Como preparar medios de cultivos, y los mo's que en ellos crecen.

1. PRUEBAS______________________BACTERIOLÓGICAS_____________________BASICAS
Escribir el procedimiento y el planteamiento de la preparación de los medios de
cultivo y las bioquímicas.
*MEDIO EMB*
26 cajas
X 20 ml
520 ml / 2 = 260 ml
Se utilizan 2 matraces
De 300 ml.
*BIOQUÍMICAS MIO*
18 tubos
X 5ml
90 ml
EQUIPO 2
*MEDIO SS*
26 cajas
X 20 ml
520 ml / 2 = 260 ml
Se utilizan 2 matraces
De 300 ml.
36 gr----------------------- 1000 ml
X= -------------------------- 260 ml
X = 9.36 gr/ 260 ml.
31gr ------------------------1000 ml
X = -------------------------- 90 ml
X = 2.79 gr
X = 2.8 gr/ 90 ml
69 gr----------------------- 1000 ml
X= -------------------------- 260 ml
X = 17.94 gr/ 260 ml
faringeocutivo
EMB * SS
SM *
S110
ASA urocultivo
EMB * SS
SM *
S110
ASA
coprocultivo
EMB *SS
SM * MC
AS

2. *BIOQUÍMICAS MIN*
18 tubos
X 5ml
90 ml
EQUIPO 3
*MEDIO SM*
26 cajas
X 20 ml
520 ml / 2 = 260 ml
Se utilizan 2 matraces
De 300 ml.
*BIOQUÍMICAS LIA*
18 tubos
X 5ml
90 ml
25 gr ------------------------1000 ml
X = -------------------------- 90 ml
X = 2.25 gr/90 ml
111 gr----------------------- 1000 ml
X= -------------------------- 260 ml
X = 28.86 gr/ 260 ml.
33 gr ------------------------1000 ml
X = -------------------------- 90 ml
X = 2.97 gr/90 ml

3. METODOLOGÍA.-
1) Hacer vale y recoger el material solicitado, revisar esté en condiciones, de lo contrario
hacerle la indicación a la facilitadora encargada del material. Ya que lo debe entregar en
buenas condiciones todo el material que haya solicitado.
2) Sobre la mesa de trabajo solo deben estar: los materiales a utilizar; sus mochilas o bolsa
guardad en las cajoneras, los materiales organizados, es decir, ordenados. SIEMPRE QUE
HAYA ORDEN.
3) Siempre que pese (balanza limpia, nivelada y sobre una superficie plana), colocar el matraz
Erlenmeyer etiquetado NOMBRE DEL MEDIO en el centro del platillo (no tocarlos, hasta
haber terminado de pesar). Mover las pesas, una por una hasta tener el peso exacto,
escribirlo y …
4) Sumarle el peso del medio de cultivo, ahora indicar este nuevo peso en la balanza, y …
5) Destapar el bote que contiene el medio de cultivo, introducir la espátula tomando una
porción de medio, de inmediato taparlo nuevamente, e ir vaciando poco a poco, dando unos
golpecitos con el dedo índice a la espátula, con cuidado para que no se derrame fuera del
matraz Erlenmeyer el medio de cultivo (no derramar fuera del matraz, se contamina el
platillo y es causa de error). Siempre tratando que, no sobre en la espátula, ya que NO se
DEBE vaciar el sobrante al bote, PORQUE contamina.
6) Medir el agua destilada, exactamente la cantidad calculada, ir vaciando que escurra por las
paredes del matraz Erlenmeyer (para ir limpiando las paredes interna y se concentre en el
interior) poco a poco y moviendo el matraz en circulo (primero hacia un lado y luego hacia el
otro), suavemente tratando de disolver el medio.
7) Se continua vaciando el agua destilada que haya quedado en la probeta, (se sigue
mezclando, tratando que no se presente espuma) mientras se prepara el tapón (algodón-
pañalina) se coloca en la boca del matraz Erlenmeyer que contiene el medio, y …
8) El medio de cultivo se ve un poco turbio; ahora, se va pasando por la flama del mechero
Fisher y se sigue mezclando suavemente, se continua el procedimiento (no se debe
derramar), hasta que se vea transparente el medio de cultivo, es decir, se le quita la
turbidez. Significa que ya esta listo para el siguiente paso.

