2014 - Estudio de las relaciones del morfotipo Nosotocoida limicola con los parámetros operacionales y fisico-químicos en EDAR de la Comunidad Valenciana

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(PROYECTO FINAL DE MÁSTER INTERUNIVERSITARIO EN INGENIERÍA AMBIENTAL)
Autora:
SARA CALVO GARCÍA
Directores:
Dr. JOSÉ LUIS ALONSO MOLINA
Dr. LUIS BORRÁS FALOMIR
Valencia, JULIO de 2014.

MÁSTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL.
Estudio de las relaciones del morfotipo “Nostocoida limicola” con los parámetros operacionales
y físico-químicos en EDAR de la Comunidad Valenciana.
Sara Calvo García
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AGRADECIMIENTOS
En primer lugar a José Luis Alonso y Luis Borrás, por el hecho de aceptar dirigir este proyecto,
por su dedicación y confianza a lo largo de todo el proceso, y ofrecerme esta oportunidad de aprender
junto a ellos y trabajar en este campo de investigación.
A Andrés Zornoza, por sus consejos y motivación y por otorgarme también parte de su tiempo.
A todo el Área de Química y Microbiología del Agua del Instituto de Ingeniería del Agua y
Medioambiente, por acogerme con una sonrisa cada día.
A Susana Romo, por su espíritu optimista y su franqueza, y por ser una gran consejera y amiga a
lo largo de mi formación universitaria.
A todos y cada uno de mis amigos, especialmente a José Flor, por su ánimo y apoyo inagotables
en muchos años.
A Carlos Román, por su eterna paciencia y por estar justo en el momento adecuado y permanecer
siempre ahí.
Por último a Mara y Eduardo, por su incondicional apoyo y su abnegado cariño y enorme
sabiduría.

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ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN. 17
1.1. El proceso de fangos activos en la depuración de las aguas residuales. 17
1.2. El flóculo como unidad fundamental del fango activo. 18
1.3. Problemas de separación de sólidos en los fangos activos. 19
1.3.1. Formación de foaming y bulking. 20
1.3.2. Mecanismos de formación de foaming y bulking. 23
1.4. Bacterias filamentosas responsables de la formación de bulking y foaming. 23
1.4.1. Morfotipo “Nostocoida limicola”. 25
1.4.1.1. Nostocoida limicola I. 28
1.4.1.2. Nostocoida limicola II. 30
1.4.1.3. Nostocoida limicola III. 32
1.5. Identificación de microorganismos filamentosos. 34
1.5.1. Microscopía como método convencional de identificación. 34
1.5.2. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA marcadas con fluoróforo (FISH), como
método molecular de identificación. 35
2. OBJETIVOS. 41
3. MATERIAL Y MÉTODOS. 42
3.1. Toma de muestras. 42
3.1.1. EDAR Cuenca del Carraixet. 43
3.1.2. EDAR Quart Benàger. 44
3.1.3. EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 44
3.2. Fijación y permeabilización de las muestras. 45
3.3. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA (FISH). 49

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3.3.1. Tratamiento de portaobjetos FISH cubiertos con teflón. 49
3.3.2. Aplicación de las muestras a los portaobjetos FISH. 49
3.3.3. Sondas utilizadas en el estudio del morfotipo “Nostocoida limicola”. 50
3.3.4. Hibridación in situ. 50
3.4. Observación al microscopio de epifluorescencia. 52
3.5. Cuantificación de microorganismos filamentosos. 53
3.6. Parámetros físico-químicos y parámetros operacionales. 54
3.7. Análisis estadístico aplicado en el estudio. 56
3.7.1. Análisis bivariante. Coeficiente de correlación de Spearman. 56
3.7.1.1. Coeficiente de correlación de Spearman. 57
3.7.1.2. Tratamiento de los datos con el coeficiente de Spearman. 57
3.7.2. Análisis multivariante. Análisis de Redundancia (RDA). 58
3.7.2.1. Análisis canónico de Redundancia (RDA). 58
3.7.2.2. Postratamiento de los datos con la técnica multivariante RDA. 60
4. RESULTADOS. 62
4.1. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA (FISH). 62
4.1.1. Sonda Noli-644. 62
4.1.2. Sonda MC2-649. 62
4.1.3. Sonda AHW 183. 63
4.1.4. Sonda NLIMI 91. 63
4.1.5. Sonda NLIMII 192. 64
4.1.6. Sonda NLIMIII mix. 64
4.2. Cuantificación de las poblaciones del morfotipo “Nostocoida limicola”. 65

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4.2.1. EDAR Cuenca del Carraixet (Línea A+B). 65
4.2.2. EDAR Cuenca del Carraixet (Línea C+D). 66
4.2.3. EDAR Quart Benàger. 67
4.2.4. EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 68
4.3. Parámetros físico-químicos y parámetros operacionales. 69
4.4. Análisis estadístico. 69
4.4.1. Análisis bivariante. Aplicación del Coeficiente de Correlación de Spearman.69
4.4.2. Análisis multivariante. Aplicación del Análisis canónico de Redundancia. 78
5. DISCUSIÓN. 90
6. CONCLUSIONES. 96
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 97
8. ANEXOS. 100

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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Nocardia amarae con tinción de Gram vista al microscopio óptico. 20
Figura 2. A) Decantador secundario con problemas de espumas biológicas causadas por la bacteria
filamentosa Microthrix parvicella. B) Salida de efluente clarificado del decantador anterior con sólidos que se
escapan en forma de macroflóculos. 21
Figura 3. Bulking filamentoso producido por la bacteria filamentosa Tipo 021N al microscopio óptico en
contraste de fases a 100x. Este fango es producto de un vertido de agua residual procedente de la industria
vinícola (Hydrolab Microbiologica). 22
Figura 4. Filogenia del morfotipo “Nostocoida limicola”. 27
Figura 5. Apariencia de “Nostocoida limicola” I, a escala de 5 µm, en cadenas de cocos en una muestra de
biomasa de fango activo (Liu y Seviour, 2000). 28
Figura 6. Árbol filogenético basado en las secuencias genéticas del 16S rRNA de los aislamientos de “N.
limicola” I (aislamientos Ben) dentro del phyllum Firmicutes (Liu y Seviour, 2000). 30
Figura 7. “Nostocoida limicola” II al microscopio óptico a 1000x con tinción Neisser positiva (Grupo
Microbiología FACSA, 2012). 30
Figura 8. Árbol filogenético basado en la secuenciación del 16S rRNA de “Nostocoida limicola” II
(aislamientos Ben y Ver) dentro del grupo de las Actinobacterias (Seviour et al., 2002). Se muestran los
últimos aislamientos identificados de este morfotipo como Tetrasphaera jenkinsii (cepas Ben 67, 68, 14, 17 y
74), Tetrasphaera veronensis (cepa Ben 70) y Tetrasphaera vanveenii (cepas Ver 1 y Ver 2) (McKenzie et al., 2006,
Seviour y Liu, 2006). 31
Figura 9. Cepa Ben 220 al microscopio óptico a 1000x. Se muestra la desigualdad en la tinción Gram del
morfotipo “Nostocoida limicola” III (Liu y Seviour, 2001). 32
Figura 10. Árbol filogenético basado en la secuenciación del gen 16S rRNA indicando la posición
filogenética de cincos aislamientos Ben (220, 222, 223, 224, 225) de “Nostocoida limicola” III. 33
Figura 11. Esquema del protocolo de hibridación in situ. 38
Figura 12. Situación actual de la taxonomía de los morfotipos filamentosos descritos por Jenkins et al.,
2004 y Eikelboom (1983) y las sondas FISH disponibles. 40
Figura 13. Vista aérea de la EDAR Cuenca del Carraixet. 43

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Figura 14. Diagrama de proceso en bloques de la EDAR Cuenca del Carraixet con sistema de fangos
activos sin eliminación de nutrientes. 43
Figura 15. Vista en planta de la EDAR Quart Benàger. 44
Figura 16. Diagrama de proceso en bloques de la EDAR Quart Benàger con sistema de fangos activos y
con eliminación química de fósforo. 44
Figura 17. Vista en planta de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 45
Figura 18. Diagrama de bloques de proceso de EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer con sistema de fangos
activos, sin decantación primaria y con eliminación química de fósforo. 45
Figura 19. Esquema del paso de fijación de las muestras según el tipo de bacterias que se quieran analizar
(Gram positivas, Gram negativas o mycolata). 46
Figura 20. Objetivos APO de 60X y 100X de gran utilidad para visualizar con microscopio de
epifluorescencia. 52
Figura 21. Microscopio de epifluorescencia Olympus BX 50 del IIAMA. 53
Figura 22. Representación fotográfica de los criterios de valoración de abundancia de microorganismos
filamentosos. 53
Figura 23. Matriz de covarianzas RDA. 60
Figura 24. “Ca. Alysiosphaera europaea” a 600X. A) Muestra de EDAR Quart Benàger. B) Muestra de
EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 62
Figura 25. “Ca. Monilibacter batavus” a 600X. Muestra de EDAR Cuenca del Carraixet (línea A+B). 62
Figura 26. A) “Ca. Monilibacter batavus” a 600X perteneciente a la EDAR de Dénia-Ondara-Pedreguer.
B) La misma bacteria vista en contraste de fases, donde podemos observar que se ubica parcialmente
dentro del flóculo. 63
Figura 27. Nostocoida limicola II a 600X. Muestra de EDAR Cuenca del Carraixet (línea C+D). 63
Figura 28. Células individuales de Trichococcus sp. a 600X. Muestra de EDAR Quart Benàger. 63
Figura 29. Tetrasphaera japonica a 600X. Muestra de EDAR Quart Benàger. 64
Figura 30. Células individuales y agrupadas de Isosphaera sp. a 600X. Muestra de EDAR Dénia-Ondara-
Pedreguer. 64

