2014 - Identificación y cuantificación del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis formador de bulking mediante la técnica FISH y estudio de su relación con los parámetros operacionales y físico-químicos en EDAR de la Comunidad Valenciana.

Identificación y cuantificación del morfotipo
Haliscomenobacter hydrossis formador de bulking
mediante la técnica FISH y estudio de su relación con los
parámetros operacionales y físico-químicos en EDAR de la
Comunidad Valenciana
TRABAJO FIN DE MÁSTER TIPO B
MÁSTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL
GESTIÓN AMBIENTAL
Autora:
MARTA FERRER ROGLÁN
Director:
DR. JOSÉ LUIS ALONSO MOLINA
Codirector:
DR. LUIS BORRÁS FALOMIR
VALENCIA, SEPTIEMBRE 2014

AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quisiera agradecer a mis tutores José Luis Alonso y Luis Borrás Falomir por sus
consejos, dedicación y colaboración en la realización del presente trabajo. Gracias José Luis por
darme la oportunidad de realizar este trabajo en el Instituto Universitario del Agua y Medio
Ambiente (IIAMA) y por la confianza depositada en mí.
A la Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad Valenciana (EPSAR)
por facilitar los datos para la elaboración de este proyecto y a Andrés Zornoza por ayudarme
siempre en todo aquello que he necesitado.
A todos mis compañeros de laboratorio por toda su ayuda prestada y buenos ratos pasados.
A Yolanda Úbeda y Paula Serrano por su ayuda en mis dudas de estadística.
A mis amigos por estar siempre ahí.
A mis padres, a Marisa y a Antonio por vuestro apoyo incondicional, enseñanza y sacrificio.
Y por último y siempre, a Miguel y en especial a Pablo… Across the Universe.
Muchísimas Gracias a todos.

Ferrer-Roglán., 2014.
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ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN…………………………………………..……………………………………………………….…….. 1
1.1. La depuración de aguas residuales urbanas……………………………………………………………… 1
1.2. Tratamientos biológicos de aguas residuales. Fangos activos…………….........………….…... 2
1.2.1. El flóculo……………………………..……………………………………………………………………….…..……. 2
1.2.2. Problemas en los sistemas de fangos activos producidos por microorganismos……… 3
1.2.3. Composición de la microbiota………………………………………………………………………………... 4
1.3. La importancia de las bacterias filamentosas ………………………………………………………….... 5
1.3.1 Phyllum Bacteroidetes……………………………………………………………………………….…………… 5
1.3.1.1. HalIscomenobacter hydrossis…………………………………………………………………............... 7
1.3.1.2. Identificación de Haliscomenobacter con la técnica FISH……………………………………. 8
1.3.1.3. Ecofisiología…………………………………………………………………………………………………………. 11
1.3.1.4. Operaciones de control…………………………………………………………………….…………………. 12
1.4. Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos……………………………… 13
1.4.1 Técnicas convencionales………………………………………………………………………………………….. 13
1.4.2. Técnica FISH……………………………………………………………………………………………………………. 15
1.4.3. Análisis de imagen………………………………………………………………..……………………….……….. 17
1.5. Parámetros operacionales del proceso de depuración………………………………………………. 18
2. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………………………………. 20
3. MATERIAL Y MÉTODOS……………………..…………………………………………………………………………. 21
3.1. Toma de muestras……………………………………………………………………………………………………… 21
3.1.1. EDAR Quart Benàger (QB)………………………………………………………………………………………. 21
3.1.2. EDAR Cuenca del Carraixet (CX)………………………………………………………………………………. 22
3.1.3. EDAR Dénia - Ondara - (DE)…………………………………………………………………………………….. 23

ii
3.1.4. EDAR Castellón de la Plana (CS)………………………………………………………………….…………… 24
3.2. Muestreo…………………………………………………………………………………………………………………… 25
3.3. Parámetros físico-químicos y variables operacionales.……………………………………………… 27
3.3.1 Parámetros físico-químicos……………………………………………………………………………………… 27
3.3.2 Parámetros operacionales……………………………………………………………………………………….. 28
3.4. Fijación y permeabilización de las muestras……………………………………………………………… 29
3.5. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA marcadas con fluorófors (FISH).…………………. 30
3.5.1. Preparación de reactivos para FISH ………………………………………………………………………… 30
3.5.2. Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón …………………………………………… 33
3.5.3. Aplicación de las muestras a los portaobjetos ………………………………………………………… 33
3.5.4. Sondas utilizadas…………………………………………………………………………………………………….. 33
3.5.5. Hibridación “in situ” ………………………………………………………………………………………………. 34
3.6. Observación al microscopio de epifluorescencia………………………………………………………… 35
3.7. Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos …………………………….. 36
3.7.1. Criterio subjetivo de Eikelboom (2000,2006)………………………………………………………….. 36
3.7.2. Análisis de imagen con el programa Matlab 7.1…………………………………………………….. 37
3.8. Análisis estadístico ……………………………………………………………………………………………………. 38
3.8.1. Análisis de variables categóricas: Tablas de contingencia y Prueba de Chi
cuadrado………………………………………………………………………………………………………………………….. 39
3.8.2. Análisis de la varianza (ANOVA)………………………………………………………………………………. 40
3.8.3. Análisis bivariante………………………………………………………………………………………………….. 42
3.8.4. Análisis multivariante …………………………………………………………………………………………….. 43
4. RESULTADOS………………………………………………………………………………………………………………… 48
4.1 Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos………………………………. 48

