Practica de Laboratorio de Bioquímica- Extracción del ADN vegetal

1. “Año de la Diversificación Productiva y del Fortalecimiento
de la Educación”
BIOQUIMICA
Docente: Jorge Cordero Azabache
Alumnos:
Ccancce Martínez Anais..................... U2008110426
Semestre: VI
HUANCAYO – 2015-11
EXTRACCION DEL ADN
ANIMAL

2. EXTRACCIÓN DEL ADN VEGETAL
OBJETIVOS
Extraer ADN en muestras de tejidos vegetales.
MATERIALES
 Cebolla o espinaca o tomate 200 gr.
 Varilla de vidrio.
 Alcohol de 96°
 Cloruro sódico 2M
 SDS El dodecilsulfato sódico ( cualquier detergente concentrado)
 Pedazos de gasa para filtrar.
 Vasos precipitados de 200 ml o 500 ml.
 Probeta.
 Embudo.
 Mortero y pilón.
PROCEDIMIENTOS
1. Realizar la solución tapón:
 En una fiola agregar 1.5 g de cloruro de sodio.
 Después se le agrega 5 g de bicarbonato de sodio a la fiola.
 Se le agrega 120 ml de agua destilada a la muestra.
 Se le agrega 5 ml de shampoo o jabón líquido.
 Se procede a homogenizar la solución.
Preparación del tejido vegetal
2. Cortar en trozos el tejido vegetal con ayuda del cuchillo.
3. Depositarlo en la licuadora los trozos del vegetal.
4. Añadir al triturado, 100 centímetros cúbicos de agua destilada.
5. Remover hasta hacer una especie de papilla o puré (un lapso de 15 segundos).
6. Filtrar con un colador en un vaso precipitado.
Proceso del separado de ADN
7. Medir el volumen del filtrado de 5 ml a una fiola.
8. Agregar 10 ml de la muestra de tapón a la misma fiola.
9. Después se agita vigorosamente.
10. Se toma 5 ml de la mezcla para pasarlo en un tubo de ensayo y añadimos 10 ml
de alcohol frio.
11. Te toma una varilla y lo introducimos dentro del tubo de ensayo en la mitad donde
se encuentra el alcohol y la solución problema dando movimientos levemente de
atrás hacia adelante por un tiempo de 1 minuto.
12. Por encima del tubo de vidrio se van adhiriendo unas fibras blancas, visibles a
simple vista, que son el resultado de la agrupación de muchas fibras de ADN.

3. RESULTADOS
Capa de
ALCOHOL
INTERFASE
con el ADN
Capa de
FILTRADO

4. DISCUSION
En la práctica de laboratorio extracción del ADN vegetal, se identificó y se obtuvieron los
siguientes resultados:
Al extraer el ADN del tejido vegetal, del tomate en el cual se vio la separación en capas
con la agrupación de muchas fibras de ADN, de manera que para extraer los ácidos
nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las
nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. El
procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser
suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo, pero suficientemente
suave para preservar el ácido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis
figuran los siguientes: rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.); tratamiento
químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc.); digestión
enzimática (Proteinasa K, etc.).
De manera que concuerda con lo siguiente: Las células vegetales pueden lisarse con el
detergente iónico bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB), que forma un complejo
insoluble con los ácidos nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacáridos,
los compuestos fenólicos y los demás contaminantes permanecen en el sobrenadante y
pueden eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la
concentración salina y se precipita con etanol o isopropanol. El protocolo del método del
bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) (Murray y Thompson, 1980) y publicado

5. posteriormente, en 1987 (Wagner et al., 1987). El método es adecuado para extraer y
purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de vegetales y está especialmente
indicado para eliminar los polisacáridos y los compuestos polifenólicos, que, de otro
modo, alterarían la pureza del ADN y, por tanto, su calidad
Así mismo se concuerda: al separarse los complejos formados por los ácidos nucleicos y
el CTAB de los polisacáridos, los compuestos fenólicos, las proteínas y los demás lisados
celulares disueltos en la solución acuosa. Es especialmente importante eliminar los
polisacáridos y los compuestos fenólicos, pues pueden inhibir numerosas reacciones
enzimáticas. En concentraciones hiposalinas (NaCl < 0,5 M), los contaminantes de los
complejos de ácidos nucleicos no precipitan y pueden eliminarse extrayendo la solución
acuosa con cloroformo. El cloroformo desnaturaliza las proteínas y facilita la separación
de las fases acuosa y orgánica. La fase acuosa suele constituir la fase superior. No
obstante, si dicha fase es densa debido a la concentración salina (> 0,5 M), formará la
fase inferior. Además, si el pH de la solución acuosa no se ha equilibrado debidamente
(pH 7,8 – 8,0), los ácidos nucleicos tenderán a repartirse en la fase orgánica. Si es
preciso, la extracción con cloroformo se realizará dos o tres veces, con objeto de eliminar
por completo las impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extracción de los
ácidos nucleicos, puede retroextraerse la fase orgánica con una solución acuosa. Una vez
purificados los complejos de ácidos nucleicos, puede procederse a la precipitación,
Una alta concentración salina es necesaria para que se forme un precipitado de ácidos
nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de NaCl por su
capacidad tampón. En estas condiciones, el detergente, que es más soluble en alcohol
que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los ácidos nucleicos precipitan.
El posterior tratamiento con etanol al 70 % permite una mayor purificación o elución de los
ácidos nucleicos de la sal residual.
CONCLUSIONES
 Se logró extracción y separación del ADN a partir de tejido vegetal (tomate), con la
separación de interfaces y seguidamente la obtención de miles fibras de ADN.
 La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la
mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de
recombinación de ADN. Los métodos de extracción permiten obtener ácidos
nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis
específicos de modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los
elementos más importantes en ese tipo de análisis.
 La extracción de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las
estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de
purificación, que implica la retirada de la solución final de la mayoría de elementos
que pueden interferir en la PCR.
CUESTIONARIO