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Figura 31. Abundancia de las poblaciones microbianas del morfotipo “N. limicola” en la línea A+B de la
EDAR Cuenca del Carraixet. 65
Figura 32. Abundancia de las poblaciones microbianas del morfotipo “N. limicola” en la línea C+D de la
EDAR Cuenca del Carraixet. 66
Figura 33. Abundancia de las poblaciones microbianas del morfotipo “N. limicola” en la EDAR Quart
Benàger. 67
Figura 34. Abundancia de las poblaciones microbianas del morfotipo “N. limicola” en la EDAR Dénia-
Ondara-Pedreguer. 68
Figura 35. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola”
(sondas FISH) y las variables del afluente de la EDAR C. del Carraixet de la línea A+B. 78
(sondas FISH) y las variables del afluente de la EDAR C. del Carraixet de la línea C+D. 79
(sondas FISH) y las variables del afluente de la EDAR Quart-Benàger. 80
(sondas FISH) y las variables del afluente de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 81
(sondas FISH) y las variables del licor mezcla de la línea de agua A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet.
82
(sondas FISH) y las variables del licor mezcla de la línea de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet.
83
(sondas FISH) y las variables del licor mezcla de la EDAR Quart Benàger. 83
(sondas FISH) y las variables del licor mezcla de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 84
(sondas FISH) y las variables operacionales de la línea de agua A+B, de la EDAR Cuenca del Carraixet.
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(sondas FISH) y las variables operacionales de la línea de agua C+D, de la EDAR Cuenca del Carraixet.
85
(sondas FISH) y las variables operacionales de la EDAR Quart Benàger. 86
(sondas FISH) y las variables operacionales de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 87
(sondas FISH) y las variables físico-químicas del afluente. 87
(sondas FISH) y las variables físico-químicas del licor mezcla. 88
(sondas FISH) y las variables operacionales de las tres estudiadas. 89
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Causas y efectos de problemas de separación de sólidos del fango activado. 19
Tabla 2. Tamaños celulares de los morfotipos “Nostocoida limicola”. 26
Tabla 3. Relación del muestreo y procedencia de las muestras analizadas. 42
Tabla 4. Sondas empleadas para la identificación de los morfotipos I, II y III de “Nostocoida limicola”.50
Tabla 5. Preparación del tampón de hibridación según el porcentaje de formamida. 51
Tabla 6. Preparación de la solución de lavado según el porcentaje de formamida. 52
Tabla 7. Criterios de valoración de Eikelboom y Jenkins (2002) para calificar la abundancia de bacterias
filamentosas. 53
Tabla 8. Parámetros físico-químicos analizados y empleados en el presente estudio. 54
Tabla 9. Parámetros operacionales de funcionamiento de las EDAR estudiadas. 55

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Tabla 10. Variables físico-químicas y operacionales a introducir en el análisis de Redundancia. 59
Tabla 11. Coeficientes de correlación de Spearman de las variables físico-químicas del afluente de la
EDAR Cuenca del Carraixet (línea de agua A+B) con las sondas FISH empleadas. 69
Tabla 12. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables físico-químicas del afluente de la línea
de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas. 70
Tabla 13. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables físico-químicas del afluente de la
EDAR Quart Benàger con las sondas FISH utilizadas. 71
Tabla 14. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables físico-químicas del afluente de la
EDAR Denia-Ondara-Pedreguer con las sondas FISH utilizadas. 71
Tabla 15. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables físico-químicas del licor mezcla (LM)
de la línea de agua A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas. 72
de la línea de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas. 72
de la EDAR Quart Benàger con las sondas FISH utilizadas. 73
de la EDAR Denia-Ondara-Pedreguer con las sondas FISH utilizadas. 73
Tabla 19. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables operacionales de la línea de agua
A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas. 74
Tabla 20. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables operacionales de la línea de agua
C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas. 74
Tabla 21. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables operacionales de la EDAR Quart
Benàger con las sondas FISH utilizadas. 75

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Tabla 22. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables operacionales de la EDAR Dénia-
Ondara-Pedreguer con las sondas FISH utilizadas. 75
Tabla 23. Coeficientes de correlación de Spearman entre las variables ambientales de las tres EDAR
estudiadas y las variables respuesta (sondas FISH). 76
Tabla 24. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros físico-químicos
asociados al afluente de la línea de agua A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet. 100
asociados al afluente de la línea de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet. 100
asociados al afluente de la EDAR Quart Benàger. 101
asociados al afluente de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 101
asociados al licor mezcla de la línea de agua A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet. 102
asociados al licor mezcla de la línea de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet. 102
asociados al licor mezcla de la EDAR Quart Benàger. 102
asociados al licor mezcla de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 103
Tabla 32. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros operacionales de
funcionamiento de la EDAR Cuenca del Carraixet (línea A+B). 103
funcionamiento de la EDAR Cuenca del Carraixet (línea C+D). 103

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funcionamiento de la EDAR Quart Benàger. 104
funcionamiento de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 104
que caracterizan el afluente de las tres EDAR estudiadas. 105
que caracterizan el licor mezcla de las tres EDAR estudiadas. 105
las tres EDAR estudiadas. 106

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RESUMEN
El morfotipo “Nostocoida limicola” es uno de los morfotipos filamentosos causantes de problemas
de separación de sólidos de los fangos activos, como son el bulking y el foaming. Este grupo de
microorganismos ha sido observado en EDAR convencionales o con sistemas de eliminación de
nutrientes ubicadas en Australia, República Checa, Italia... En España también existen evidencias de su
presencia en diversas EDAR, donde son abundantes, si no dominantes.
“Nostocoida limicola” fue identificado y agrupado desde un principio en tres grupos diferenciados
por su morfología celular: “N. limicola” I, “N. limicola” II y “N. limicola” III, mediante la microscopía óptica
como método convencional. Sin embargo, pese a las similitudes morfológicas se ha evidenciado
posteriormente que los miembros de estos grupos no tienen relación filogenética, pero sí presentan
diferencias fisiológicas. De hecho, los microorganismos que constituyen estos tres grupos forman parte
de cinco grupos filogenéticos distintos: clase Alfaproteobacteria, phyllum Actinobacteria, phyllum Chloroflexi,
phyllum Firmicutes y phyllum Planctomycetes.
Dada esta ambigüedad y la escasa información actualmente ofrecida de estos grupos de
microorganismos filamentosos, el objetivo de este proyecto es estudiar las relaciones del morfotipo
“Nostocoida limicola” con los parámetros físico-químicos y los parámetros operacionales de las EDAR
Cuenca del Carraixet, Quart Benàger y Dénia-Ondara-Pedreguer, ubicadas en la Comunidad Valenciana.
Se ha empleado la técnica de hibridación in situ (FISH) con sondas marcadas con fluoróforo
(Noli-644, MC2-629, AHW 183, NLIMI 91, NLIMII 192 y NLIMIII mix), combinada con la microscopía
de epifluoresecencia y el criterio subjetivo de Eikelboom para identificar y determinar la abundancia de
“N. limicola” en las EDAR mencionadas. También se han aplicado análisis bivariante y análisis de
redundancia para poder establecer las relaciones de todos estos parámetros ambientales con el morfotipo
en cuestión.
Los resultados de todo el procedimiento han mostrado que “Ca. Molinibacter batavus”, “Ca.
Alysiosphaera europaea”, Tetrasphaera japonica, y el phyllum Chloroflexi (bacterias del denominado grupo “N.
limicola” II), son las que presentan mayor abundancia en las tres EDAR analizadas. Pese a que tienen
preferencias fisiológicas distintas, todos estos microorganismos son aerobios, aunque presentan cierta
actividad de captación de sustratos en condiciones anóxicas. Este grupo se relaciona con valores bajos de
DQO soluble en el afluente, edad del fango y temperatura. Por otro lado este grupo tiene relación positiva
con el nitrógeno y fósforo totales en el afluente, además de con el índice volumétrico de fangos. En
general, las bacterias del morfotipo “N. limicola” requieren hidratos de carbono, proteínas y ácidos grasos
volátiles para su crecimiento, aunque con distinta preferencia.

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ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS
APHA
AF
BNR
CCA
American Public Health Association
Afluente
Eliminación biológica de nutrientes (en inglés)
Análisis Canónico de Correspondencias (en inglés)
DBO5
Demanda bioquímica de oxígeno a los 5 días
DNA Ácido desoxirribonucleico
DQO Demanda química de oxígeno
EDAR Estación Depuradora de Aguas Residuales
EDTA
EF
EPSAR
Ácido Etilenaminotetracétrico
Edad del fango
Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales
EtOH Etanol
IF Índice de filamentos (filament index, FI)
FISH Hibridación in situ con sondas 16S rDNA marcadas con fluoróforos
G+C Guanina y Citosina
GALO Gordonia amarae like organisms
IIAMA Instituto de Ingeniería del Agua y Médio Ambiente
LCFA
LM
Ácidos grasos de cadena larga (long chain fat acids)
Licor mezcla
Mycolata
N
Actinomicetos nocardioformes que contienen ácidos micólicos
Tamaño de muestras
NALO Nocardia amarae-Like Organism
OD Oxígeno disuelto
PBS Tampón fosfato salino
PFA Paraformaldehído
PHA poli β-hidroxialcanoatos
PTLO
RDA
Pine-tree like organisms
Análisis de Redundancia Canónico (en inglés)
RNA Ácido Ribonucleico
rRNA
Tª
Ácido ribonucleico ribosómico
Temperatura

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1. INTRODUCCIÓN.
1.1. El proceso de fangos activos en la depuración de las aguas residuales.
La depuración de las aguas residuales consiste principalmente en procesos biológicos de degradación
de compuestos orgánicos junto a procesos físico-químicos de separación y sedimentación de sólidos que
componen estas aguas. El objetivo de estos procesos es proteger el medio ambiente, a los seres vivos que
lo conforman y a la salud humana de la carga contaminante presente en las aguas residuales, tanto de
origen industrial como de origen urbano o doméstico, según la naturaleza de las actividades de la
población que las generan (Mujeriego, 1990).
Las Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales (EDAR) son los sistemas de depuración y
saneamiento que van a cumplir tan importante objetivo, aplicando la normativa europea y española sobre
el control de vertidos y tratamiento de aguas residuales. Actualmente es el Real Decreto 11/1995 (que
incorpora la Directiva europea 91/271/CEE), la normativa base que estipula el tratamiento de las aguas
residuales urbanas (ARU) antes de su vertido en cualquier tipo de ecosistemas acuáticos naturales.
Por todo ello el tratamiento biológico de las aguas residuales de origen urbano ha de ser más eficaz, y
con este fin el proceso de fangos activos es actualmente el sistema de depuración biológica más
frecuentemente empleado en muchas EDAR que tratan este tipo de aguas residuales.
En el año 1914, los ingenieros Ardern y Lockett desarrollan en Inglaterra el proceso de fangos activos
al incorporar, en sus ensayos con cultivo biológico en suspensión en tanque aireado, la recirculación de la
biomasa suspendida producida durante el proceso de depuración en condiciones aerobias. A dicha
suspensión biológica se la denominó fangos activos, puesto que es la biomasa activa responsable de la
degradación de los contaminantes orgánicos del agua residual, con el oxígeno proporcionado durante la
aireación. Estos contaminantes son utilizados por los microorganismos que componen la biomasa como
fuentes de carbono y/o como fuentes de energía.
Inicialmente la depuración con fangos activos era realizada en reactores que operaban como sistemas
discontinuos, de llenado y vaciado, pero a lo largo de los años, ha surgido la necesidad de tratar elevados
caudales de aguas residuales, principalmente por el crecimiento poblacional y su sobreconsumo de agua,
por lo que estos caudales han tenido que ser tratados desde hace más de 50 años (Droste, 1997) en
reactores que operan en régimen continuo.
La configuración del proceso de fangos activos comprende un reactor aireado en continua agitación
para mantener la biomasa activa en suspensión, y un decantador secundario donde se separa el agua
clarificada tratada del fango biológico que ha sedimentado en él, y que es recirculado al reactor con la
nueva biomasa formada. De las reacciones de degradación de los componentes orgánicos por parte de los
microorganismos (catabolismo) que los utilizan, como fuente de energía y/o fuente de carbono para su