4. 9) Si se esteriliza el medio de cultivo, se lleva a esterilizar de inmediato colocarle una cubierta
de papel de estraza según se indica.
a) La olla express debe tener agua hasta la plataforma, sobre esta se coloca el material a
esterilizar. (se puede colocar la olla en la estufa previamente).
b) Cuando este colocado el material a esterilizar, se coloca la tapa (ver que coincida la
marca de la olla con la marca de la tapa) girar la tapa libremente, a que cierre bien.
c) La tapa se le quita la válvula. Para que salga el vapor y de inmediato se coloca la válvula
para que vaya subiendo la presión de la olla express, permanecer cuidando que suba la
presión hasta llegar a 121°C, bajar la flama. Tratando de estabilizar la presión por 15
minutos (contando el tiempo, a partir de 121°C por 15 minutos), apagar la estufa o
quitar la olla de la flama, con CUIDADO.
d) La presión va bajando, poco a poco. Cuando este en cero, con cuidado girar la tapa, ir
abriendo (procurando que el vapor salga por el lado opuesto al que estamos), levantar
totalmente la tapa y quitarla.
10) Sacar los medios de cultivo con mucho cuidado, están calientes. Colocarlos sobre una
superficie estéril (previamente haber limpiado la mesa con fenol al 5%) y todo e material
que se esterilizó sacarlo. Si hay más material por esterilizar (ver que tenga suficiente agua),
nuevamente se sigue el mismo procedimiento, siempre con MUCHO CUIDADO.
Prueba de la Oxidasa
El objetivo de la prueba “Oxidasa” es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa.
Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se detecta
utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a
ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a
púrpura.
Procedimiento:
Con un pequeño papel de filtro añadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo
con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos
30 segundos, observamos si ha ocurrido algún cambio.

5. Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo.
Se considera positva esta prueba cuando toma un color púrpura la muestra.
Resultados:
(+) Pseudomonas aeruginosa
( - ) Escherichia coli
Prueba de la Catalasa
El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa
El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un
compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima catalasa
(H2O2 -> H2O + ½ O2).
Prodecimiento:
Agregamos aproximadamente 5 ml. de peróxido de hidrógeno al 3% a un tubo de ensayo
previamente esterilizado a continuacion tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a
estudiar y la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercrse a la muestra
de la solucion liíquida de peróxido de hidrogeno y debemos observar la reacción de esta.
La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno.
Resultados:
(+) Staphylococcus aureus
( - ) Streptococcus spp.
Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en
factor de aglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba
se utiliza para diferenciar microorganismos del genero Staphylococcus.
Procedimiento:
Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y 0,3 ml. de plasma de conejo
en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus.
Tapamos el tubo de ensayo con algodón hidrofílico y lo llevamos a baño María a 37° C durante una

6. hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y
observamos sus resultados.
Resultados:
Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles:
1: pequeños coágulos no oganizados
2: pequeños coágulos oganizados
3: gran coágulo organizado
4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo.
Se consideran positivos los niveles 3 y 4.
(+) Staphylococcus aureus
( - ) Staphylococcus epidermis.
Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine ó Motilidad-Indol-Ornitina)
Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de
Indol a la descarboxilación de la ornitina.
Procedimiento:
Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a
37° .
Interpretación y Resultados:
Reacción Interpretación
Enturbiamiento del
Agar.
Hay movilidad
Agar transparente de-
sarrollo solo en picada
No hay movilidad
Azul (alcalino) Descarboxila ornitina
Coloración Amarilla (ácido) No descarboxila
Rojo (anillos) Indol (+)
Amarillo (anillos) Indol ( - )

7. Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)
El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de
ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la
identificación de la producción de SH2.
Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia
Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:
bacterias fermentadoras de la glucosa
bacterias fermentadoras de la lactosa
bacterias fermentadoras de sacarosa
bacterias aerogénicas
bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.
Prodedimiento:
Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm.
del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y
otro lado. Incubar a 35° durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.
Resultados:
Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares. Característica de bactrias
no fermentadoras como Pseudomonas sp.
Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella
spp.
Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas,
producción de ácido sulfhídrico. Salmonela spp.
Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse
SH2 o no. Escherichia coli.
A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.
Prueba LIA (Lysine Iron Agar ó Agar Lisina Hierro)
Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o
desaminación de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es más sensible que el
TSI para la detección de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros.

8. Procedimiento:
Inocular en forma de estría las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24
horas a 37° .
Interpretación y Resultados:
Reacción Interpretación
Azul (alcalino) Hay movilidad
Rojo No hay movilidad
Engrecimiento Descarboxila ornitina
Ruptura del Agar No descarboxila
Fondo Amarillo y
Tendido púrpura
Descarboxilación de lisina
Pruebas Bioquímicas IMViC:
Agar Citrato
La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de
enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de
cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del
medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a
pH 7,6.
Procedimiento:
Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un
medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos
por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo
es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del
indicador al azul.
Resultados:
(+)Klebsiella spp.
( - ) Escherichia Coli
Indol
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las
bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con
producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica

9. importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está
basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-
dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio
de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.
Procedimiento:
Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al
finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El
desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de
añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.
Resultados:
(+) Escherichia coli
( - ) Klebsiella pneumoniae
Rojo Metilo
Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de
enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se
originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido-
mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman
fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del
butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales
productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se
utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.
Procedimiento:
Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en
estudio. Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar
unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo
estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y
el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio
entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.
Resultados:
(+) Escherichia coli
( - ) Enterobacter aerogenes
Vogues Proskauer

10. En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descripta en
la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la
producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a
diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.
Procedimiento:
Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio.
Incubar a 35°C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 ml del
caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar
el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante
10 a 15 minutos. El desarrollo de un color rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de
diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto una prueba VP positiva.
Resultados:
(+) Enterobacter aerogenes
(-)Escherichia coli
FARINGEOCULTIVO

11. UROCULTIVO
COPROCULTIVO