iii
4.2. Toma de imágenes y cuantificación de la señal de hibridación mediante el análisis de
imagen……………………………………………………………………………………………………………………………… 52
4.2.1 Comparación entre EDAR de la cuantificación de bacterias hibridadas……………………. 59
4.3 Análisis Estadístico entre las señales obtenidas para las bacterias hibridadas con las
sondas SAP-309 y HHY y los parámetros operacionales de la EDAR…………………………………. 63
4.3.1 Coeficientes de Pearson y Spearman. Análisis Bivariante…………………………………….. 65
4.3.2. Análisis de Componentes Principales (ACP)…………………………………………………………….. 72
4.3.2.1. ACP para las variables físico-químicas del afluente y las variables biológicas
estudiada…………………………………………………………………………………………………………………………. 72
4.3.2.2. ACP para las variables físico-químicas del licor mezcla y las variables biológicas
estudiadas……………………………………………….…………………………………………………………………….... 75
4.3.2.3. ACP para las variables operacionales y las variables biológicas estudiadas…………… 77
5. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………………………………………………. 79
5.1 Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos.……………………………… 79
5.1.2 Cuantificación de la señal de hibridación mediante el análisis de imagen………………… 79
5.1.3 Comparación entre IE y la técnica FISH con análisis de imagen……………………………….. 81
5.2 Ecofisiología de los morfotipos filamentosos ……………………………………………………………. 82
5.2.1. Parámetros físico-químicos del afluente respecto a Haliscomenobacter………………… 82
5.2.2. Parámetros físico-químicos del licor mezcla respecto a Haliscomenobacter…………… 84
5.2.3. Parámetros operacionales respecto a Haliscomenobacter……………………………………… 85
5.2.4. Correlaciones entre las variables biológicas estudiadas………………………………………….. 86
6. CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………………………….. 88

iv
7. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………………………………………….. 90
8. ANEXOS………………………………………………………………………………………………………………………… 98
Anexo 1.1 Tabla de contingencia para El tipo de EDAR estudiada y el índice de Eikelboom
de H. hydrossis…………………………………………………………………………………………………………………. 98
Anexo 1.2 Prueba Chi-cuadrado para IE y Tipo EDAR………………………………………………………. 99
Anexo 2.1. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las bacterias que
presentaban señal positiva de hibridación para las sondas HHY y SAP-309 y su desviación
estándar (SD). EDAR Quart Benáger………………………………………………………………………………… 100
estándar (SD). EDAR Denia- Ondara………………………………………………………………………………….. 101
estándar (SD). EDAR Castellón Línea A+B………………………………………………………………………….. 102
estándar (SD). EDAR Castellón Línea C+D…………………………………………………………………………. 103
estándar (SD). EDAR Carraixet Línea A+B………………………………………………………………………….. 104
estándar (SD). EDAR Carraixet Línea C+D………………………………………………………………………….. 105
Anexo 3.1. Media, desviación típica, error típico e intervalo de confianza para el
promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la
sonda SAP-309 para cada EDAR estudiada……………………………………………………………………….. 106
Anexo 3.2. Prueba de homogeneidad de varianzas para SAP-309…………………………………….. 106

v
Anexo 3.3. Análisis de la varianza (ANOVA) para el promedio del área % ó concentración
(mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 para cada depuradora
estudiada…………………………………………………………………………………………………………………………. 106
Anexo 3.4. Comparaciones múltiples (Bonferroni) del promedio del área % ó
concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 para cada
EDAR estudiada………………………………………………………………………………………………………………… 107
Anexo 3.5. Media, desviación típica, error típico e intervalo de confianza para el
promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la
sonda HHY para cada EDAR estudiada………………………………………………………………………………. 108
Anexo 3.6. Prueba de homogeneidad de varianzas para HHY…………………………………………… 108
Anexo 3.7. Análisis de la varianza (ANOVA) para el promedio del área % ó concentración
(mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda HHY para cada EDAR estudiada…… 108
Anexo 3.8. Comparaciones múltiples (Bonferroni) del promedio del área % ó
concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda HHY para cada
EDAR estudiada ……………………………………………………………………………………………………………….. 109
Anexo.4.1 ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias
hibridadas con la sonda-309. KMO y prueba de Bartlett…………………………………………………… 110
Anexo 4.2 ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias
hibridadas con la sonda-309. Varianza total explicada……………………………………………………… 110
Anexo 4.3. ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias
hibridadas con la sonda-309. Matriz de componentes rotados………………………………………… 110
Anexo.4.4 ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias
hibridadas con la sonda HHY. KMO y prueba de Bartlett………………………………………………… 111
Anexo 4.5 ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias
hibridadas con la sonda HHY. Varianza total explicada……………………………………………………… 111
Anexo 4.6. ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias
hibridadas con la sonda HHY. Matriz de componentes rotados………………………………………… 111