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posterior crecimiento (anabolismo), resultan componentes más sencillos como el dióxido de carbono, el
agua y nueva biomasa activa.
En las EDAR se han ido desarrollando esquemas de proceso con objetivos como son la nitrificación,
la desnitrificación y la eliminación del fósforo, además de la eliminación biológica de la materia orgánica.
1.2. El flóculo como unidad fundamental del fango activo.
El flóculo es la unidad estructural y funcional del fango activo. Se trata de una estructura heterogénea
formada por agregados de partículas orgánicas e inorgánicas con bacterias filamentosas y bacterias
formadoras de flóculo, las cuales excretan sustancias poliméricas extracelulares (Jenkins et al., 2004) que
permiten esta agregación, también denominada biofloculación. Se ha estudiado que estas sustancias
poliméricas (Extracellular Polymeric Substances, EPS) constituyen una matriz extracelular compuesta de
polisacáridos, sustancias húmicas, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y carbohidratos (Found et al., 1996;
Urbain, 1993), todos ellos segregadas por las bacterias formadoras de flóculo. Además las EPS actúan
como fuertes ligamentos de unión dada su alta carga de densidad negativa (Zita y Hermansson, 1994),
adsorbiendo partículas suspendidas coloidales, dada la carga eléctrica de éstas últimas.
Adicionalmente a la comunidad bacteriana que compone el flóculo existen comunidades de
organismos superiores ligadas a esta estructura, como los protozoos (flagelados, ciliados y sarcodinos) y
los metazoos (por ejemplo, rotíferos), que son de gran importancia en el proceso de depuración. Aunque
constituyen aproximadamente un 5% de la biomasa del fango activo, respecto al 95% de las bacterias, son
organismos bioindicadores del funcionamiento de la depuración, ya que se alimentan de materia orgánica
y de bacterias dispersas que hay en el agua residual, permitiendo el crecimiento de las bacterias formadoras
del flóculo y por tanto, un aumento en la secreción de polímeros extracelulares a los que se adhieren los
sólidos suspendidos durante la sedimentación del fango activo en el decantador secundario (Jenkins,
2004). Estos organismos superiores contribuyen, de este modo, a la buena formación y sedimentación del
flóculo, indicando un buen el proceso de depuración.
Toda la biomasa celular del fango activo mencionada se organiza en el flóculo en dos niveles
estructurales (Sezgin et al., 1978):
- Microestructura: formada por la agregación de los microorganismos, gracias a su capacidad de
adherencia y al fenómeno de biofloculación. Se originan flóculos de pequeño tamaño, esféricos,
compactos y débiles.
- Macroestructura: es la red de bacterias filamentosas que sirve de “esqueleto” a las bacterias
formadoras de flóculo para su adherencia y formación de la microestructura. La integración de

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19
ambas estructuras da lugar a flóculos consistentes de gran tamaño y resistentes a las turbulencias
ocasionadas durante la agitación en el reactor biológico.
El buen funcionamiento del proceso de depuración radica, fundamentalmente, en el equilibrio de
todos los microorganismos que crecen y estructuran el flóculo dando lugar al denominado flóculo ideal,
que es compacto, fuerte y con buena capacidad de sedimentación. En caso contrario, desequilibrios en el
crecimiento de las comunidades microbianas dan lugar a flóculos con dificultad para sedimentar, lo que
crea importantes problemas para la separación de los sólidos del fango activo.
1.3. Problemas de separación de sólidos en los fangos activos.
Muchos de los problemas de separación de los sólidos del fango activado pueden estar relacionados
con la naturaleza del flóculo.
En un fango activado típico hay un amplio margen de tamaños de partículas, desde bacterias
individuales cuyo rango de tamaño es de 0,5 a 5 μm, hasta grandes agregados con dimensiones superiores
a 1 mm. Esta característica está directamente relacionada con la condición de que los microorganismos
que configuran el flóculo en sus dos niveles estructurales estén en proporciones equilibradas o no. En
este caso se presentan seis problemas de separación de sólidos causados por fenómenos físicos y
microbiológicos, presentados en la tabla 1 (Jenkins et al., 2003).
Tabla 1. Causas y efectos de problemas de separación de sólidos del fango activado.
PROBLEMA CAUSA EFECTO
Crecimiento
disperso
Fallo en la microestructura del flóculo. No se produce
la biofloculación. Los microorganismos están dispersos
en pequeños grupos o como células aisladas y no
forman flóculos.
Efluente turbio. No hay zona de
sedimentación del fango.
Bulking viscoso
(no filamentoso)
Fallo en la microestructura del flóculo por exceso de
polímeros extracelulares excretados. Las bacterias
formadoras de flóculo no pueden agregarse.
Zooglea ramigera suele ser el microorganismo causante de
esta secreción de EPS.
Fango de consistencia viscosa. Problemas
de compactación y sedimentación, de
modo que en casos severos, no se separan
los sólidos y se pierde fango por el
efluente.
Flóculo “punta de
alfiler”
(“pin-point” floc)
Fallo en la macroestructura del flóculo por falta o baja
presencia de bacterias filamentosas.
Flóculos muy esféricos bien pequeños y
muy densos de rápida sedimentación, o
bien grandes y de lenta decantación.
Bulking filamentoso
Fallo en la macroestructura del flóculo por exceso de
bacterias filamentosas que se extienden fuera del
flóculo.
Compactación y sedimentación del fango
activo muy deficiente. En casos severos
puede escapar con el efluente.
Manto ascendente
(flotación de fangos)
Liberación de nitrógeno gas por la desnitrificación dada
en el decantador secundario. Este gas se adhiere a los
flóculos y los arrastra hasta la superficie del decantador.
Formación de una espuma de fango activo
en la superficie del decantador. En casos
severos, el fango puede sobresalirse del
decantador arrastrando el agua tratada.
Foaming (espumas
biológicas)
Agregación de bacterias filamentosas con superficie
celular hidrofóbica en la que se asocian burbujas de aire
y partículas del flóculo.
Mycolata y Nocardioformes son los grupos
filamentosos mayoritariamente responsables.
Formación de espumas con aspecto céreo
y de color marrón en la superficie del
decantador secundario, que no permite la
compactación ni sedimentación completa
del fango activo al quedar flotando.
Puede perderse biomasa activa con el
efluente tratado que no puede recircularse.

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20
De todos ellos, los episodios de foaming (espumación) y de bulking (esponjamiento), son los más
comunes en las EDAR con fangos activos, producidos por un fallo en la macroestructura del flóculo, es
decir, por desequilibrios en las proporciones de bacterias filamentosas.
1.3.1. Formación de foaming y bulking.
La primera vez que se describió el problema de las espumas biológicas o foaming fue en Estados
Unidos en el año 1969 tras el suceso del “Misterio de Milwaukee” en la localidad de Milwaukee. Se estudió
la creciente masa flotante de sólidos y de microorganismos surgida en la depuradora de fangos activos y se
observó que la masa espumosa contenía gran cantidad de microorganismos Actinomicetos ramificados
Gram positivos. Posteriormente estas bacterias fueron identificadas como pertenecientes al género
Nocardia, concretamente N. amarae y N. rhodochrous (Lechevalier y Lechevalier, 1974), y por ello a estas
espumas se las empezó a conocer como “Nocardia foams” (Jenkins et al., 1993).
Sin embargo este término no resulta correcto debido a que otros microorganismos también
pueden causar dicho problema, entre ellos los Rhodococcus y Tsukamurella (Nam et al., 2003) que se
encuentran lejos de ser clasificados como especies de Nocardia.
Años más tarde, Nocardia amarae ha sido reclasificada como Gordonia amarae (Goodfellow et al.,
1994), pero a fin de que no exista confusión actualmente se utiliza el término “Nocardia foams” para
hacer referencia al problema de espumas biológicas producidas por actinomicetos nocardioforrnes que
contienen ácidos micólicos, es decir los microorganismos denominados como Mycolata.
Figura 1. Nocardia amarae con tinción de Gram vista al
microscopio óptico.
Ya se ha comentado que el foaming es un problema muy extendido y hasta ahora en estudios
realizados han dado como resultado que algunas de las plantas depuradoras con sistema de fangos
activados registradas han sufrido algún caso foaming: 66% en América (Seviour y Blackall, 1998), 68% en
Australia y un 19,8% en Francia (Seviour et al., 1994).

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Este problema de espumas biológicas produce una serie de consecuencias (Seviour y Blackall,
1998):
 Las espumas pueden alcanzar cierto nivel de espesor y desbordarse en las áreas circundantes al
reactor de fangos activados, originando zonas altamente resbaladizas e incluso inaccesibles.
 Pueden alcanzar los clarificadores secundarios, de modo que reducen la calidad del efluente al
escapar con el clarificado porque no sedimentan. Incluso existe la posibilidad de que las espumas
lleguen a los digestores anaerobios, ocasionando más espumas biológicas (figura 2).
 Pueden llegar a retenerse entre las espumas hasta un 40% de sólidos suspendidos, lo que implica
que no serán adecuadamente tratados.
 Se origina una capa superficial de espumas que no permite la transmisión del oxígeno entre el
agua y la atmósfera, lo que disminuye el oxígeno en los tanques. Esto puede llegar a crear
situaciones de anoxia, sobre todo si la capa es muy espesa y de naturaleza hidrofóbica.
 En localidades con bajas temperaturas la capa de espumas puede llegar a congelarse.
Contrariamente, en climas cálidos, las espumas pueden dar lugar a problemas de septicidad.
 Ciertos microorganismos descritos como formadores de espumas como Nocardia asteroides y
Rhodococcus equi, son patógenos oportunistas (Prescott, 1991), por lo que los aerosoles de estos
organismos son potencialmente peligrosos para la salud.
 Las espumas son claramente un problema estético, además de que pueden causar malos olores.
Figura 2. A) Decantador secundario con problemas de espumas biológicas causadas por la bacteria
filamentosa Microthrix parvicella. B) Salida de efluente clarificado del decantador anterior con sólidos que
se escapan en forma de macroflóculos.
El fenómeno de esponjamiento o bulking (Seviour y Blackall, 1999) se produce cuando las
bacterias filamentosas dominan los fangos activos, de manera que crecen dentro y fuera de los flóculos,
provocando que éstos, pese a ser fuertes y grandes, no puedan aproximarse, compactar y sedimentar
A B

