Penelitian ini mengkaji karakteristik dan sensitivitas antimikroba bakteri Gram negatif yang diisolasi dari infeksi darah pada pasien kanker yang menjalani kemoterapi di Pakistan. Bakteri yang paling sering diisolasi adalah Pseudomonas aeruginosa (38%) dan E. coli (25%). Bakteri-bakteri ini menunjukkan resistensi tinggi terhadap antibiotik seperti cefalosporin dan fluorokuinolona. Resistensi ini diduga disebabkan oleh produksi enzim beta-l

1. JOURNAL READINGIndian Journal of medical Microbiology, (2009) 27 (4): 341-7 CHARACTERIZATION AND ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY OF GRAM-NEGATIVE BACTERIA ISOLATED FROM BLOODSTREAM INFECTIONS OF CANCER PATIENTS ON CHEMOTHERAPY IN PAKISTAN RobiulFuadidr/ I.G.A.A. Putri Sri Rejeki, dr. SpPK 1

2. PENDAHULUAN Kankermempengaruhisistemimunpasienbaiklangsungmaupuntidaklangsung, sehinggarentanterhadapinfeksi Bloodstream infection (BSI) merupakanpenyebabutamamorbiditasdanmortalitaspasienkanker BSI olehbakteribatang Gram negatifbanyakterjadipadapasienkankerselamaterapiagresif. 2

3. Di Eropadan USA, enterobacteriaceaemerupakanpenyebab 65-80% infeksi Gram negatifpadapasienkanker Pseudomonas aeruginosaberhubungandenganmorbiditasdanmortalitaspadaimmunocompromised host Insidensiresistensiantibiotikpadabakteribatang Gram negatifmeningkat 3

5. Menentukankepekaanantimikrobaterhadapbakteri yang diisolasi4

6. BAHAN DAN METODE Seleksipasien: PenelitiandilakukandiLaboratoriumMikrobiologi Institute of Nuclear Medicines and Oncology, Lahore selamajuli 2006-januari 2007 Subjekpenelitian: Semuapasienkanker yang dirawatinapdanmenjalaniterapi anti kanker, dandicurigaimengalami BSI Kriteriaeksklusi: Pasien yang telahmendapatterapiantibiotik, dandemambukankarenainfeksi 5

7. Media Kultur Nutrient broth Nutrient agar Blood agar Muller Hinton broth MacConkey agar Brain Heart infusion broth 6

8. Identifikasi Isolasidilakukandenganmenambahkan 5 ml darah vena pasienpadanutrient broth. Inkubasi 37oC hingga 1 minggu Untukmendapatkanwell-isolated colonies, inokulumdispreadpadapermukaanenriched agar plate dandiinkubasipada 37oC selama 24 jam 7

9. Pemberiannamatiap strain berdasarkanmorfologikoloni, pengecatan Gram, dantesbiokimia Tesbiokimia: tesoksidase, citrate utilization test, tesindol, tesurease,danKligler iron agar test Didapatkan total 60 isolat Gram negatif 8

11. Cephalosporin (ceftriaxone, cefepime, dancefoperazone)

12. Aminoglycoside (tobramycin)Larutanantimikrobadengankonsentrasi yang berbeda-bedadisiapkanuntukMinimum Inhibitory Concentration (MIC) test 9

13. TesKepekaanAntimikrobadanMinimun Inhibitory Concentration (MIC) InokulumdisiapkandenganmenginokulasikankolonibakteridankontroldalamMuller Hinton Broth Optical densitasnyadiukurdenganspektrofotometerpadapanjanggelombang 546 nm Densitasinokulumdiadjustpada 105 Colony forming Unit (CFU)/ml dandigunakanuntukmenentukan MIC 10

14. MIC ditentukanpadaMuller Hinton Broth yang mengandungantimikroba yang diencerkandua kali lipatsecara serial, suspensibakteri yang diinokulasi 105 CFU/ml MIC adalahkonsentrasiantibiotikterendahtanpaterlihatpertumbuhanisolat MIC50 dan MIC90didefinisikandengankonsentrasiantibiotik minimal yang menghambat 50% atau 90% isolat 11

15. 12

16. Table 1. The susceptible and resistant breakpoints of all antibiotics according to National Committee for Clinical and Laboratory standards Institute (NCCLS,2000) in Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa 13

17. Deteksi Extended Spectrum beta-Lactamase (ESBL) Disk yang mengandungcefotaximedanceftazidine 30µgdiletakkan di media yang telahinokulasibakteri, dengansalahsatusisinyadiletakkan disk yang mengandung amoxicillin danclavulanate (20 plus 10 µg) denganjarak 25-30 mm Media yang telahdinokulasidiinkubasi 18-24 jam padasuhu 37oC Produksi ESBL ditentukanolehadanyazonainhibisipada cephalosporin yang diperluasolehclavulanate 14