vi
Anexo.4.7 ACP variables físico-químicas del afluente y la cantidad de bacterias
H.hydrossis cuantificados con IE. KMO y prueba de Bartlett…………………………………………….. 112
Anexo 4.8 ACP variables físico-químicas del afluente y la cantidad de bacterias
H.hydrossis cuantificados con IE. Varianza total explicada………………………………………………… 112
Anexo 4.9 ACP variables físico-químicas del afluente y la cantidad de bacterias
H.hydrossis cuantificados con IE. Matriz de componentes rotados…………………………………… 112
Anexo.4.10 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias
hibridadas con la sonda SAP-309. KMO y prueba de Bartlett……………………………………………. 113
Anexo 4.11 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias
hibridadas con la sonda SAP-309. Varianza total explicada………………………………………………. 113
hibridadas con la sonda SAP-309. Matriz de componentes rotados………………………………….. 113
Anexo.4.13 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias
hibridadas con la sonda HHY. KMO y prueba de Bartlett………………………………………………….. 114
hibridadas con la sonda HHY. Varianza total explicada……………………………………………………… 114
hibridadas con la sonda HHY. Matriz de componentes rotados………………………………………… 114
Anexo.4.16 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la cantidad de bacterias
H.hydrossis cuantificados con IE. KMO y prueba de Bartlett…………………………………………….. 115
Anexo 4.17 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la cantidad de bacterias
H.hydrossis cuantificados con IE. Varianza total explicada………………………………………………… 115
Anexo 4.18 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la cantidad de bacterias
H.hydrossis cuantificados con IE. Matriz de componentes rotados…………………………………… 115
Anexo 4.19. ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con
la sonda SAP-309. KMO y prueba de Bartlett……………………………………………………………………. 116

vii
Anexo 4.20 ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con
la sonda SAP-309. Varianza total explicada………………………………………………………………………. 116
la sonda SAP-309. Matriz de componentes rotados………………………………………………………….. 116
Anexo.4.22 ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con
la sonda HHY. KMO y prueba de Bartlett………………………………………………………………………… 117
la sonda HHY. Varianza total explicada……………………………………………………………………………… 117
la sonda HHY. Matriz de componentes rotados………………………………………………………………… 117
Anexo.4.25 ACP variables operacionales y la cantidad de bacterias H.hydrossis
cuantificados con IE. KMO y prueba de Bartlett………………………………………………………………… 118
Anexo 4.26 ACP variables operacionales y la cantidad de bacterias H.hydrossis
cuantificados con IE. Varianza total explicada…………………………………………………………………… 118
Anexo 4.27 ACP variables operacionales y la cantidad de bacterias H.hydrossis
cuantificados con IE. Matriz de componentes rotados……………………………………………………… 118
Anexo 5.1. Parámetros de crecimiento y operacionales de Haliscomenobacter hydrossis.. 119

viii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Árbol filogenético del Phylum “Bacteroidetes”……………………………………………………….….6
Figura 2. Géneros de la clase “Sphingobacteriia”………………………………………………………………………7
Figura 3. . Filamentos de H. hydrossis con microscopía de contraste de fases, 1500x……………….8
Figura 4. Árbol filogenético del morfotipo filamentoso H. hydrossis basado en las secuencias
del gen 16S rRNA………………………………………………………………………………………………………………………9
Figura 5. Vista aérea EDAR Quart Benàger (QB)………………………………………………………………….…..21
Figura 6. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR QB………………………………………………………22
Figura 7. Vista aérea EDAR Cuenca del Carraixet (CX)………………………………………………………….....22
Figura 8. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR CX………………………………………………………23
Figura 9. Vista aérea EDAR Dénia – Ondara – Pedreguer (DE)…………………………………………………24
Figura 10. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR DE………………………………………………….…24
Figura 11. Vista aérea EDAR Castellón de la Plana (CS)……………………………………………………………25
Figura 12. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR CS…………………………………………………….25
Figura 13. Fijación de las muestras………………………………………………………………………………………….30
Figura 14. Criterio de valoración de abundancia de filamentos……………………………………………….36
Figura 15. Flujo de procesos para la cuantificación de bacterias………………………………..……………38
Figura 16. Representación esquemática de las matrices del modelo ACP……………………………….44
Figura 17. Ejemplos de muestras de fango activo hibridadas con la sonda HHY mediante FISH
(600x)……………………………………………………………………………………………………………………………………..49
Figura 18. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para la EDAR Quart según FISH para la
sonda HHY………………………………………………………………………………………………………………………………50
Figura 19. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para la EDAR Denia-Ondara-
Pedreguer según FISH para la sonda HHY……………………………………………………………………………….50
Figura 20. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para las dos líneas de tratamiento de
la EDAR Castellón según FISH para la sonda HHY…………………………………………………………………….51

ix
Figura 21. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para las dos líneas de tratamiento de
la EDAR Carraixet según FISH para la sonda HHY………………………………………………………….…………51
Figura 22. Campo de la muestra 07/01/09 de la depuradora Carraixet línea A+B hibridada con
la sonda HHY mediante la técnica FISH (en rojo) y otra correspondiente a toda la comunidad
bacteriana (sonda EUBmix) (en verde)……………………………………………………………………..…………….53
Figura 23. Campo de la muestra 11/02/09 de la depuradora Quart hibridada con la sonda SAP-
309 mediante la técnica FISH (en rojo) y otra correspondiente a toda la comunidad bacteriana
(sonda EUBmix) (en verde)……………………………………………………………………………………………………..53
Figura 24. Hoja de cálculo generada por el programa de cuantificación de señal……………………54
Figura 25. Evolución del porcentaje de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 y HHY
mediante la técnica FISH en la EDAR Quart Benáger. ………………………………………………………….…55
mediante la técnica FISH para la EDAR de Denia…………………………………………………………………….56
mediante la técnica FISH para las dos líneas de tratamiento A+B y C+D de la EDAR de
Castellón…………………………………………………………………………………………………………………………………57
mediante la técnica FISH para las dos líneas de tratamiento A+B y C+D de la EDAR de
Carraixet………………………………………………………………………………………………………………………………...58
Figura 29. Representación gráfica de diagramas de caja y bigotes del promedio del área %
(SAP) ó concentración (mg SSVLM/L) (SAPCONC) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP-
309 para cada EDAR estudiada…………………………………………………………………………………………….…60
Figura 30. Representación gráfica de diagramas de caja y bigotes del promedio del área %
(HHY) ó concentración (mg SSVLM/L) (HHYCONC) de las bacterias hibridadas con la sonda HHY
para cada EDAR estudiada………………………………………………………………………………………………………62
Figura 31. Gráficos de las saturaciones factoriales (estructura rotada) de las variables físico-
químicas del afluente y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 (a), HHY
(b) y H. hydrossis cuantificadas con el IE (c)……………………………………………………………………………74
Figura 32. Gráficos de las saturaciones factoriales (estructura rotada) de las variables físico-
químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 (a),
HHY (b) y H. hydrossis cuantificadas con el IE (c)……………………………………………………………………76
Figura 33. Gráficos de las saturaciones factoriales (estructura rotada) de las variables
operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 (a), HHY (b) y
H.hydrossis cuantificadas con el IE (c)………………………………………………………………………………….…78

