1. TUTOR KIMIA KLINIK PEMERIKSAAN ASAM URAT SERUM Oleh : dr.Esti Rohani Pembimbing : Dra. Soehartini,B, MS, Apt 1

2. PENDAHULUAN Mitos ngilu sendi berarti asam urat Perlu kepastian hasil pemeriksaan laboratorium Hasil pemeriksaan harus memiliki standar mutu Hasil pemeriksaan dapat mencerminkan kondisi pasien yang sebenarnya dan dapat dipertanggungjawabkan. 2

3. ASAM URAT Produk akhir metabolisme purin Pembentukan terutama terjadi di liver Rute utama eliminasi melalui ginjal Di ekskresi melalui urine rata-rata 400 – 500 mg/hari, melalui feses rata-rata 200 – 500 mg/hari. Dalam plasma berbentuk monosodium urat yang relatif tidak larut air 3

4. Lanjutan Bila kadar urat plasma > 6,4 mg/dL  plasma akan jenuh  terjadi pengendapan di jaringan dalam bentuk kristal urat. Mamalia selain primata derajat tinggi  enzim urikase memecah asam urat menjadi alantoin yang sangat larut dalam air. 4

5. METODE PEMERIKSAAN ASAM URAT Ada 4 metode yang bisadigunakan : Metodekolorimetri Metodeenzimatik HPLC Isotope dilution 5

7. Asamurat + H₃PW₁₂O₄₀ + O₂ Alantoin + Tungsten blue + CO₂

8. Kurangspesifikkarena : 1. memerlukankopresipitasiasamuratdengan protein plasma 2. Terjadikekeruhanselamapembentukanwarna 3. adanyazat-zat yang mengganggu Na₂CO₃/OH¯ 6

9. Lanjutan Perlu filtrat bebas protein  deproteinisasi Kekeruhan menyebabkan hasil negatif palsu Perlu medium/suasana alkali  ditambahkan natrium cyanide 7

10. METODE URIKASE/ENZIMATIK Prinsip : asam urat dioksidasi dengan bantuan enzim urikase menjadi alantoin dan hydrogen peroxida Metode yang paling spesifik untuk mengukur perbedaan absorbsi antara asam urat dan alantoin karena asam urat mengabsorbsi cahaya pada panjang gelombang 293 nm, alantoin tidak. 8

11. Lanjutan Ada 2 cara metode urikase, tergantung enzim yang digunakan : 1. enzim katalase 2. enzim peroxidase 9

12. METODE URIKASE DENGAN ENZIM KATALASE Urikase Asam urat + O₂ + 2H₂O Alantoin + CO₂ + H₂O₂ H₂O₂ + CH₃OH H₂CO + 2H₂O CH₂O + 3C₅H₈O₂ + NH₃ 3H₂O + senyawa berwarna Absorban diukur pada λ 340 nm. Warna yang dihasilkan sesuai dengan kadar asam urat spesimen Katalase 10

13. METODE URIKASE DENGAN ENZIM PEROXIDASE Digunakan di PK RSU Dr.Soetomo Asam urat + O₂ + 2H₂O Alantoin + CO₂ + H₂O₂ H₂O₂ + H⁺ + TOOS + 4-aminophenazone 4H₂O + quinone-diimine dye Absorban diukur pada λ 505 nm dan 660 nm (Hitachi 902) TOOS : N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfoprophyl)-3-methylaniline Urikase Peroxidase 11

15. PROSEDUR Masing-masingtabungdicampurdandiinkubasiselama 10 menitpadasuhu 37⁰C 13

17. Batas pengenceran Bila konsentrasi asam urat lebih besar dari 25 mg/dL Menggunakan air suling atau NaCL 0,9% Hasil dikalikan dengan faktor pengenceran 15

18. Bahan-bahan yang mempengaruhi hasil pemeriksaan Bilirubin (> 40 mg/dL) Hemolisis (bila kadar Hb>1000mg/dL Lipemia (lipid>1000 mg/dL) Asam askorbat (> 30 mg/dL) Obat-obatan (invitro menyebabkan hasil lebih rendah) 16

19. KALKULASI Absorban sampel = konsentrasi sampel Absorban standar konsentrasi standar Konsentrasi asam urat = Absorban sampel X konsetrasi standar Absorban standar Konsentrasi standar = faktor Absorban standar 17

20. HPLC prinsip : pemisahan yang didasarkan pada distribusi zat-zat terlarut diantara fase bergerak dan fase diam cair, memerlukan tekanan, pengontrolan suhu, penyambungan dengan detektor dan gradient elution Sensitif dan spesifik Sebelum pemeriksaan, protein perlu dipisahkan dari sampel (deproteinisasi) 18

21. Deproteinisasidapatdilakukandengancara: Penambahanbahan : methanol, ethanol, aseton, ethyl ether Salting out : sodium sulfat, ammonium sulfat, garam magnesium, fosfat, sitrat Pembentukangaramtakterlarut * Presipitasianionik : asamtungstat, TCA, perkhlorat * Presipitasikationik : Zn, Pb, Hg, Fe, Ba Ultra filtrasi Kloroform 19

22. ISOTOPE DILUTION/MS Teknik pilihan untuk dipakai sebagai metode definif Tidak tergantung recovery sampel Presisi tinggi Dapat menguji bias serta senyawa pengganggu yang tidak diketahui 20

23. Ringkasan metode pemeriksaan Na₂CO₃/OH⁻ Metode kolorimetri/ asam urat + H3PW12O40 + O2 alantoin + biru tungsten + CO₂ tidak spesifik, perlu pemisahan protein Fosfotungstat Metode enzimatik sangat spesifik langkah pertama asam urat + O₂ + 2H₂O alantoin + CO₂ + H₂O₂ penurunan absorban diukur pada panjang gelombang 293 nm calon metode rujukan; dipengaruhi xanthin dan hemoglobin gabungan enzim (I) H₂O₂ + CH₃OH H₂CO + 2H₂O umumnya untuk metode automatik; CH₂O + 3C₅H₈O₂ + NH₃ 3H₂O + senyawa berwarna dipengaruhi oleh zat pereduksi enzim gabungan (II) H₂O₂ + H⁺ + TOOS + 4-aminophenazone quinone-diimine dye + 4H₂O untuk metode automatik; dipengaruhi zat-zat pereduksi HPLC ion exchange, gel permeation, reverse-phase columns spesifik, biasanya memerlukan ekstraksi sampel Isotope Dilution / MS sampel diencerkan dengan isotop yang sudah diketahui jumlahnya; rasio isotop tidak diusulkan sebagai metode definitif berlabel dengan yang berlabel diukur dngan mass spectrometri urikase katalase peroxidase 21

24. TERIMAKASIH 22

25. Skema pembentukan asam urat Adenosin guanosin Inosin guanin Hypoxanthin xanthin oxidase xanthin xanthin oxidase asam urat 23

26. Perubahan asam urat menjadi alantoin 24

27. Komponen-komponen pengganggu Komponen endogen : glukosa, asam askorbat, glutation dan sistein, produk akhir pemecahan sel darah merah Komponen eksogen : acetaminophen, asam acetilsalisilat, purin ( caffein, theobromin, theophylin) 25

28. Dasar kerja ID/MS Penambahan jenis analit berlabel yang sudah diketahui jumlahnya ke dalam sampel Keseimbangan antara analit berlabel dengan analit endogen Pemrosesan sampel, pengukuran rasio antara analit tidak berlabel dengan analit berlabel menggunakan gas chromatography-mass spectrometry 26