18. Analisis data Data dianalisadandievaluasiberdasarkannilai rata-rata danpersentase Hasildipresentasikandalambentuktabeldangambar 15

20. E.coli 25%

21. Klebsiella 20%

22. Proteus 10%

23. Shigella 7%16

24. 17

25. Table 2: Minimal Inhibitory Concentration (MIC), percentage and susceptibility of different antimicrobial agents againtsPseudomonas aeruginosaisolated from BSI of cancer patients Note: MIC50 and MIC90 (Minimum Inhibitory Concentration) at which 50% and 90% of the isolates, respectively, were inhibited. The unit for all MICs microgram per mililiter (NCCLS 2000). %R shows the resistance according to NCCLS 2000. % S shows the susceptibility according to NCCLS 2000 18

26. 19

27. Table 2: Minimal Inhibitory Concentration (MIC), percentage and susceptibility of different antimicrobial agents againtsEnterobacteriaceaeisolated from BSI of cancer patients Note: MIC50 and MIC90 (Minimum Inhibitory Concentration) at which 50% and 90% of the isolates, respectively, were inhibited. The unit for all MICs microgram per mililiter (NCCLS 2000). %R shows the resistance according to NCCLS 2000. % S shows the susceptibility according to NCCLS 2000 20

28. 21

29. Figure 1: Multi drug resistance in Gram-negative bacterial strains againts different antimicrobial agents. CSP: cephalosporin, FQL: fluoroquinolones % age of resistant isolates Antibiotics used 22

30. Figure 2: Gram-negative bacterial strains showing cross resistance against cefoperazone, ceftriaxone, and cefepime CFZ : cefoperazone, CFP: Cefepime, CTX: ceftriaxone % age of resistant isolates Antibiotics used 23

31. Figure 3: Pseudomonas aeruginosa and Enterobacteriaceae strain showing cross resistance against imipenem and meropenem IMP: imipenem MEM: meropenem % age of resistant isolates Antibiotics used 24

32. Figure 4; Antibitic Resistance and sensitifity of E. coli and K. pneumoniae against cefoperazone, ceftriaxone and cefepime CFZ: cefoperazone, CFP: cefepime, CTX: ceftriaxone % age of resistant isolates Antibiotics used 25

33. ResistensiAntimikrobaolehPenghasilbeta Laktamase Sebanyak 20 % Klebsiella, dan 25% E. coli ditemukansebagaipenghasilbeta Laktamasepadapenelitianini 26

34. DISKUSI Pseudomonas aeruginosamerupakan strain bakteri paling seringmenyebabkan BSI padapasienkanker Laporan SENTRY for laboratories di USA, Kanada, Amerika Latin, danEropamenunjukkanE.coli, Kliebsiella, danP.aeruginosamerupakanbakteripenyebab BSI yang paling seringresisten 27

35. ResistensiP.aeruginosaterhadap ciprofloxacin sebesar 80%, sedangkanenterobacteriaceae 88% Resistensitinggibakteribatang gram negatifterhadap cephalosporin generasi III dan ciprofloxacin diAmerika, Kanada, danAmerika Latin Resistensipatogen gram negatifrendahdiInggrisdanIrlandia(2001-2002),dimanaresistensiP.aeruginosaterhadap ciprofloxacin danceftazidimeantara 4-7% 28

36. 74% strain P.aeruginosaresistenterhadapfluoroquinolonedancephalosporin,sedangkanenterobacteriaceae79% Menurutlaporan SENTRY (1997-2002) diAmerika, padaBSIterdapatmultidrug resistance untukP.aeruginosadenganprevalensi yang tinggi 29

38. E.coli87%

39. Proteus 58%

40. Shigella 55%30

41. Kesimpulandan Saran Dibutuhkanpengawasandalampenggunaanantimikrobadirumahsakit, karenapolapemberianantibiotikberperandalamterjadinyaresistensi Monitoring yang regulerpadatingkat regional maupunnasional, sehinggaklinisimendapatkaninformasi regimen terapipilihan yang empiris Menjalankankebijakanpenggunaanantibiotiksecarabijaksanadansesuaiguideline SkriningESBL sebagaiprosedurrutindilaboratoriumklinismemberikaninformasi yang berhargapadaklinisidalampemilihanantibiotik 31