x
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Principales contaminantes de un agua residual…………………………………………………………..1
Tabla 2. Problemas de separación en el proceso de fangos activos: causas y efectos……………….3
Tabla 3. Sondas del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis……………………………………………………9
Tabla 4. Parámetros de crecimiento de Haliscomenobacter hydrossis…………………………………….11
Tabla 5. Estudios sobre las técnicas y procesado de cuantificación y análisis de imagen…………17
Tabla 6. Número de muestras por depuradora……………………………………………………………….………26
Tabla 7. Relación de muestras estudiadas………………………………………………………………………………27
Tabla 8. Parámetros físico-químicos determinados en el licor mezcla…………………………………….28
Tabla 9. Parámetros físico-químicos determinados en el afluente al reactor y en efluente del
decantador secundario……………………………………………………………………………………………………..……28
Tabla 10. Variables operacionales………………………………………………………………………………………..…28
Tabla 11. Sondas empleadas en la identificación de bacterias filamentosas……………………………34
Tabla 12. Tampón de hibridación según porcentaje de formamida…………………………………………34
Tabla 13. Solución de lavado según porcentaje de formamida……………………………………………….35
Tabla 14. Escala de valoración de organismos filamentosos…………………………………………………...36
Tabla 15. Nomenclatura utilizada en el ACP para las variables físico-químicas……………………….46
Tabla 16. Nomenclatura utilizada en el ACP para los parámetros operacionales…………………….47
Tabla 17. Nomenclatura utilizada en el ACP para las variables biológicas……………………………….47
Tabla 18. Valor medio, mínimo, máximo y desviación típica de los parámetros físico-
químicos…………………………………………………………………………………………………………………………………64
Tabla 19. Valor medio, mínimo, máximo y desviación típica de los parámetros
operacionales..............................................................................................................................65
Tabla 20. Correlaciones de Pearson y de Spearman entre las bacterias hibridadas con las
sondas SAP-309 y HHY con las variables físico-químicas del afluente……………………………………..67
sondas SAP-309 y HHY con las variables físico-químicas del licor mezcla………………………………..68
sondas SAP-309 y HHY con las variables operacionales del proceso……………………………………….70

xi
sondas SAP-309 y HHY con las variables biológicas del proceso………………………………………………71

xii
ABREVIATURAS y ACRÓNIMOS
ACP: Análisis de Componentes Principales
AGV: Ácidos grasos volátiles
ANOVA: Análisis de varianza de un factor
CCARBO: Carga de carbohidratos
CCD: Charge Coupled Device
CLSM: Microscopio Láser Confocal
CM: Carga Másica
CMdbo3: Carga másica promedio de los 3 días anteriores al muestreo de LM expresada como
DBO5
CMdqos3: Carga másica promedio de los 3 días anteriores al muestreo de LM expresada como
DQOs
CS: Castellón de la Plana
CX: Cuenca del Carraixet
DBO5: Demando Bioquímica de Oxígeno total a los 5 días
DBO5NKT: DBO5/NKT
DBOPT: DBO5/PT
DE: Denia-Ondara-Pedreguer
DQO: Demanda Química de Oxígeno
DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección alemana
de microorganismos y cultivos celulares)
Dynafilm: Dynamics and composition of filamentous microorganism communities in industrial
water systems
EDAR: Estación Depuradora de Aguas Residuales
EF: Edad de Fango
EPSAR: Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad Valenciana
Esp: Espumas
F: Formamida

xiii
FISH: Hibridación in situ con sondas fluorescentes
he: habitantes equivalentes
H. hydrossis: Haliscomenobacter hydrossis
HHY: Promedio del área % de las bacterias hibridadas con las sondas HHY y EUBmix I, II, II
HHYCONC: concentración (mgSSVLM/l) de las bacterias hibridadas con las sondas HHY y
EUBmix I, II, II
IEHHY: cantidad de H. hydrossis cuantificada por el índice de Eikelboom
IIAMA: Instituto de Ingeniería del Agua y Medio Ambiente
IF: Índice de Filamentos
IVF: Índice Volumétrico de Fango
Ks: constante de afinidad del substrato
µmax: velocidad específica máxima de crecimiento
QB: Quart Benáger
LM: Licor Mezcla
NH4af: Nitrógeno amoniacal afluente
NTaf: Nitrógeno total afluente
NTSSVLM: Nitrógeno Total del Licor Mezcla (mg/gSSVLM)
Oalt: Oxígeno en el reactor biológico >2 ppm
Obajo: Oxígeno en el reactor biológico <0.8 ppm
OD: Oxígeno disuelto
Omed: Oxígeno en el reactor biológico 0.8-2 ppm
PBS: tampón salino fosfato
PFA: paraformaldehido
Phlm: pH del licor mezcla
PO4: Fósforo relativo al ortofosfato
PO4af: Fósforo relativo al ortofosfato del afluente
Prote: Proteínas