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finalmente. El resultado es que el clarificado o sobrenadante producido en el decantador secundario
presenta sólidos perdidos, ya que las partículas pequeñas se filtran y se fijan a la estructura filamentosa.
Existen dos tipos de esponjamiento (tabla 1), el bulking viscoso y el bulking filamentoso. Este
último es causado por un fallo en la macroestructura del flóculo, que viene dado por un excesivo
crecimiento longitudinal de bacterias filamentosas, las cuales se extienden fuera del flóculo y generan
puentes interfloculares. También es el resultado de la presencia de bacterias que tienden a generar
estructuras floculares abiertas. En ambos casos los flóculos no pueden agregarse, dando como resultado
un aspecto esponjado del licor mezcla y una deficiente sedimentación en el decantador secundario.
Figura 3. Bulking filamentoso producido por la bacteria
filamentosa Tipo 021N al microscopio óptico en
contraste de fases a 100x. Este fango es producto de un
vertido de agua residual procedente de la industria
vinícola (Hydrolab Microbiologica).
Una de las condiciones que favorecen el crecimiento de este tipo de microorganismos es la
calidad del agua residual afluente, sobre todo si conlleva ciertos vertidos industriales. Este tipo de aguas se
caracteriza por contener bajos niveles en los nutrientes nitrógeno y fósforo, de ahí que los
microorganismos filamentosos del bulking crezcan con mayor frecuencia en EDAR de fangos activos con
sistema de eliminación de nutrientes. De hecho, los estudios sobre microorganismos filamentosos
causantes de este problema han sido determinados sobre muestras de EDAR industriales (Eikelboom et
al., 1998; Seviour y Blackall, 1999; Liu et al., 2000; Levantesi et al, 2004 y Kragelund y Kong, 2005), o
cuyas aguas residuales contenían vertidos industriales.
Además de la falta de nutrientes, las condiciones de bajo oxígeno disuelto y baja carga másica
también son favorecedoras del crecimiento de estos microorganismos filamentosos.
Los miembros de la comunidad microbiana más reconocidos como causantes del bulking
filamentoso son Thiotrix sp., Sphaerotilus sp., por los tipos filamentosos 021N, 0803 y también por
“Nostocoida limicola”.

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1.3.2. Mecanismos de formación de foaming y bulking.
Existen dos grupos de factores que afectan en la formación de espumas biológicas:
- Factores físico-químicos: son los que estabilizan las espumas. Por una parte están los sistemas de
agitación, que fomentan la producción de burbujas de aire que quedan adheridas a la matriz de
microorganismos filamentosos. Por otra se encuentran los tensioactivos, sustancias que fortalecen
la película formada en la interfase aire-agua y que permite que esta película pueda ser más fina
antes de romperse.
- Factores de crecimiento microbiológico: son los parámetros operacionales comunes en el
funcionamiento de las EDAR y fomentan el crecimiento de los microorganismos formadores de
espumas (Nocardioformes, M. parvicella, Tipo 021N, etc.). Estos factores o parámetros son:
 Oxígeno disuelto: microorganismos como “N. limicola” o H.hydrossis son capaces de crecer
utilizando los nitratos como aceptor de electrones, incluso en condiciones anaerobias
como M. parvicella y “N. limicola”, (Eikelboom, 2002; Warner 1994), aunque crecen mejor
en condiciones aerobias.
 Temperatura: el foaming se asocia más a temperaturas elevadas (Eikelboom, 1994), aunque
también se han dado casos en climas fríos, por ejemplo, actinomicetos nocardioformes
como M. parvicella.
 Requerimientos nutricionales: muchos microorganismos formadores de espumas pueden
metabolizar distintos sustratos, aunque otros como Thiotrix sp. o Sphaerotilus natans crecen
cuando hay déficit de algún nutriente (nitrógeno y/o fósforo).
 pH: imprescindible un rango de 6 a 8 para el crecimiento de los microorganismos
filamentosos. Rangos de pH entre 7,2 y 7,6 ayudan a incrementar la tasa de crecimiento
de estas bacterias del bulking y del foaming.
 Concentración de sulfuros: en aguas sépticas que fomentan el crecimiento de bacterias
del azufre como Thiotrix sp. o Beggiatoa sp.
 Carga másica: valores bajos inducen principalmente al crecimiento de bacterias como “N.
limicola”, Thiotrix sp.
1.4. Bacterias filamentosas responsables de la formación de bulking y foaming.
Las bacterias filamentosas están presentes en todas las EDAR con sistema de fangos activos,
puesto que son esenciales en la formación del flóculo y su sedimentación, y las principales causantes de los
problemas de bulking y foaming (Jenkins et al., 2004; Seviour and Nielsen, 2010). Sin embargo, no existe una

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estrategia universal para limitar o prevenir este tipo de problemas (Eikelboom et al., 2000; Jenkins et al.,
2004; Kragelund et al., 2010).
Bien es cierto que existen distintas estrategias generales para el control del bulking y mejorar la
decantación del licor mezcla. Por ejemplo, está la aplicación de cloro o peróxido de hidrógeno como
método químico (Eikelboom et al., 2006), que actúan como agentes biocidas. El cloro es el más
ampliamente empleado en países como Estados Unidos, Alemania, Australia, Gran Bretaña, etc,
principalmente por su disponibilidad, su poder desinfectante y su bajo coste. Los puntos más
recomendados para la aplicación del cloro en las EDAR son directamente en el reactor de aireación y, el
más utilizado, en la corriente de recirculación (Jenkins et al., 2004), de manera que se mantenga una buena
mezcla de los compuestos orgánicos e inorgánicos con el fango activo.
De todos los microorganismos filamentosos presentes en los fangos activos el 40% son
Actinomicetos aerobios, y de éstos 18 géneros parecen tener importancia como patógenos humanos. De
estos últimos, los géneros Nocardia, Gordonia, Rhodococcus, Skermania, Mycobacterium, Corynebacterium y
Tsukamurella pertenecen al grupo conocido como Actinomicetos Nocardioformes, que contienen ácidos
micólicos (grupo mycolata).
El grupo mycolata son las bacterias filamentosas productoras de espumas biológicas muy estables
que perjudican el proceso de depuración de las aguas residuales debido a su carácter hidrofóbico (con
pared celular hidrofóbica) (Minnikin, 1982), conferido por sus ácidos micólicos (Seviour y Blackall, 1998)
y unido a su capacidad de formar filamentos que atrapan las burbujas de aire.
Hasta el año 1980 los únicos microorganismos reconocidos como formadores de espumas y de
bulking eran los Actinomicetos nocardioformes. Sin embargo, recientes trabajos han implicado ciertos
tipos de microorganismos filamentosos asociados previamente con el aumento de volumen, especialmente
Microthrix parvicella (Blackall et al., 1994; Blackall et al., 1996).
En la actualidad solamente ciertos morfotipos filamentosos pueden ser identificados de forma
fiable empleando la microscopía y manuales basados únicamente en la morfología del organismo. Los
principales morfotipos registrados en esta condición hasta el momento son “Candidatus M. parvicella”,
Thiothrix, algunos mycolata y Sphaerotilus natans.
Además, algunos de los morfotipos filamentosos de los fangos activos no han podido ser
clasificados debido a la imposibilidad de ser aislados en cultivo puro, como Nostocoida limicola, el género
Thiothrix o algunos morfotipos de Eikelboom que son referidos como tipos numéricos tales como Tipo
0092 y Tipo 0675. La problemática con este tipo de identificación es que una misma especie puede exhibir
polimorfismos o diferentes especies pueden parecer la misma (Seviour y Nielsen, 2010).

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A nivel de inclusión taxonómica, sólo los morfotipos filamentosos Beggiatoa sp., Sphaerotilus natans,
Haliscomenobacter hydrossis, Nocardia (Gordonia) amarae, Skermania piniformis y Rhodococcus sp. están registrados
en el Bergey‟s manual of Systematic Bacteriology (Holt, 1984-1989). Ni siquiera los morfotipos de
Eikelboom han sido nombrados siguiendo las reglas del Código Internacional de Nomenclatura y por ello
están referidos como tipos numéricos.
Esta situación va cambiando poco a poco gracias al empleo de técnicas moleculares utilizadas para
caracterizar y secuenciar el gen 16s del rRNA, y con ello obtener la posición taxonómica de los morfotipos
de las bacterias filamentosas. Aunque ciertos morfotipos filamentosos clasificados numéricamente no han
podido tampoco ser situados taxonómicamente (Jenkins et al., 2004; Seviour et al., 1999): Tipo 0914, Tipo
0961, Tipo 0211, Tipo 1852 y Tipo 0581, recientemente el morfotipo 0581 ha sido identificado dentro del
género Chloroflexi (Zornoza et al., 2006), que no guarda relación con los Actinomicetos clásicos formadores
de natas (phyllum Actinobacteria), a pesar de presentar características morfológicas similares con M.
parvicella.
Un problema general con la interpretación de los datos obtenidos, antes de la aplicación de las
técnicas moleculares, es que los datos fisiológicos determinados para los morfotipos filamentosos deben
ser interpretados muy cuidadosamente. Esto es importante puesto que las interpretaciones de los datos
pueden resultar en identificaciones engañosas. Un ejemplo de esto es el caso de los grupos filamentosos
que conforman el morfotipo “N. limicola”. Con la identificación convencional mediante microscopía,
muchas bacterias filamentosas que se han ido identificando como “Nostocoida limicola” presentan
básicamente diferencias morfológicas que las dividen en tres grupos: N. limicola I, N. limicola II y N. limicola
III. Sin embargo, estos grupos probablemente no tienen relación filogenética y sí presentan, por tanto,
diferencias fisiológicas (Liu et al., 2001; Kragelund et al., 2006;).
A continuación se describe el morfotipo filamentoso “Nostocoida limicola” a partir del cual se
desarrolla este trabajo de investigación.
1.4.1. Morfotipo “Nostocoida limicola”.
A pesar de que la aplicación de los métodos moleculares ha ido incrementando la comprensión
filogenética de algunas bacterias filamentosas causantes de bulking y foaming en EDAR con fangos activos,
otras siguen siendo bastante desconocidas, como “Nostocoida limicola” (Seviour y Blackall, 1999).
Las bacterias hidrofóbicas como Microthrix parvicellay losactinomicetos nocardioformes que contienen
ácidos micólicos tradicionalmente han sido consideradas como las principales causantes de problemas de
foaming, en especial en EDAR con eliminación de nutrientes (Wanner, 1994; Seviour et al., 1994;
Eikelboom et al., 1998; Jenkins et al., 2004). No obstante, las espumas biológicas constan de muchos más

