazes de
captar DNA externo):
 Tratamentos químicos
 E.coli torna-se competente após incubação das células em uma solução de cloreto
de cálcio por um período breve
 Choque térmico:
Técnicas

42. INTRODUÇÃO DE DNA EXÓGENO NAS
CÉLULAS
 Existem vários tratamentos para tornar as células competentes (capazes
de captar DNA externo):
 Tratamentos químicos
 E.coli torna-se competente após incubação das células em uma solução de
cloreto de cálcio por um período breve
 Processo de eletroporação
Técnicas
• Utiliza uma corrente elétrica para formar poros
microscópicos nas membranas celulares.
• Geralmente aplicável a todas as células
• Algumas células devem ser convertidas em
protoplastos (remoção enzimática da parede
celular)

43. INTRODUÇÃO DE DNA EXÓGENO NAS
CÉLULAS
 Existem vários tratamentos para tornar as células competentes (capazes
de captar DNA externo):
 Fusão de protoplastos
 Manipulação genética de vegetais e algas
 Pistola de genes
 Células vegetais
 Dispositivo que dispara microprojéteis (partículas microscópicas de tunstênio
ou de ouro de 4 µm de diâmetro) recobertos com o DNA a ser introduzido na
célula
Técnicas

44. INTRODUÇÃO DE DNA EXÓGENO NAS
CÉLULAS
 Existem vários tratamentos para tornar as células competentes (capazes
de captar DNA externo):
 Microinjeção
 Células animais
Técnicas

45. OBTENÇÃO DE DNA
 Vimos como os genes podem ser clonados em vetores
com a utilização de enzimas de restrição e como eles
podem ser transformados ou transferidos para vários
tipos celulares.
 Como os engenheiros genéticos obtêm os genes em que
estão interessados ?
Existem duas fontes principais:
 Bibliotecas de genes contendo cópias naturais ou cópias de cDNA
dos genes produzidos a partir mRNA
 DNA sintético
Técnicas

46. OBTENÇÃO DE DNA
 Biblioteca genômica
 É o conjunto de bactérias
albergando plasmídeos
quiméricos ou recombinantes
construídos a partir de DNA
genômico
Técnicas
Em princípio, se cortamos um genoma de um organismo qualquer em
pedaços com uma enzima e construímos uma biblioteca suficientemente
grande (isto é, com muitos clones, ou bactérias, diferentes uns dos outros),
teremos uma probabilidade alta de termos qualquer fragmento de
DNA desejado em algum dos clones.

47. OBTENÇÃO DE DNA
 DNA complementar (cDNA)
 O cDNA é obtido a partir do
mRNA por complementaridade
de bases.
Técnicas
Esta transcrição em sentido inverso é conseguida através da ação da enzima viral
denominada transcriptase reversa. Assim, o mRNA funciona como molde para a
síntese de uma cadeia de DNA. Após a formação da cadeia de DNA, a enzima
DNA polimerase atua, formando, por complementaridade, a outra cadeia de DNA a
partir dos nucleótidos presentes no meio, constituindo-se uma molécula estável.

48. OBTENÇÃO DE DNA
Técnicas

49. OBTENÇÃO DE DNA
 DNA sintético
 Sintetizar o gene, nucleotídeo por nucleotídeo, na sequência
desejada.
 Isto é feito normalmente para genes que codificam polipeptídios
ou proteínas de pequeno tamanho.
 Para executar esta técnica basta conhecer a sequência de
aminoácidos da proteína desejada e, com base no conhecimento
do código genético, construir a sequência de nucleotídeos que
corresponde exatamente à sequência de aminoácidos da
proteína.
Técnicas

50. SELECIONANDO UM CLONE
 Na clonagem, é necessário selecionar aquela célula que
contenha o gene de interesse específico.
 Isso é difícil, pois dentre milhões de células, apenas algumas
poucas podem conter o gene desejado
 Processo de seleção típico conhecido como seleção branca-azul
 Nome derivado da cor das colônias bacterianas formadas no final do
processo de seleção
 Operon lac
 Ampicilina
Técnicas

51. SELECIONANDO UM CLONE
 Seleçãopor genes de
resistência a antibióticos
Técnicas
Plasmídeo vetor

52. SELECIONANDO UM CLONE
Técnicas

53. SELECIONANDO UM CLONE
Técnicas

54. CONSTRUÇÃO DE UM
MICRORGANISMO
RECOMBINANTE
1. Obtenção do DNA a ser clonado1. Obtenção do DNA a ser clonado
2. Preparação do vetor2. Preparação do vetor
3. Ligação do vetor com o “inserto”3. Ligação do vetor com o “inserto”
4. Transformação da bactéria4. Transformação da bactéria
5. Seleção dos clones recombinantes5. Seleção dos clones recombinantes

55. TECNOLOGIA DO DNA
RECOMBINANTE
 Cada fragmento de DNA, que foi clivado e separado do
resto do material genético, contém um ou mais genes.
 cada gene origina uma proteína, portanto ao estudarmos o gene
estamos estudando a proteína que ele codifica.
Mas o que devemos fazer para estudar o gene?
 Devemos introduzi-lo no material genético (no DNA) de um
hospedeiro para que ocorra a transcrição do gene, em
mRNA, e a tradução em proteína.

56. TECNOLOGIA DO DNA
RECOMBINANTE O plasmídio é retirado das células bacterianas para que se possa inserir o
gene de estudo, para depois recolocá-lo na bactéria.

57. PROCESSO PASSO A PASSO:1. Os pesquisadores querem introduzir um gene humano que produz uma
proteína em uma bactéria.
2. Os pesquisadores “recortam” (utilizando enzimas de restrição), do DNA
humano, o gene de interesse.
3. Esse fragmento de DNA contendo o gene é multiplicado por PCR para
obtermos várias cópias do mesmo fragmento (ou da mesma informação).
4. A mesma enzima que clivou o gene do DNA humano é utilizado para clivar o
plasmídio bacteriano. Lembre-se que o fragmento de DNA, ao ser clivado,
gera pontas adesivas que são complementares ao plasmídio se este for clivado
com a mesma enzima.
5. A seguir o plasmídio clivado é misturado com os fragmentos de DNA
(contendo o gene) e uma enzima chamada ligase ,“cola” os fragmentos ao
plasmídio, produzindo o chamado DNA recombinante. Isso feito, o DNA
recombinante é introduzido em uma bactéria hospedeira.
6. A bactéria hospedeira é colocada em um meio nutritivo seletivo, apenas
aquelas que possuem o DNA recombinante crescem, formando colônias. Após
muitas gerações de bactérias, o produto da expressão dos genes, as proteínas
humanas, são purificadas das bactérias (são separadas das proteínas das
bactérias).

58. Processo passo a passo:

65. APLICAÇÕESDAENGENHARIA
GENÉTICA