xiv
PT: Fósforo Total
PTaf: Fósforo total afluente
PTSSVLM: Fósforo Total del Licor Mezcla (mg/gSSVLM)
R1: reactor 1
R2: reactor 2
SAP: Promedio del área % de las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y EUBmix I, II, II
SAPCONC: concentración (mgSSVLM/l) de las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y
EUBmix I, II, II
SPE: Sustancias Poliméricas Extracelulares
SS: sólidos suspendidos
SSLM: Sólidos en Suspensión del Licor Mezcla
SSVLM: Sólidos en Suspensión Volátiles del Licor Mezcla
T: Temperatura del reactor biológico
TRH: Tiempo de Retención Hidráulico en el reactor biológico

1
1. INTRODUCCIÓN
1.1. La depuración de aguas residuales urbanas
La generación de aguas residuales es una consecuencia inevitable de las actividades humanas.
El agua residual se define como aquella constituida por cualquier combinación de aguas
descargadas de actividades domésticas, y de establecimientos industriales o comerciales,
aguas de escorrentía superficial y, accidentalmente, de cualquier agua de infiltración de
alcantarillados (UNE-EN 1085:2007).
La calidad del agua está caracterizada por su composición físico-química y biológica. Siendo la
composición, sin duda, el factor que más influye en el proceso de depuración del agua residual.
A continuación, en la Tabla 1 se describen los principales contaminantes que se pueden
encontrar en el tratamiento de un agua residual y la razón de su importancia.
Tabla 1. Principales contaminantes de un agua residual (Metcalf y Eddy, 1998)
Contaminante Razón de importancia
Sólidos en suspensión
Desarrollo de depósitos de fango y condiciones anaerobias en el
medio acuático
Materia orgánica
biodegradable
Agotamiento de los recursos naturales de oxígeno y desarrollo de
condiciones sépticas
Patógenos Posibilidad de transmisión de enfermedades contagiosas
Nutrientes
Crecimiento anormal de algas y bacterias (aumento de la turbidez
del agua)
Eutrofización del agua
Materia orgánica refractaria
(agentes tensoactivos, fenoles,
pesticidas agrícolas, etc)
Resistencia a la biodegradación y toxicidad
Contaminantes emergentes
(productos farmacéuticos y de
higiene personal)
Interactuación con el sistema hormonal y endocrino de los
organismos de los ecosistemas.
Metales pesados Ecotoxicidad
Sólidos inorgánicos disueltos
Reacciones con sustancias disueltas en el agua pasando a formar
compuestos peligrosos
Contaminación térmica por
descarga de aguas de
refrigeración
Modificación de la solubilidad del oxígeno en el agua.
Aceleración del metabolismo de la flora y faunas acuáticas
(Eutrofización)
Alteración de ecosistemas acuáticos
Con el objetivo de prevenir el deterioro de la calidad de los medios receptores de aguas
residuales, así como eliminar, o al menos reducir, los niveles de los contaminantes presentes
en estas aguas, se emplean Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales (EDAR).
Generalmente las EDAR están compuestas por un tratamiento primario (eliminación de
sólidos), secundario (biológicos) y terciario (desinfección) (Catalán, 1997).

2
1.2. Tratamientos biológicos de aguas residuales. Fangos activos
Los tratamientos biológicos son especialmente utilizados para conseguir una eliminación
eficaz de la materia orgánica, los nutrientes (nitrógeno y fósforo) y los microorganismos
patógenos, utilizando reacciones asociadas a los organismos vivos. Los microorganismos
crecen utilizando los contaminantes del agua como fuente de carbono y/o como fuente de
energía, convirtiéndolos en nuevos microorganismos (biomasa), dióxido de carbono y
otros compuestos inocuos (Ferrer y Seco, 2007).
El proceso de fangos activos es el sistema de tratamiento biológico más extendido en la
depuración de aguas residuales urbanas. Se trata de un tratamiento biológico de cultivo en
suspensión donde una masa activa de microorganismos se encarga de estabilizar un
residuo orgánico por vía aerobia. La matera orgánica se oxida hasta CO2, NH3 y H2O y
nueva biomasa celular.
El aire es aportado por medio de difusores o aireación mecánica. La biomasa celular
obtenida forma flóculos que sedimentan en el tanque de clarificación o sedimentación
(Bitton et al. 1999).
Una parte de la biomasa decantada se recircula al reactor para mantener una
concentración de microorganismos adecuada, mientras que el resto del fango se extrae
del sistema evitando una acumulación excesiva de biomasa y controlando el tiempo de
retención celular (Knobelsdorf et al. 2005).
1.2.1. El flóculo
Un requerimiento esencial para el correcto funcionamiento del proceso de fangos activos
es la formación de un flóculo adecuado de microorganismos en el tanque de aireación,
con el tamaño adecuado para soportar las turbulencias del agua y poder sedimentar
posteriormente, produciendo un sobrenadante fluido y claro.
El flóculo, como unidad fundamental estructural y funcional del fango activo, está
compuesto por la agregación de partículas orgánicas e inorgánicas del agua afluente junto
con microorganismos (bacterias formadoras de flóculo y bacterias filamentosas), todo ello
en un proceso facilitado por la excreción de sustancias poliméricas extracelulares (SPE) de
origen microbiano (Jenkins et al. 2004). Junto al flóculo aparecen asociadas unas
comunidades de organismos superiores (protozoos y metazoos), que desempeñan un
papel fundamental en la depuración.