42. TERIMA KASIH 32

43. TesOksidase Digunakanuntukmembantuidentifikasispesies yang memproduksienzimoksidase Prinsip Sepotongkertassaringdibasahidenganbeberapatetesreagenoksidase. Jikaorganismememproduksioksidase, phenylenediaminepadareagenakanteroksidasimenjadiwarna deep purple. Reagen yang dibutuhkan: ReagenOksidase yang berisilarutan 10 g/l tetramethyl-p- phenylenediaminedihydrochloride Ctt: reageninimudahteroksidasi. Jikareagentelahberwarnabiru, jangangunakan. 33

45. Denganbatangkaca, pindahkankoloniorganismetesdanoleskanpadakertassaring

46. Lihatperubahanwarnamenjadi blue-purple dalambeberapadetikHasil Warna blue purple (dalam 10 detik) positifmemproduksienzimoksidase Warnabukan blue purple (dlam 10 detik) negatif Ctt:abaikanwarna blue purple yang terjadisetelah 10 detik Kontrolpositif: Pseudomonas aeruginosa Kontrolnegatif: Eschericia Coli 34

47. 35

48. Citrate utilization test Untukmembantuidentifikasienterobactericiaea. Tesiniberdasarkankemampuanorganismemenggunakansitratsebagaisumberkarbondan ammonia sebagaisumber nitrogen Prinsip: Organismedikulturpada media yang mengandung sodium citrate, garam ammonium, danindikatorbromothymol blue. Pertumbuhanpada media ditandaiolehkekeruhandanperubahanwarnaindikatordarihijauterangmenjadibiru, olehkarenareaksialkali,mengikutipemakaiancitrat 36

49. Bahan yang dibutuhkan: Media Koser’s citrate (Simon citrate dapatdigunakantapilebihmahal) Dengansterile straight wire, inokulasiorganismedi media kultur broth ke 3-4 ml media Koser’s Citrate (harushati-hati agar tidakmengkontaminasi media denganpartikelkarbon, sepertikawat yang terbakar Inkubasipada 35-37oC, hingga 4 hari, periksatiaphariadanyapertumbuhan 37

51. Takadapertumbuhan, tesnegatif, citrate tidakterpakai

52. Kontrolpositif : Klebsiellapneumoniae

53. Kontrolnegatif : Eschericia coli38

54. CITRATE UTILIZATION TEST Inkubasi Positifnegatif 39

55. 40

56. Urease Test Tesureasepentinguntukmembedakanenterobacteriaceaeberdasarkankemampuanmemproduksiurease. Prinsip Organismetesdikulturpada media yang mengandung urea danindikator phenol warnamerah. Jika strain memproduksiurease, enziminiakanmemecah urea menghasilkan ammonia dankarbondioksida. Denganmenghasilkan ammonia, media menjadi alkali yang ditunjukkanperubahanwarnamenjadimerahmuda 41

57. Tesurease Bahan yang dibutuhkan Media Motility Indole urea (MIU) Metode menggunakankawatsterillurus, inokulasi media pada media MIU Tempatkanindole paper strip dilehertabung MIU diatas media. Tutuptabungdaninkubasipada 35-37oC semalam Periksaproduksiureasedenganmelihatwarnamerahmudapada media 42

58. Hasil Media merahmuda, positifmenghasilkanurease Media tidakmerahmudanegatifmenghasilkanurease Kontrol kontrolpositifurease : Proteus vulgaris kontrolnegatifurease : Eschericia Coli Motilitas ditunjukkandenganadanyapenyebarankekeruhandarigaristusukan 43

59. 44

60. TesIndol Tesproduksiindolpentinguntukidentifikasienterobacteriaceae. Kebanyakan strain dariE.Colimemecahasam amino tryptophan denganmenghasilkanindole. Organismetesdikulturpada media yang mengandung tryptophan. ProduksiindoldideteksiolehreagenKovac’satau Ehrlich yang berisi 4 (p)-dimethylaminobenzaldehyde. Bahaninibereaksidenganindolsehinggamemproduksiwarnamerah 45

61. Bahan media MIU Kovac’s reagent strips Hasil strip kemerahan, positifmenghasilkanindol bukanwarnamerah, negatifmenghasilkanindol Jikabelumjelas, tambahkan 1 ml reagent Kovacdanlihatadanyawarnamerahdalam 10 menit 46

62. 47

64. Retakandangelembungmengindikasikanadanyaproduksi gas darifermentasiglukosa. Gas diprodoksiolehSalmonella paratyphi48

65. Slopewarnakuningdanbuttkuningmengindikasikanfermentasilaktosadanmungkinglukosa. TerjadipadaEscherichia coli Slopedanbuttwarnamerahmuda, mengindikasikantakadafermentasiglukosamaupunlaktosa. Terlihatpadakebanyakan strain P.aeruginosa Kehitamanpada area stabline, mengindikasikanproduksi H2S. MisalpadaSalmonella typhi(tipis), atauSalmonella typhimurium(luas) 49