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microorganismos además del anterior, aunque son menos conocidos. Actualmente estos microorganismos
necesitan de detección e identificación por métodos más específicos y más si, como es el caso del
morfotipo “N. limicola”, son capaces de aparecer y crecer junto a M. parvicella, llegando a dominar la
biocenosis de las espumas e incluso de pasar, a pesar de ello, desapercibidas.
Descrita por primera vez por Van Veen en 1973, la bacteria filamentosa N. limicola se aisló por
primera vez de fangos activos, y se describió como Gram-positiva, con forma de cocos en cadenas, con
crecimiento lento y no móvil. Años más tarde se consideró que esta bacteria se constituye en tres
morfotipos diferenciados: “Nostocoida limicola” I, “Nostocoida limicola” II y Nostocoida limicola” III (Eikelboom
y Van Buijsen, 1983).
Los tres morfotipos consisten en células esféricas-discoidales en cadena cuyas distinciones
principales son el tamaño celular (tabla 2) y la apariencia del filamento. Ambas características se muestran
mediante técnicas de clasificación morfológica como son la tinción Gram y la tinción Neisser. Con la
primera se ha observado que los resultados son variables, pese a que se identificó previamente como
Gram-positiva. La tinción Neisser resulta positiva e indica la presencia de gránulos de polifosfato
intracelulares.
Tabla 2. Tamaños celulares de los morfotipos “Nostocoida limicola”.
Grupos morfológicos Tamaño celular (diámetro, µm)
“Nostocoida limicola” I 0,6 – 0,8
“Nostocoida limicola” II 1,2 – 1,4
“Nostocoida limicola” III 1,6 – 2,0
A pesar de que algunos estudios llevados a cabo en gran número de EDAR en Europa muestran
que “N. limicola” está muy extendida (Wanner, 1998; Seviour y Blackall, 1999), no se han dado muchos
intentos para distinguir entre los tres morfotipos, creyéndose hasta no hace demasiados años que la
bacteria era una especie distribuida en tres variantes diferenciadas sólo en el tamaño molecular.
Dicha conclusión fue errónea puesto que los tres morfotipos comprenden bacterias no
relacionadas y con propiedades diferentes en lo que respecta a sus relaciones con los parámetros
operacionales de las EDAR.
El desarrollo de estudios moleculares y técnicas como la micromanipulación y FISH han resuelto
esta problemática de ubicación filogenética de los morfotipos de “Nostocoida limicola”, dando como
resultado que cada uno de los tres morfotipos pertenece a cinco grupos filogenéticos bacterianos distintos
(Blackall et al., 2000; Liu et al., 2000; Seviour et al., 2000 y Levantesi et al., 2004). Así pues, el término
utilizado por los científicos microbianos de “Nostocoida limicola” en estudios de fangos activos para
controlar procesos de bulking y foaming es confuso y evidentemente engañoso.

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Gran parte de los microorganismos que componen los fangos activos son en general difíciles de
cultivar en medios artificiales, y no se puede obtener información de sus requerimientos nutricionales.
Solamente en cultivo puro es donde se puede utilizar su secuencia genética del gen 16s rRNA para
dilucidar su filogenia y diseñar métodos que sirvan de herramientas que permitan conocer su identificación
in situ y su dinámica poblacional.
Bien es cierto que a lo largo de los estudios realizados de las espumas biológicas y la visualización
morfológica de los microorganismos causantes, “N. limicola” presenta parecido fisiológico a M. parvicella
respecto a la capacidad de asimilar ácidos grasos de cadena larga y almacenar y acumular lípidos
intracelulares (Seviour et al., 2006). La aparición de estas bacterias filamentosas se ha relacionado con
condiciones de baja carga másica, poco oxígeno disuelto y condiciones de septicidad, principalmente.
En todo caso, es bastante arriesgado generalizar con los factores que afectan al crecimiento de
estos microorganismos cuando ya se sabe que no se trata de una especie de bacteria diferenciada en tres
grupos por su tamaño celular, sino que son morfotipos diferenciados por contener diversas especies
pertenecientes a cinco phyla distintos (Levantesi et al., 2004; Kragelund et al., 2006). Los representantes de
los morfotipos de “Nostocoida limicola” I, II y III pertenecen a la clase Alfaproteobacteria (dentro del
phyllum Proteobacteria), y a los phyllum Actinobacteria, Firmicutes, Chloroflexi y Planctomycetes
(figura 4).
Phyllum Proteobacteria:
 Clase Alfa (Morfotipos “Nostocoida limicola” I,II y III) (Kragelund et al., 2005,2006; Levantesi et al.,
2004):
Candidatus “Alysiomicrobium bavarium”
Candidatus “Alysiosphaera europea”
Candidatus “Monilibacter batavus”
Candidatus “Sphaeronema italicum”
Candidatus “Combotrhix itálica”
Candidatus “Catenimonas itálica”
Candidatus “Meganema perideroedes”
Phyllum Chloroflexi (Schade et al., 2002):
Tipo Nostocoida limicola II
Phyllum Actinobacteria (Blackall et al., 2000):
“Nostocoida limicola” II
Phyllum Firmicutes (Liu et al., 2000):
Trichoccus flocculiformes (Nostocoida limicola I)
Phyllum Planctomycetes (Liu et al., 2001):
Isosphaera sp. (“Nostocoida limicola” III) Figura 4. Filogenia del morfotipo “Nostocoida limicola”.

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El morfotipo “N. limicola” perteneciente a la clase α-Proteobacteria se mostró previamente
predominante en EDAR con agua residual de origen industrial (Kragelund et al., 2006; Levantesi et al.,
2004 y Snaidr et al., 2002) y poco común en las EDAR que tratan aguas de origen urbano (Seviour et al.,
2002).
Los morfotipos “Nostocoida limicola” se han encontrado de forma abundante en Australia, Italia y
en la República Checa. En las EDAR con fangos activos de la Comunidad Valenciana estos
microorganismos también aparecen con frecuencia, si bien no lo hacen como especie dominante.
1.4.1.1. Nostocoida limicola I
Bacteria filamentosa descrita con filamentos curvados enrollados irregularmente, relativamente
finos (0,6 – 0,8 µm) y largos (100 – 300 µm). Suele ubicarse en el interior de flóculos, pero también puede
aparecer en espacios interfloculares como bacteria libre. Los filamentos carecen de motilidad, vaina,
ramificaciones y crecimiento epifítico. Inicialmente se describió como Gram y Neisser positivos (Jenkins,
2003).
En estudios realizados en la República Checa y al este de Australia (Liu et al., 2000) se
caracterizaron ocho bacterias que se habían aislado por micromanipulación, “identificándolas”
inequívocamente como “N. limicola” I de acuerdo con su morfología y su respuesta a las tinciones
siguiendo la bibliografía (Van Veen, 1973; Jenkins, 1993).
Figura 5. Apariencia de “Nostocoida limicola” I, a escala de 5 µm, en cadenas de cocos en una muestra de
biomasa de fango activo (Liu y Seviour, 2000).

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Se obtuvieron ocho cepas, seis en Australia y dos en la República Checa, en cultivo axénico, y se
nombraron cepas “Ben”, todas Gram positivas y en su mayoría con una morfología de cocos regulares en
cadena que coincidía con “N. limicola” I (figura 5). En algunos aislamientos la disposición y forma celular
variaba dependiendo de las condiciones y el medio de cultivo.
Este organismo fue inicialmente descrito e inválidamente nombrado por Eikelboom y Van
Buijsen en 1983, en base a su apariencia al microscopio óptico, respuesta a las tinciones y similaridad
superficial a los morfotipos “Nostocoida limicola” II y III (Liu et al., 2000). “N. limicola” I es un miembro de
las bacterias Gram positivas con bajo contenido en guanina y citosina, que corresponde al phyllum
Firmicutes.
Las secuencias 16S del rRNA de las cepas aisladas demostraron que los aislamientos de este
morfotipo, algunos de ellos indistinguibles al microscopio, de diferentes depuradoras ubicadas en distintas
partes del mundo contenían más de un género conocido. Estos resultados del estudio muestran
definitivamente que son bacterias diferentes, probablemente con diferentes propiedades ecológicas y
fisiológicas (Liu et al., 2000). Además, experiencias con otras bacterias filamentosas (Erhardt et al., 1997;
Howarth et al., 1999) sugieren que pueden existir pequeñas diferencias biogeográficas en la misma especie.
En el estudio se compararon las secuencias 16S rRNA de algunas de las cepas Ben: 77,78, 200,
201, 202 y 205, agrupándose cercanamente al microorganismo Lactospharea pasteurii, un coco aerotolerante
cuyo crecimiento en cadena nunca había sido descrito y que fue aislado del fango de digestores anóxicos
(Janssen et al., 1995). Posteriormente se demostró que L. pasteurii era a su vez, en términos de sus
secuencias, 16S rRNA más del 99% similar a la bacteria filamentosa Trichococcus flocculiformi (Stackebrand et
al., 1999), que fue descrita como cocos que crecían en largas cadenas y nombrada válidamente por Scheff
en 1984. Se describió esta bacteria como una importante formadora de bulking en Alemania y no había
sido identificada en otros países anteriormente, por lo que no aparece en manuales comunes de
identificación de bacterias filamentosas formadoras de bulking como puede ser el de Jenkins et al., 1983;
Wanner, 1994 y Eikelboom, 2000.
De hecho, Scheff en 1984 opinó que T. flocculiformis no estaba relacionada con “N.limicola” I,
basándose en la comparación de la forma y dimensiones celulares, decisión rechazada a la vista de los
resultados obtenidos en el estudio posterior (Liu et al., 2000) con los aislamientos Ben y su flexibilidad
morfológica, del que se obtuvo un árbol filogenético como el mostrado en la siguiente figura.

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Figura 6. Árbol filogenético basado
en las secuencias genéticas del 16S
rRNA de los aislamientos de “N.
limicola” I (aislamientos Ben)
dentro del phyllum Firmicutes (Liu
y Seviour, 2000).
1.4.1.2. Nostocoida limicola II.
Inicialmente fue descrita como bacteria con filamentos curvados y enrollados irregularmente
semejantes a “N.limicola” I, con un diámetro de 1,2 a 1,4 µm y una longitud de 100 a 200 µm, localizadas
mayoritariamente en el interior del flóculo. Contiene septos celulares con muescas muy visibles al
microscopio óptico (figura 7), carecen de motilidad, vaina y crecimiento epifítico y se describieron
anteriormente ramificaciones verdaderas. Las tinciones Gram y Neisser son variables, dando como
resultado que las bacterias son normalmente Gram negativas y Neisser positivos. También suele presentar
gránulos de polihidroxibutirato (PHB) (Jenkins, 2003).
Figura 7. “Nostocoida limicola” II al microscopio óptico a 1000x con tinción Neisser positiva (Grupo
Microbiología FACSA, 2012).
La diversidad filogenética de este morfotipo es muy compleja y además, es el que ha sido
encontrado con más frecuencia en las EDAR con sistemas de fangos activos.
La secuenciación del 16S rRNA de los aislamientos Ben, cuyo origen se sitúa en Australia e Italia,
muestra que forman un clúster definido dentro del grupo de las bacterias Gram positivas con alto

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contenido en guanina y citosina, es decir, dentro de las Actinobacterias (Blackall et al., 2000). Actualmente
se conoce que estos aislados comparten propiedades morfológicas con los cocos no filamentosos del
género Tetrasphaera, también aislados de los fangos activos (Maszenan et al., 2000), pudiendo nombrarse
ahora de manera válida y ubicarlos como al menos cinco especies distintas dentro de éste género. Esto se
puede observar en el árbol filogenético de la figura 8.
Figura 8. Árbol filogenético basado en la secuenciación del 16S rRNA de “Nostocoida limicola” II
(aislamientos Ben y Ver) dentro del grupo de las Actinobacterias (Seviour et al., 2002). Se muestran los
últimos aislamientos identificados de este morfotipo como Tetrasphaera jenkinsii (cepas Ben 67, 68, 14, 17
y 74), Tetrasphaera veronensis (cepa Ben 70) y Tetrasphaera vanveenii (cepas Ver 1 y Ver 2) (McKenzie et
al., 2006, Seviour y Liu, 2006).
Por otra parte, cultivos del mismo morfotipo, indistinguibles al microscopio, han resultado
pertenecer al phyllum Chloroflexi (Schade et al., 2002) y a las α-Proteobacterias (Snaidr et al., 2002).
“Nostocoida limicola” tiene parecido fisiológico con Microthrix parvicella en lo que respecta a la
capacidad de asimilar ácidos grasos de cadena larga y almacenar y acumular lípidos intracelulares. Sin
embargo, también se ha descrito que las bacterias “N. limicola” II pertenecientes al grupo Actinobacteria
asimilan glicerol y palmitato más débilmente. Esto sucede bajo condiciones de cultivo anóxicas (con
nitrito y nitrato) y en condiciones anaerobias, pero no en condiciones aerobias, aunque se desconoce el
motivo. Parece ser que estas bacterias no asimilan colesterol o estradiol, aunque sí levemente glicina bajo
los tres tipos de condiciones, siendo más activo bajo condiciones aerobias. También suelen tomar ácido
benzoico sólo en condiciones anaerobias, y aunque no se sabe porqué, este ácido parece presentar
propiedades antimicrobianas que pueden expresarse sólo cuando estas bacterias respiran (Seviour et al.,
2006).