3
En el flóculo se distinguen dos niveles estructurales: la microestructura y la
macroestructura (Sezgin et al. 1978). La microestructura la confieren los procesos de
agregación y biofloculación, dando lugar a la formación de flóculos pequeños, esféricos,
compactos y débiles. La macroestructura del flóculo está originada por las bacterias
filamentosas, estos organismos forman una “espina dorsal” dentro del flóculo donde las
bacterias formadoras de flóculo (microestructura) se adhieren. Por tanto, generan la
consistencia suficiente para que puedan formarse flóculos más fuertes, grandes y
resistentes a la agitación del reactor biológico.
Cuando la proporción de bacterias filamentosas y formadoras del flóculo crecen en
equilibrio se forma el flóculo ideal, que es compacto, denso, grande y sedimenta bien,
permitiendo obtener un sobrenadante claro y un fango concentrado. En caso contrario,
aparecen problemas de separación de los sólidos del fango activo, relacionados con la
naturaleza del flóculo.
1.2.2. Problemas en los sistemas de fangos activos producidos por microorganismos
Existen algunos tipos de problemas en la separación de sólidos en los sistemas de fangos
activos en los que se ven implicados los microorganismos presentes en el reactor y en el
decantador secundario. A continuación se describen brevemente los principales
problemas detectados y sus posibles causas y efectos (Tabla 2).
Tabla 2. Problemas de separación en el proceso de fangos activos: causas y efectos (Jenkins et al.
2003; Ferrer y Seco, 2007)
Problema Causa Efecto
Crecimiento
disperso
Los microorganismos no forman flóculos,
están dispersos, formando pequeños
grupos o células aisladas.
Efluente turbio.
Bulking viscoso
o no
filamentoso
Fallo de la microestructura por exceso de
polímeros extracelulares.
Fango viscoso con problemas de
sedimentación y compactación.
Flóculo punta
de alfiler, “Pin-
floc” o
“Pinpointfloc”
Fallo de la macroestructura del flóculo
debido a la ausencia a una proporción
excesivamente baja de bacterias
filamentosas.
Flóculos de pequeño tamaño y de
consistencia débil que no sedimentan
bien, produciendo un sobrenadante
turbio con muchos sólidos en
suspensión. Índice volumétrico del
Fango (IVF) bajo.
Esponjamiento
o “Bulking”
Fallo de la macroestructura por un exceso
de organismos filamentosos.
Sedimentación y compactación muy
deficientes. En casos severos hay
pérdidas de fango con el efluente. IVF
alto y sobrenadante muy claro.

4
Tabla 2. Problemas de separación en el proceso de fangos activos: causas y efectos
Formación de
espumas y/o
natas o
“Foaming”
Asociado a determinadas tipos de bacterias
filamentosas (Nocardia spp y Microthrix
parvicella). Y sobrenadantes no
degradables.
Grandes cantidades de sólidos del
fango activo flotan formando espuma
en la superficie de los elementos de
tratamiento, pudiendo salir con el
efluente.
Manto
ascendente o
flotación de
fangos
La desnitrificación en el clarificador
secundario libra N2 gaseoso poco soluble
que se adhiere a los flóculos de fango activo
arrastrándolos a la superficie del
clarificador.
Se forma una espuma de fango activo
en la superficie del clarificador
secundario.
1.2.3. Composición de la microbiota
El papel de los microorganismos es fundamental en el proceso de depuración de aguas
residuales. La biomasa del fango activo está constituida por bacterias, protozoos, hongos,
rotíferos, algas y nematodos.
En el fango activo, los microorganismos más abundantes son las bacterias, constituyendo
el 95% de la biomasa. Intervienen principalmente en la eliminación de materia orgánica
por distintas vías y en la eliminación de nutrientes. Sin las bacterias formadoras de flóculo
y las bacterias filamentosas sería imposible la sedimentación y la obtención de un efluente
clarificado y de calidad.
El segundo grupo más importante y numeroso son los protozoos, constituyendo el 5% de
la biomasa (Fernández-Galiano et al. 1996; Serrano et al. 2008). Las funciones principales
del grupo protista son eliminación de patógenos y coliformes, clarificado del efluente y
biofloculación.
Los hongos no son considerados de importancia en el proceso de depuración, debido a
que bajo determinadas condiciones pueden proliferar pero rara vez compiten con las
bacterias en la utilización de la materia orgánica disuelta.
El papel principal de las algas en los sistemas de depuración es el de proporcionar oxígeno
a las bacterias para que éstas puedan participar activamente en la eliminación de materia
orgánica del agua residual (Ferrer, 2007). Por el contrario, la excesiva proliferación de
algas puede dar lugar a graves problemas como atascos en las conducciones.
El último grupo en los sistemas de fangos activos son los rotíferos junto con los nematodos
que constituyen la cima de la cadena trófica. La principal función es la depredación de
organismos inferiores, sin embargo los rotíferos además eliminan bacterias dispersas y