66. Formula danpersiapan media KIA Oxoid dehydrated medium formula: Lab-Lemco powder 3,0 g/liter Yeast extract 3,0 g/liter Peptone 20,0 g/liter NaCl 5,0 g/liter Laktosa 10,0 g/liter Glukosa 1,0 g/liter Ferric citrate 0,3 g/liter Sodium thiosulpate 0,3 g/liter Phenol red 0,05 g/liter Agar 12,0 g/liter 50

67. Media digunakanpadakonsentrasi 5,5 gram setiap 100 ml aquades Panaskanpadasuhu 50-55o C, campurbaik-baik, danbagidalam 6 ml sejumlahtabung (sekitar 16x160 mm) Sterilisasidengan autoclave Siapkan media dalamposisi slope, dengankedlaman butt 25 mm, dan slope 25 mm Simpanpadatempat yang dingindangelappada 2-8oC 51

68. KIA (1) sengkelit Setelah inkubasi Alkali Asam H2S  52

69. KIA (2) Setelah inkubasi Alkali Asam Gas 53

70. 54

71. Pseudomonas aeruginosa Cultural features blood agar: large, flat, haemolitic colonies. Strict aerob. Most strain produce pyocyanin (yellow green in medium) McConkey:non lactose fermenting colonies with yellow green in medium KIA: Pink-red slope and butt, gas (-), H2S (-) identifikasi: gram negatif, oksidasepositif, citrate positif MIU: Motility positif, indolnegatif, tesureasetergantung strain 55

72. Eschericia coli Cultures feature McConkey agar: large 2-4 mm lactose fermenting colonies Blood agar: 1-4 mm colonies, may appear mucoid and some strains are haemolytic Gram negatif, oksidasenegatif, citrate negatif MIU: motilitaspositif, kebanyakanindolpositif, ureasenegatif. KIA: slope kuning, butt kuning 56

73. Klebsiella Cultural feature: MacConkey agar most strain form large lactose fermenting mucoid colonies blood agar: large mucoid colonies Gram negatif, oksidasenegatif, citrate positif MIU: non motile, sebagianbesarindolnegatif, ureasepositif (slow) KIA: slope kuning, butt kuning, H2S negatif, gas positif 57

74. Proteus Cultural features: Blood agar: most strains produce swarming growth McConkey agar: non-lactose fermenting colonies formed Colonies have a distinctive smell Gram negatif, oksidasenegatif, tes citrate tergantung strain MIU: motilitaspositif, indoltergantung strain, urea positif KIA: slope merah, butt kuning, H2S positif, gas tergantung strain 58

75. Shigella Cultural features MacConkey: colourless colonies Gram negatif, oksidasenegatif, citratnegatif MIU: non motile, ureasenegatif, indoletergantung strain KIA: pink-red slope, yellow butt, no blackening and most strains produce no crack in medium 59

76. Densitas 105 Siapkanstandar 0,5 McFarland dengan Barium chloride 1% 0,05 ml dandan 1% sulfuric acid 1,0% 9,95ml Siapkansuspensibakterisetaradengan 0,5 McFarland Encerkan 1:7500 untukmendapatkansuspensi 2x105 Tambahkan 1 ml larutandiatasdengan 1 ml larutanantibiotik, sehinggadidapatkansuspensi 105 60

77. MIC antibiotika =2 mg/L Bakteridlm media + antibiotika kontrol 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12mg/L Inkubasi semalam MIC antibiotika -1 mg/L 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12mg/L Inkubasi semalam MIC antibiotika =2 mg/L 61

78. Antibiotik Cephalosporin dancarbapenem : beta laktam, menghambatsintesisdindingsel Aminoglycoside :menghambatsintesis protein Fluoroquinolone: menghambatsintesisasamnukleat 62

79. Bagaimanabakteribisaresisten? Denganmutasigenetik, sehinggamengubah protein dankomponen lain bakteri yang digunakanantibiotikmelekat contoh: aminoglycosides, lincomycin, erytromicin Bakterimemproduksienzim yang merusakataumenginaktivasibakteri contoh: beta laktamase; enzim acetylating, adenylating, danphosphorylatinginaktivasiaminoglikosid. Bakterimengubahsistemmetabolisme, sehinggatidakdapatdipengaruhiolehantibiotik Contoh: resistensiterhadapsulfonamid Bakterimengubahpermeabilitasdarimembran, sehinggamenyulitkanmasuknyaantibiotik Contoh: resistensiterhadappolymixindan tetracycline 63

80. ESBL 64