Sara Calvo García
32
Los datos sugieren que la fisiología in situ de este “filotipo” puede variar entre EDAR y también
diferir en cultivo puro para el mismo “filotipo”.
1.4.1.3. Nostocoida limicola III.
Este morfotipo se describe con filamentos curvados y enrollados irregularmente, semejantes a los
anteriores, pero de mayor grosor (1,6 a 2,0 µm) y una longitud de 200 a 300 µm (Jenkins, 2003). Como los
otros morfotipos carece de motilidad, ramificaciones, vaina y crecimiento epífito. También contiene
septos celulares con muescas claramente visibles al microscopio óptico (figura 9), siendo sus células
esféricas, ovaladas o discoidales. Comúnmente se detectan gránulos de PHB y son Gram y Neisser
positivos.
Figura 9. Cepa Ben 220 al microscopio óptico a 1000x. Se muestra la desigualdad en la tinción Gram del
morfotipo “Nostocoida limicola” III (Liu y Seviour, 2001).
Aunque este morfotipo es difícil de crecer en cultivo axénico, se han conseguido secuenciar los
genes del 16S rRNA de algunos aislamientos o cepas Ben (Seviour et al., 2002), observándose que hasta el
momento su situación filogenética los incluye como miembros del phyllum Planctomycetes, siendo cercanos
a Isosphaera pallida (Giovanni et al., 1987), pero diferentes fenotípicamente a ella. Su ultraestructura es
congruente con que sean Planctomycetes (Fuerst, 1995) ya que poseen un extenso sistema de membranas
intracelular distintivo de este grupo, además de que hibridan con la sonda PLA-46 correspondiente a los
Planctomycetes (De Neef et al., 1998).
Otros estudios de secuenciación señalan que estas bacterias no están relacionadas con el grupo de
“Nostocoida limicola” III, y que pueden aparecer en fangos activos como cocos aislados o agregados en
filamentos, haciendo que su identificación mediante microscopía convencional sea prácticamente
imposible y se llegue a subestimar su frecuencia de aparición (Liu et al., 2002).

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33
Así pues la posición de los cincos aislamientos o cepas Ben del grupo de “N. limicola” III queda
establecida en el siguiente árbol filogenético (Liu et al., 2001).
Figura 10. Árbol filogenético basado en la secuenciación del gen 16S rRNA indicando la posición
filogenética de cincos aislamientos Ben (220, 222, 223, 224, 225) de “Nostocoida limicola” III.
En el gen 16S rRNA existe un alto contenido en guanina y citosina característico del género
Isosphaera del phyllum Planctomycetes, lo cual también ha sido encontrado en aislamientos de este morfotipo,
evidenciando su pertenencia al grupo. Los datos de secuenciación del gen 16S rRNA y la limitada
caracterización fenotípica, incluyendo la información ultraestructural, parece apoyar la teoría de que
algunos de estos aislamientos Ben son cepas de Isosphaera no descritas previamente (Liu et al., 2001).
Además, los análisis de la secuencia 16S rRNA de los clones en estudios cultivo-dependientes de Ward et
al. (1995), y algunos de los nuevos aislamientos de Planctomycetes obtenidos y caracterizados (Griepenburg et
al., 1999) demuestran que los miembros de este género son más diversos de lo que en principio se creía.
Algunos de los aislamientos de “N. limicola” III muestran secuencias similares a secuencias de
genes previamente descritas. Ben 22 y Ben 25 se agrupan de manera cercana con el clon MC25 de Liesack
y Stackebrandt (1992) del suelo, y Ben 223 y 224 son muy similares al gen 16S rRNA obtenida por Bond et
al. (1995) de fangos activos. La información de bibliotecas de clones sugiere que el phyllum
Planctomycetes es una población prominente en las comunidades microbiológicas de los fangos activos
(Bond et al., 1995). Neef et al. (1998) pudo detectar cocos de tamaño mayor a 2,5 µm de diámetro, siendo
células de la talla y forma de “N. limicola” III, con sus pruebas para Planctomycetes en muchas de las muestras
que examinaron mediante la técnica FISH. Pese a que ninguno de estos cocos aparecía en cadena cabe la
posibilidad de que fueran formas no filamentosas de “Nostocoida limicola” III, y de ser así podría explicar
porqué estos organismos no se “identifican” más a menudo en análisis microscópicos en estudios de
fangos activos (Seviour y Blackall, 1999).

Sara Calvo García
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1.5. Identificación de microorganismos filamentosos.
Es de vital importancia conocer los microorganismos de los fangos activos que generan problemas
en estos sistemas y así poder desarrollar estrategias de control y soluciones prácticas. Para ello, existen dos
metodologías de identificación que poco a poco van ayudando a superar el desconocimiento sobre
microorganismos filamentosos formadores de foaming y bulking.
Los métodos clásicos o convencionales son los que se basan en la observación de la apariencia
microscópica de los microorganismos para determinar sus características morfológicas, así como el uso de
tinciones que ponen de manifiesto algunas de las características identificativas de los microorganismos.
Los métodos moleculares detectan e identifican microorganismos generalmente de forma más
rápida y eficaz, por lo que se emplean cada vez más de manera que van sustituyendo a los métodos
convencionales.
1.5.1. Microscopía como método convencional de identificación.
La microscopía convencional es normalmente utilizada para observaciones a 1000x y con óptica
de contraste de fases que muestra las características morfológicas y estructurales de los microorganismos.
En algunas ocasiones este método es suficiente para la identificación con seguridad del microorganismo
de interés, pero en otras es necesario aplicar una técnica adicional, como las tinciones, para lograr este
objetivo.
La nomenclatura basada en la observación microscópica de las características morfológicas fue
establecida por Eikelboom (1975) y otros autores la actualizaron posteriormente (Jenkins et al., 2004).
La clasificación de Eikelboom (1975) y de Jenkins et al. (2004) se basa en los siguientes caracteres
morfológicos: presencia o ausencia de ramificaciones, movilidad, forma del filamento (irregular, curvo,
enrollado, etc.), color, ubicación respecto al flóculo, existencia de crecimiento epifítico, vaina, septos,
constricciones celulares, dimensiones celulares, dimensiones del filamento, forma celular (cuadrada,
rectangular, ovalada, etc.), presencia de biopolímeros de azufre y gránulos de polifosfato, reacciones de
tinción (Gram y Neisser) y formación de rosetas y gonidios.
Los métodos convencionales son de gran ayuda para la observación de microorganismos en
EDAR de aguas residuales, sin embargo la información que aportan sobre la identidad exacta de los
filamentos observados no es fiable, razón por la cual se designa a los filamentos bajo los términos “tipo” o
“morfotipo” en vez de especie.

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El uso de técnicas convencionales para la identificación y cuantificación conlleva algunas
dificultades:
- Una misma especie puede mostrar polimorfismos o diferentes especies parecer iguales (como es el caso
del morfotipo “Nostocoida limicola”).
- Aquellos filamentos ubicados en el interior del flóculo son difíciles de identificar y cuantificar.
- Estructura abierta de los flóculos proporcionadas, por ejemplo por un excesivo crecimiento de
filamentos robustos y largos.
- Puede existir una elevada población de filamentos que no permita distinguir unas especies de otras.
- Esta metodología es subjetiva y depende del nivel de entrenamiento y experiencia del que la lleva a
término.
Los métodos clásicos son un complemento de las técnicas moleculares, proporcionando a éstas
datos de interés sobre las características del flóculo y la presencia de protozoos y otros microorganismos
asociados. A pesar de considerar la microscopía convencional como una herramienta imprescindible en el
control del proceso de depuración, a nivel microbiológico tan sólo un número reducido de bacterias
filamentosas han podido ser identificadas según sus características morfológicas. Así, en la actualidad la
identificación de las bacterias del fango activo no se puede limitar únicamente al método convencional
(Nielsen et al., 2009).
1.5.2. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA marcadas con fluoróforo (FISH),
como método molecular de identificación.
Los métodos de identificación moleculares se basan en nuevas herramientas moleculares que hacen
posible la determinación de la composición de comunidades microbianas, y la detección y cuantificación
de especies dentro de estas comunidades. Las técnicas moleculares más utilizadas en estos estudios de
diversidad microbiana a nivel genético son aquellas basadas en la amplificación y secuenciación del gen
16S, que codifica para la subunidad ribosómica bacteriana (siendo su equivalente en eucariotas la
subunidad 18S rRNA).
El gen que codifica para el RNA ribosómico 16S es el más ampliamente utilizado en estudios de
filogenia y taxonomía bacterianas. Su aplicación como “cronómetro molecular” fue propuesta por Carl
Woese a principios de la década de 1970. Aunque existen cronómetros moleculares alternativos al rRNA
16S, hasta el momento ninguno ha conseguido desplazarle, pues éste presenta una serie de características
en base a las cuales fue considerado como cronómetro molecular definitivo (Woese, 1987):