5
contribuyen a la formación del flóculo por la secreción de mucus. Son indicadores de un
buen funcionamiento del proceso de depuración. La presencia de elevadas cantidades de
rotíferos y nematodos indica una edad del fango alta y por lo tanto cambios en la
capacidad de depuración del fango activo.
1.3. La importancia de las bacterias filamentosas
En todos los tipos de Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales con procesos de fangos
activos aparecen las bacterias filamentosas, siendo responsables de la mayoría de los
problemas de bulking y foaming (Jenkins et al. 2004; Seviour y Nielsen, 2010). La excesiva
abundancia de estas bacterias puede ser problemática para la operación de la planta y no
existe una estrategia universal para limitar o prevenir este comportamiento problemático
(Eikelboom, 2000; Jenkins et al. 2004).
Más de 30 morfotipos filamentosos han sido identificados en plantas de tratamiento de
aguas residuales urbanas (Eikelboom, 2000), siendo este número mayor en plantas que
reciben agua de origen industrial (Eikelboom y Geurkink, 2002; Eikelboom, 2006).
Las bacterias filamentosas deben ser consideradas como un miembro más de la
comunidad biológica de los fangos activos, ya que están involucradas en la degradación de
la materia orgánica.
1.3.1 Phylum Bacteroidetes
El phylum Bacteroidetes está compuesto por cuatro grupos filogenéticos: “Bacteroidia”,
“Flavobacteria”, “Sphingobacteria”, y “Cytophagia” según el Bergey’s Manual of Systematic
Bacteriology (Bergey’s, 2011); representando 15 familias y alrededor de 7.000 especies
diferentes (NCBI, 2010). Además, dos grupos están relacionados con el phylum pero no están
realmente asignados a ninguna de las 4 clases existentes. Sin embargo, mientras no exista
nueva información que evidencie a qué clase pertenecen, estos organismos se clasifican como
“Incertae sedis” de la clase “Cytophaga” a día de hoy (Figura 1).

6
Figura 1. Árbol filogenético del Phylum “Bacteroidetes” (Bergey’s, 2011)
Bacterias filamentosas del phylum Bacteroidetes han sido identificadas en diferentes
ambientes como sistemas marinos (Kämpfer, 1995), marismas (Lydell et al. 2004) y en sistemas
de fango activo (Eikelboom, 2002; Jenkins et al. 2004; Kämpfer, 1995; Wagner et al. 1994).
Dentro de la clase “Sphingobacteriia”, está la familia “Saprospiraceae”, donde se encuentra la
especie Haliscomenobacter hydrossis objeto de estudio del presente trabajo (Figura 2). El
genoma de H. hydrossis es la primera secuencia completa de genoma publicada de un
miembro de la familia “Saprospiraceae” (Daligault et al. 2011).
En sistemas de fango activo, Haliscomenobacter hydrossis es la única especie que se ha aislado
dentro de este phylum (Eikelboom, 1975; Kämpfer, 1995; van Veen et al. 1973; Williams y Unz,
1985).

7
Figura 2. Géneros de la clase “Sphingobacteriia” (Bergey’s, 2011)
1.3.1.1 Haliscomenobacter hydrossis
Haliscomenobacetr hydrossis es una bacteria filamentosa que ha sido detectada en distintas
muestras de fangos activos por todo el mundo (Eikelboom, 2006; Van Veen et al. 1973).
H. hydrossis ha sido identificada en diversas muestras de agua con foaming y bulking de EDAR
de EEUU, diversos países europeos, Sudáfrica y Australia, en función de sus características
morfológicas (Jenkins et al. 2004; Seviour y Nielsen 2010).
Se caracterizan morfológicamente por presentar filamentos cortos y rectos (con apariencia de
agujas) o largos y un poco torcidos, normalmente salientes de los flóculos (Figura 3); Pueden
encontrarse en el fóculo o libres en suspensión, presentando una longitud entre 10 y 200 µm.
Ocasionalmente se presentan filamentos largos unidos, no ramificados (observándose
raramente falsas ramificaciones), no móviles, de longitud variable, con un diámetro de célula
en torno a 0,4 µm. Las células están rodeadas por una vaina, pudiendo existir adherencia, no
observándose septos (aunque pueden aparecer espacios vacíos en las células de los
filamentos). Además no presentan almacenamiento de sulfuro, ni oxidación de sulfuro, son
Gram negativas y Neisser negativas (Eikelboom, 2006; Jenkins, 2003).

8
Figura 3. Filamentos de H. hydrossis con microscopía de contraste de fases, 1500x
(Eikelboom, 2008)
Existen diferentes morfotipos que tienen en común que presentan filamentos finos, rectos o
torcidos como H. hydrossis, y células sin septo visible, sin embargo no hibridan con las sondas
de H. hydrossis o con las sondas específicas de este grupo (Eikelboom, 2008):
 Tipo IF-33: muchos filamentos cortos, principalmente se presentan dentro de los
flóculos.
 Tipo IF-45: Neisser positivo (gránulos pequeños).
 Tipo IF-46: Gram and Neisser positivo (gránulos pequeños).
 Tipo IF-47: filamentos torcidos libres en la fase acuosa.
 Tipo IF-53: comparada con H. hydrossis presenta filamentos más robustos,
ocasionalmente enmarañados.
 Tipo 0092: comparada con H. hydrossis presenta filamentos más robusto, y tinción
gris-violeta con Neisser.
1.3.1.2. Identificación de Haliscomenobacter con la técnica FISH
La identificación de bacterias filamentosas a partir de diferencias morfológicas y tamaños de
las células y filamentos, puede ser ambigua, por ello es conveniente utilizar métodos
moleculares como la técnica FISH para una identificación más precisa. Las sondas que se
utilizan en la actualidad para la identificación y cuantificación de H. hydrossis son las que
aparecen descritas en la Tabla 3. En la Figura 4 se muestra el árbol filogenético basado en el
análisis comparativo de las secuencias del gen 16S rRNA de los principales morfotipos de la