6. 1. ¿Qué dificultades se presentaron para la realización de la práctica?
Las dificultades que se presentaron en la práctica fueron las siguientes: al
momento de la obtención final del ADN vegetal en el tomate en el cual se
incorporó champú más de lo debido, de manera que se tuvo que repetir la práctica
hasta llegar al objetivo
2. ¿Por qué se le agrega zumo de papaya o piña?
Específicamente en la práctica llevada a cabo no se incorporó zumo de papaya o
piña
3. ¿Qué finalidad tiene el exponer las células a un detergente fuerte?
La finalidad de exponer las células a un detergente fuerte es que en la ruptura de
membranas y para liberar el ADN, es necesario llevarlo a cabo químicamente con
detergentes (SDS, Tritón o detergentes comerciales).
4. ¿Qué función cumple el alcohol?
El alcohol cumple la función de permitir una mayor purificación o elución de los
ácidos nucleicos. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar
etanol frío o isopropanol i recuperar mediante una centrifugación. El alcohol del
sobrenadante se llevará las sales añadidas previamente.
5. El precipitado blanco extraído de la varilla es pura o estrictamente ADN.
El precipitado blanco extraído básicamente es pura ADN, ya que se realiza la
purificación con los métodos de extracción y precipitación al concentrar los ácidos
nucleicos precipitando con isopropanol o etanol
PROBLEMAS
1. ¿Cuáles son las posiciones en un anillo de purina de un nucleótido purínico en el
DNA que poseen el potencial para formar enlaces de hidrógeno, pero que no los
forman en los pares de bases de Watson y Crick?
El gran golpe intuitivo de Watson y Crick fue el de darse cuenta de que una hélice
de doble cadena podia estabilizarse mediante enlaces de hidrogeno entre las
bases de las cadenas opuestas si las bases se apareaban de una manera
concreta: los pares A-T y G-C que se forman enlaces de hidrogeno fuertes entre
las bases. Ademas, las distancias entre los carbonos l' de las porciones de
desoxirribosa de A-T y G-C son las mismas: aproximadamente 1.1 nm en cada
caso. Esta disposicion apareada implicaba que la doble helice podía tener un
diametro regular, hecho que era imposible si las purinas se apareaban con purinas
o las pirimidinas con pirimidinas.

7. 2. Una hebra de un DNA en doble hélice tiene la secuencia de
(5’)GCGCAATATTTCTCAAAATATTGCGC(3’). Escriba la secuencia de las bases
de la hebra complementaria. ¿Qué tipo especial de secuencia contiene este
fragmento de DNA? ¿Puede la doble cadena formar estructuras alternativas?
Una cadena polinucleotidica posee un sentido o cUreccionalidad. El enlace
fosfodiester entre las unidades monomericas se produce entre el carbono 3' de un
monomero y el carbono 5' del siguiente. Asi pues, los dos extremos de una cadena
polinucleotidica lineal son diferenciables. Un extremo lleva normalmente un fosfato
5' sin reaccionar, y el otro extremo un grupo hidroxilo 3' sin reaccionar.

8. 3. Explique por qué aumenta la absorción de la luz UV por un DNA de doble hebra
(efecto hipercrómico) al desnaturalizar el DNA.
Como consecuencia de los sistemas de dobles enlaces conjugados de los anillos
de purina y pirimidina, las bases y todos sus derivados (nucleosidos, nucleótidos y
ácidos nucleicos) absorben intensamente la luz en la región del espectro del
ultravioleta cercano. Esta absorción depende en parte del pH, debido a las
reacciones de ionización de las bases.
La luz ultravioleta puede tener también efectos dañinos químicos sobre el DNA
que dan lugar, por ejemplo, a cáncer de piel.
4. Diferencias entre las estructuras del DNA y la del RNA.
Existen dos clases de ácidos nucleicos, el DNA y el RNA. Cada uno de ellos es un
polinucleotido, un polímero de cuatro tipos de nucleosidos 5'-fosfato, conectados
mediante enlaces entre hidroxilos 3' y fosfatos 5'. El RNA tiene el azúcar ribosa,
mientras que el DNA posee desoxirribosa. La unión fosfodiester es
intrínsecamente inestable, pero solo se hidroliza lentamente en ausencia de
catalizadores. Todos los ácidos nucleicos existentes en la naturaleza tienen una
secuencia definida o estructura primaria.
5. Dibuje las siguientes estructuras y ordénalas según su solubilidad relativa en agua
(de más soluble a menos soluble): desoxirribosa, guanina, y fosfato. ¿Por qué
estas solubilidades están en consonancia con la estructura tridimensional del DNA
de doble cadena?

9. DESOXIRRIBOSA
GUANINA
FOSFATO