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36
1. Se trata de una molécula presente en todas las bacterias actuales. Constituye, por tanto, una diana
universal para su identificación.
2. Su estructura y función han permanecido constantes durante un tiempo muy prolongado, de modo que
las alteraciones en la secuencia reflejan probablemente cambios aleatorios
3. Los cambios ocurren de manera suficientemente lenta como para aportar información acerca de todos
los procariotas y, junto con las variaciones en los 16S rRNA, a lo largo de toda la escala evolutiva. Los
rRNA con esta subunidad (que es la pequeña entre los procariotas, siendo las subunidades 23S y 5S las
que conforman la subunidad mayor) contienen, sin embargo, suficiente variabilidad para diferenciar no
sólo los organismos más alejados, sino también los más próximos.
4. El tamaño del 16S rRNA es de aproximadamente 1.500 nucleótidos, lo cual minimiza las fluctuaciones
estadísticas en lo que respecta a las identificaciones filogenéticas, por lo que es un tamaño adecuado como
para proporcionar información suficiente.
5. La conservación en estructura secundaria puede servir de ayuda en las comparaciones, aportando una
base para el alineamiento preciso.
6. Dado la relativa facilidad de secuenciar el gen 16S rRNA se han creado bases de datos amplias, todavía
en continuo crecimiento.
La hibridación in situ con sondas u oligonucleótidos 16S rRNA/23SrRNA marcadas con
fluorocromos (FISH) ha sido una técnica común para la detección e identificación de microorganismos
en diferentes ambientes microbianos, incluyendo comunidades mixtas (Amann et al., 1995). Esta técnica
resulta interesante ya que no sólo determina la filogenia de los microorganismos sino también su
morfología, localización, abundancia y actividad.
La técnica FISH se basa en la hibridación directa de la bacteria diana con una sonda
complementaria de una región del gen 16S rRNA o 23S rRNA. El elevado número de copias de moléculas
de rRNA (10
3
-10
5
) es una ventaja en la aplicación de la técnica de hibridación al aumentar su sensibilidad
(Amann, 1994).
Este método molecular consiste en preparar cortas secuencias de DNA de una sola hebra,
llamadas sondas, que son complementarias de las secuencias de RNA que se quieren identificar. Estas
sondas pueden unirse con una secuencia de RNA complementaria (16S rRNA o 23S rRNA) y se produce
un híbrido DNA: RNA. La sonda está marcada con moléculas fluorescentes (por ejemplo fluoresceína o
rodamina) de forma que los híbridos formados sean fácilmente detectables con un microscopio de
epifluorescencia. La accesibilidad de la sonda rRNA es distinta según el gen rRNA que se trate y que la
zona del mismo sea la complementaria, lo que hay que tener en cuenta a la hora de diseñar la sonda.
Además, la especificidad de las sondas puede ser ajustada a diferentes niveles taxonómicos, como son

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37
dominio, phylum, clase, familia, género y especie, para la identificación de las bacterias en sus diferentes
comunidades naturales (Amann et al., 1995).
El microscopio de epifluorescencia es una variación del microscopio óptico en el que la luz
emitida (tanto visible como ultravioleta) no atraviesa la muestra estudiada, sino que incide sobre ella de
modo que la misma lente ilumina y recibe la luz emitida por la muestra. La imagen observada es el
resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación
primaria y la vuelven a emitir con mayor longitud de onda. Para dejar pasar sólo la emisión secundaria
deseada se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo (Haugland,
2005). Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con
fluorocromos.
La selección de un adecuado conjunto de filtros para la observación es de vital importancia.
Existen un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos,
inclusive conjuntos que permiten la observación simultánea de dos fluorocromos. Los juegos de filtros
están divididos en tres grupos y se designan según la forma de excitación: vidrios coloreados, filtros
interferenciales de banda estrecha para líneas Hg y filtros intercalares de banda ancha. Dentro de cada
grupo están ordenados según los márgenes espectrales de utilización (ultravioleta, violeta, azul-violeta,
azul, verde) con el fin de garantizar una clasificación clara de todos los filtros actuales y futuros (Holz et al.,
1998).
En la técnica de FISH la fluorescencia de las moléculas se consigue mediante la utilización de
fluorocromos. Los fluorocromos son sustancias “colorantes” que tienen la propiedad de emitir un fotón
de una longitud de onda determinada cuando son excitados por un fotón incidente de una longitud de
onda característica. La parte de la molécula que emite la fluorescencia es el fluorocromo o fluoróforo. Las
moléculas de fluorocromo se utilizan para marcar ciertas estructuras celulares destacándolas del resto de
los elementos que componen la célula. Esto permite identificar distintas moléculas o conjuntos de
moléculas. El fluorocromo puede tener afinidad por distintos elementos celulares o puede ser acoplado
químicamente a otras moléculas como anticuerpos que reconocen específicamente cierto componente
celular.
La parte más crítica de la técnica FISH es el diseño de las sondas, que deben ser lo
suficientemente específicas para unirse únicamente a la bacteria diana en presencia de otras bacterias, en
muchos casos con moléculas de rRNA muy homólogas. La sonda que se utiliza está formada por una
pequeña secuencia de nucleótidos de cadena sencilla, en cuyo extremo, normalmente el 5‟, añade un
fluorocromo. El tamaño de las sondas oscila entre 15 y 30 nucleótidos. Para asegurar la especificidad de
las sondas los tres parámetros determinantes son la temperatura, la concentración de NaCl y la concentración de
formamida en el tampón de hibridación.

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38
Figura 11. Esquema del protocolo de hibridación in situ.
En la mayoría de los protocolos la temperatura de hibridación se mantiene constante y es la
concentración de formamida la que favorecerá las condiciones de especificidad de la sonda. La hibridación
a diversas temperaturas no es recomendable debido a los efectos negativos de las altas temperaturas en las
muestras y a su dificultad técnica en el experimento (Alonso et al., 2009). La concentración de formamida
hace que disminuya la temperatura de unión de las sondas mediante el debilitamiento de los puentes de
hidrógeno. Este compuesto disminuye la temperatura de fusión de los híbridos DNA: RNA en 0,72 ºC
por cada 1% de formamida utilizada, y permite realizar la hibridación entre 30 y 50 ºC, lo que hace que a
mayor concentración de formamida aumente la intensidad de fluorescencia (Kubota et al., 2006).
Para poder poner en práctica la técnica es necesario primero fijar las bacterias, de forma que
conserven su morfología y se favorezca el acceso de las sondas a la zona de hibridación. Las células deben
ser permeabilizadas y para ello se utilizan detergentes como el SDS (sodio dodecil sulfato). En función del
tipo de la pared celular de la bacteria se utiliza un reactivo para la fijación. Para las bacterias Gram
negativas se emplea el paraformaldehído (PFA) y el etanol para las Gram positivas. En el caso de los
mycolata, la dificultad para la permeabilización reside en el elevado contenido en ácidos micólicos. La
morfología celular debe estabilizarse y las paredes y membranas celulares han de ser permeabilizadas para
que la sonda penetre, por lo que es necesario un tratamiento adicional con enzimas. Se han propuesto los
siguientes tratamientos enzimáticos para facilitar la permeabilización del grupo mycolata: lisozima
(Schuppler et al., 1998), mutanolisina (Schuppler et al., 1998, De los Reyes y Raskin 2002), lipasa y
proteinasa (Davenport et al., 2000).
El exceso de sonda que no ha hibridado tras el proceso debe ser eliminado mediante un lavado.
Después de la hibridación se puede realizar una tinción con un fluorocromo específico del DNA, 4',6-
Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato o DAPI, que permitirá teñir todas las células presentes en la muestra,
tanto las hibridadas como las no hibridadas, lo cual es posible ver a través del microscopio de
epifluorescencia.
Gracias al elevado número de fluorocromos y a las distintas técnicas de marcaje, es posible
detectar varias especies o géneros en una misma muestra con una única hibridación, así como utilizar una
sonda para cada especie, género o grupo marcada con fluorocromos distintos. Los fluorocromos de última

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39
generación emiten una señal fluorescente más intensa y son mucho más fotoestables. El marcaje directo
resulta el más rápido, sencillo y barato.
Hoy en día se ha identificado la posición taxonómica de muchos morfotipos de bacterias
filamentosas y además se han diseñado sondas para muchas de ellas (Wagner et al., 1994; Mussmann et al.,
2003; Martins et al., 2004; Jenkins et al., 2004; Rossetti et al., 2006; Eikelboom, 2006). En la figura 11 se
describe la situación taxonómica actual de los morfotipos filamentosos descritos por Jenkins et al. (2004) y
Eikelboom (1983) y las sondas FISH disponibles.
La técnica de hibridación con sondas marcadas con fluorocromos in situ (FISH), presenta
ventajas en comparación con otras técnicas. Éstas son:
 No necesita el cultivo previo de la bacteria ni la extracción de los ácidos nucleicos.
 La hibridación inespecífica con otros microorganismos presentes en la muestra no es habitual, por
lo que no se dan falsos positivos.
 No parecen existir sustancias inhibidoras que interfieren en la reacción de hibridación.
 Puede determinar directamente la abundancia de los microorganismos detectados.
 La especificidad de las sondas puede ser ajustada a diferentes niveles taxonómicos, como son
dominio, phylum, clase, familia, género, especie para la identificación de las bacterias en sus
diferentes comunidades naturales.
 Las preparaciones pueden conservarse durante mucho tiempo (años).
 Puede utilizarse junto con la tinción DAPI para determinar si las células estudiadas están vivas o
no, muy útil para la monitorización del estado de la comunidad microbiana durante la adición de
tóxicos para el control del bulking y el foaming.
Su mayor limitación reside en la sensibilidad, que depende del número de ribosomas existentes,
de la penetración de la propia sonda, y de la matriz donde estemos hibridando, ya que en muchos casos es
necesario un tratamiento previo.
Otra limitación es que el medio utilizado para el crecimiento bacteriano (en caso de que se utilicen
cultivos de microorganismos), los métodos de fijación de la bacteria y los agentes utilizados para embeber
la muestra antes de visualizarla, ejercen una importante influencia en la intensidad de la señal.
DOMINIO BACTERIA (sondas EUB338 I, II, III y IV):
Phyllum Proteobacteria:
 Clase alfa (sonda ALF1B)
Morfotipos Nostocoida limicola I, II y III:
Candidatus “Alysiomicrobium bavaricum” (sonda PPX3-1428)
Candidatus “Alysiosphaera europaea” (sonda Noli-644)
Candidatus “Molinibacter batavus” (sonda MC2-649)
Candidatus “Sphaeronema italicum” (sonda Sita-649)
Candidatus “Combothrix italica” (sonda combo-1031, en revisión)
Candidatus “Catenimonas itálica” (sonda Cate-1013)
Candidatus “Meganema perideroedes” (sondas 983 y 1028)

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Morfotipo 021N (No acumula azufre):
Candidatus “Meganema perideroedes” (sondas EU12-645, EU26-653)
 Clase beta (sonda BET42a)
Sphaerotilus natans (tipo 1701) (sonda SNA)
Leptothrix discophora (sonda LDI)
Tipo 0803 subgrupo Rubrivivax (sin sonda)
 Clase gamma (sonda GAM42a)
Acinetobacter, Tipo 1863 (sonda ACA23a)
Moraxella, Tipo 1863 (sin sonda)
Thiothrix (sonda G123)
T. disciformis (sonda G1B)
T. eikelbomii (sonda G2M)
T. flexilis (sonda G3M)
T. nivea, T. unzii (sonda TNI)
T. fructosivorans, T. ramosa (sonda TFR)
Leucothrix mucor (sonda LMU)
Beggiatoa (sin sonda)
 Clase delta
Desulfobacteriaceae (sulfatoreductoras) (sonda SRB 385Dd)
Phyllum Bacteroidetes (sonda CF319):
Haliscomenobacter spp. (sonda HHY)
Flexibacter (sin sonda)
Tipo 1863 (sin sonda)
Tipo 0092 (sin sonda)
Tipo 0411 subgrupo Flexibacter (sin sonda)
Phyllum Chloroflexi (bacterias verdes no sulfúreas) (sondas GNSB 941 y CFX 1223):
Subdivisión 1 (sondas GNSB653 y CFX 784)
Subdivisión 2 (sonda CFX 109)
Roseiflexus sp. Tipo 1851 (sonda CHL 18519)
Tipo Nostocoida limicola II (sonda AHW 183)
Phyllum Actinobacteria (sonda HGC69a):
Corynebacterineae “Mycolata” (sonda Myc 657)
Gordonia (sonda Gor 0596)
G. amarae (sondas 0192, 0205)
Nostocoida limícola II (sondas NlimII175, NlimII192)
Dietzia spp. (DIE 993)
Rhodococcus cluster B (RHOb183)
Skermania piniformis (Spin 1449)
Microthrix (sonda Mpa-all-1410)
Candidatus “Microthrix parvicella” (sondas MPA60, MPA650, MPA223, MPA645)
Candidatus “Microthrix callida” (sondas Mpa-T1-1260)
Phyllum Firmicutes (sondas LGC354A, LGC354B, LGC354C):
Trichoccus flocculiformis (“Nostocoida limicola” I) (sonda NlimI91)
Phyllum Planctomycetes (sondas EUB 338II y EUB 338IV):
Isosphaera sp. (“Nostocoida limicola” III) (sondas NlimIII301, NlimIII792, NlimIII830)
Phyllum TM7 del dominio Bacteria (sondas EUB 338II y EUB 338IV):
Isosphaera sp. (“Nostocoida limicola” III) (sondas NlimIII301, NlimIII792, NlimIII830)
Figura 12. Situación actual de la taxonomía de los morfotipos filamentosos descritos por Jenkins et al., 2004
y Eikelboom (1983) y las sondas FISH disponibles.

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2. OBJETIVOS.
Se ha demostrado que diferentes bacterias filamentosas pueden ser dominantes en la biocenosis
de las espumas biológicas, como es el caso Microthrix parvicella y el grupo mycolata. En los últimos añosse
han identificado otros morfotipos como “Nostocoida limicola” asociados a las espumas biológicas. Debido a
este hecho, muchos de estos microorganismos filamentosos no habían podido ser detectados o
identificados ni tampoco se les había dado demasiada relevancia.
En la actualidad los estudios de investigación sobre las comunidades microbianas constituyentes
de los fangos activos y de los problemas de separación de sólidos en estos sistemas, ya hacen uso de
métodos moleculares como la técnica FISH que permiten la identificación de estos microorganismos a
distintos niveles, lo que facilita la aplicación de estrategias y medidas de control específicas para cada
microorganismo.
En este trabajo de investigación el principal objetivo es estudiar las relaciones del morfotipo
filamentoso “Nostocoida limicola” con los parámetros físico-químicos y los parámetros operacionales en
diversas EDAR de la Comunidad Valenciana. Para lograrlo, se plantean los siguientes objetivos:
1. Aplicación de la técnica FISH para la identificación de los morfotipos “N. limicola” en muestras
de fango activo de las EDAR de interés.
2. Aplicación del método del Índice de Filamentosas de Jenkins et al., (2004) para la cuantificación
de filamentos de “N. limicola” presentes en las muestras de fango activo a estudiar.
3. Estudiar, relacionar y comparar la abundancia y en su caso, la dominancia, de este
morfotipo formador de espumas biológicas con parámetros tales como el pH, la temperatura, la
carga másica, la edad del fango, etc. que permiten el funcionamiento y seguimiento de las EDAR
a estudiar, para determinar la ecofisiología de “Nostocoida limicola” en plantas depuradoras a
escala real.

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3. MATERIAL Y MÉTODOS.
3.1. Toma de muestras.
Las muestras fueron recogidas del licor mezcla a la salida del reactor biológico utilizando botes de
plástico de 100 mL de volumen, pero llenándolo sólo hasta la mitad del volumen para mantener las
condiciones aerobias de las muestras durante el transporte. En el caso de que las plantas depuradoras
seleccionadas tuvieran en ese momento problemas de espumas, se recogieron muestras del licor mezcla y
por otro lado de las espumas, para caracterizar cada grupo de muestras por separado.
Las muestras fueron fijadas y permeabilizadas antes de las 24 horas tras su recogida para la
conservación de las bacterias filamentosas, y almacenadas en el Instituto de Ingeniería del Agua y Medio
Ambiente donde se ha procedido al análisis de las mismas para este proyecto.
Tabla 3. Relación del muestreo y procedencia de las muestras analizadas.
QUART BENÀGER
CUENCA del CARRAIXET DENIA-ONDARA-
PEDREGUERLínea A+B Línea C+D
04/12/2008 10/12/2008 10/12/2008 10/12/2008
17/12/2008 23/12/2008 23/12/2008 22/12/2008
14/01/2009 07/01/2009 07/01/2009 08/01/2009
28/01/2009 21/01/2009 21/01/2009 21/01/2009
11/02/2009 04/02/2009 04/02/2009 04/02/2009
25/02/2009 18/02/2009 18/02/2009 18/02/2009
11/03/2009 04/03/2009 04/03/2009 04/03/2009
25/03/2009 01/04/2009 01/04/2009 16/03/2009
07/04/2009 29/04/2009 29/04/2009 01/04/2009
22/04/2009 13/05/2009 13/05/2009 29/04/2009
06/05/2009 27/05/2009 27/05/2009 13/05/2009
20/05/2009 10/06/2009 10/06/2009 27/05/2009
03/06/2009 24/06/2009 24/06/2009 10/06/2009
17/06/2009 08/07/2009 08/07/2009 24/06/2009
01/07/2009 22/07/2009 22/07/2009 08/07/2009
15/07/2009 16/09/2009 16/09/2009 22/07/2009
09/09/2009 30/09/2009 30/09/2009 16/09/2009
23/09/2009 14/10/2009 14/10/2009 30/09/2009
07/10/2009 27/10/2009 27/10/2009 14/10/2009
21/10/2009 11/11/2009 11/11/2009 11/11/2009
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16/12/2009 21/12/2009 21/12/2009 21/12/2009
29/12/2009

Sara Calvo García
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El muestreo fue realizado a lo largo de un año, desde diciembre de 2008 hasta diciembre de 2009
y en la tabla 3 se pueden consultar las fechas de muestreo de las muestras recogidas, siendo éstas un total
de 93 muestras de fangos activos (23 por depuradora) hibridadas y cuantificadas procedentes de tres
EDAR diferentes: Cuenca del Carraixet, Quart Benàger y Denia-Ondara-Pedreguer.
En cuanto a las EDAR de donde proceden las muestras, a continuación se presentan sus
características.
3.1.1. EDAR Cuenca del Carraixet.
Situada en la comarca de L‟Horta Nord en la provincia de Valencia, esta planta depuradora posee
un caudal de proyecto de 40.000 m3/día, dando servicio a los municipios de Albalat dels Sorells, Alboraya,
Alfara del Patriarca, Almàssera, Bonrepòs y Mirambell, Foios, Godella, Meliana, Moncada, Rocafort,
Tavernes Blanques, Valencia y Vinalesa. Presenta rendimientos del 99% de SS, 97% de DBO5 y 96% de
DQO, según los datos de funcionamiento proporcionados por la EPSAR en el año 2012.
Figura 13. Vista aérea de la EDAR Cuenca del Carraixet.
Esta depuradora consta de dos líneas de depuración iguales en las que se distribuyen el caudal
entrante a los subsecuentes elementos. Estas líneas se denominan línea A+B y línea C+D, y de ambas han
sido tomadas las muestras como se puede observar en la tabla 3.
Figura 14. Diagrama de proceso en
bloques de la EDAR Cuenca del
Carraixet con sistema de fangos
activos sin eliminación de
nutrientes.

Sara Calvo García
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3.1.2. EDAR Quart Benàger.
Esta depuradora se ubica en la comarca de L‟Horta Oest en la provincia de Valencia. Con un
caudal de proyecto de 60.000 m3/día da servicio a los municipios de Alaquàs, Aldaia, Manises, Mislata,
Quart de Poblet, Valencia y Xirivella. Presenta rendimientos de 98% de SS, 98% de DBO5 y 95% de
DQO según los datos actualizados por la EPSAR en 2013.
Figura 15. Vista en planta de la EDAR Quart Benàger.
Figura 16. Diagrama de proceso
en bloques de la EDAR Quart
Benàger con sistema de fangos
activos y con eliminación
química de fósforo.
3.1.3. EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.
Esta planta depuradora está ubicada en la comarca de la Marina Alta en la provincia de Alicante.
Posee un caudal de proyecto de 15.400 m3/día y sirve únicamente a los municipios de Dénia, Ondara y
Pedreguer. Presenta rendimientos de 97% de SS, 95% de DBO5 y 93% de DQO según los datos
proporcionados por la EPSAR de 2013.

Sara Calvo García
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Figura 17. Vista en planta de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.
Figura 18. Diagrama de
bloques de proceso de EDAR
Dénia-Ondara-Pedreguer con
sistema de fangos activos, sin
decantación primaria y con
eliminación química de
fósforo.
3.2. Fijación y permeabilización de las muestras.
La fijación y permeabilización de las muestras es el primer paso a realizar tras la recolección de las
mismas, de manera que los microorganismos que hay en ellas queden estáticos y conserven lo más intacto
posible su estructura celular. Con ello se facilita su futura identificación y el manejo de muestras donde se
encuentran.
Puesto que los microorganismos pertenecen tanto al grupo de Gram positivos como a los Gram
negativos, se ha de seguir unos pasos parcialmente distintos para cada uno de ellos. Las bacterias Gram
negativas se fijan con paraformaldehído (PFA) y las Gram-positivas con etanol (EtOH).
Como se puede observar en el esquema de fijación siguiente queda también incluido el grupo
mycolata, aunque no ha sido objeto de estudio en este proyecto..

Sara Calvo García
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FIJACIÓN
Figura 19. Esquema del paso de fijación de las muestras según el tipo de bacterias que se quieran analizar
(Gram positivas, Gram negativas o mycolata).
Tras este paso hay que preparar los portaobjetos de manera que se asegure la adherencia y permanencia de
las muestras a depositar.

2014 - Estudio de las relaciones del morfotipo Nosotocoida limicola con los parámetros operacionales y fisico-químicos en EDAR de la Comunidad Valenciana

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