9
bacteria filamentosa H. hydrossis. Los corchetes indican la cobertura de las sondas descritas en
la Tabla 3.
Tabla 3. Sondas del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis
Sonda Diana Comentarios Referencias
SAP-309 Mayoría de miembros de la
Saprospiraceae
Filamentos y células
aisladas
Schauer y Hahn (2005)
HHY-654 H. hydrossis y Aislado 10B Filamentos Kragelund et al. (2008)
HHY H. hydrossis Filamentos Wagner et al. (1994)
Figura 4. Árbol filogenético del morfotipo filamentoso H. hydrossis basado en las secuencias
del gen 16S rRNA (Nielsen et al. 2009).
El proyecto Dynafilm1
de la UE estudió la comunidad de microorganismos filamentosos en
aguas industriales. Wagner et al. (1994) participó en el proyecto y utilizó la sonda HHY en
muestras del licor mezcla de 10 EDAR alemanas. La sonda está basada en la secuencia de
nucleótidos de una cepa de H. hydrossis de la colección de DSMZ2
. Se encontró H. hydrossis en
1
Dynamics and composition of filamentous microorganism communities in industrial water systems
2
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección alemana de microorganismos y
cultivos celulares).

10
6 de las 10 depuradoras. Se visualizó en gran medida como filamentos finos teñidos. Éstos,
normalmente se localizaban dentro de los flóculos del fango, tal y como describe van Veen et
al. (1973). Por ello, la cuantificación de Haliscomenobacter ssp. con microscopía convencional
suele estar infravalorada, ya los que finos filamentos son casi indetectables en los flóculos
gruesos de fango activo.
Van der Waarde et al. (2002) realizó un exhaustivo estudio con la sonda HHY en 70 EDAR de 11
tipos de tratamientos industriales en 4 países (Países Bajos, Dinamarca, Alemania e Italia):
industrias de patata, leche, alimentarias, papel, carne, químicas, cerveza, azúcar, textil,
curtiduría y otras. H. hydrossis fue frecuentemente observada (58% de las muestras), sin
embargo su abundancia en estas muestras no fue estudiada.
Posteriormente, se diseñaron nuevas sondas para detectar filamentos con forma de aguja de
apariencia similar a H. hydrossis (Kragelund et al. 2008):
 sonda HHY-654: esta nueva sonda hibrida otro aislado de H. hydrossis aparte de la
cepa tipo DSMZ. El nuevo aislado presenta una semejanza de 97,5% con la secuencia
de la cepa DSMZ
 sonda HHY-T5-654: esta sonda se basó en un producto de RT-PCR (filamentos
obtenidos mediante micromanipulación) y comparte un 87.8% de semejanza con la
secuencia del gen 16S rRNA respecto a H. hydrossis (cepa DSMZ).
Kragelund et al. (2008) estudiaron la abundancia de H. hydrossis y de filamentos similares a H.
hydrossis en 126 muestras de EDAR diferentes industrias y 5 muestras de EDAR municipales de
Dinamarca, Italia, Polonia, Alemania y los Países Bajos. Para ello utilizó las sondas HHY, HHY-
654, HHY-T5-654 y SAP (309), esta última porque cubre la mayoría de las secuencias de la
familia Saprospiraceae y el género Haliscomenobacter. Pequeñas poblaciones de H. hydrossis y
filamentos similares a H. hydrossis fueron observados en la mayoría de EDAR (68%), sin
embargo sólo en un 13% de las EDAR estudiadas tenían grandes poblaciones de Bacteroidetes
potencialmente responsables de “bulking”. La gran variedad de industrias en las que aparece
demuestra que no es posible relacionar las diferentes cepas de "H. hydrossis" con un agua
residual específica.
Sin embargo, alrededor del 40% de las muestras, donde una gran población de filamentos
semejantes a H. hydrossis fueron observados por microscopía convencional de contraste de
fases, presentaron ninguna o casi ninguna señal de hibridación con FISH para las sondas
empleadas. Es por tanto evidente que el morfotipo de H. hydrossis incluye por lo menos 4

11
especies y son necesarias más sondas para una completa identificación de este morfotipo con
la técnica FISH.
1.3.1.3. Ecofisiología
Un buen conocimiento de la ecología y fisiología de las bacterias filamentosas, junto con las
condiciones del proceso de depuración, proporciona el desarrollo de mejores y más eficientes
estrategias de control (Kragelund et al. 2008).
En la siguiente Tabla 4 se muestran los rangos óptimos de los parámetros de crecimiento para
H. hydrossis (Mulder y Deinema, 2006; van Veen et al. 1973).
Tabla 4. Parámetros de crecimiento de Haliscomenobacter hydrossis
Parámetro Descripción
Categoría nutricional Quimiorganotrofo
Desnitrificación Nitrato reducido a nitrito
Medio de cultivo Requieren: Glucosa y sacarosa y fuentes inorgánicas y orgánicas de N como
glutamato, aspartato y casaminoácidos. tiamina y vitamina B12.
pH 7,0-8,0
Tª 8-30 (óptimo 26)
Requerimientos Oxígeno
Disuelto (OD)
Aerobio
µmax 1.2-2.2 d
-1
Ks mgl
-1
5 mgl
-1
para glucosa
En general, todos los filamentos de Haliscomenobacter hydrossis y filamentos similares a H.
hydrossis utilizan glucosa y propionico, pero nunca acetato. Parece que estén relativamente
especializados en la degradación aerobia de azucares, debido a su capacidad de tomar glucosa
y N-acetilglucosamina (Kragelund et al. 2008). Sin embargo, presenta una estricta dependencia
ante la presencia de calcio, magnesio y fosfato; altas concentraciones de amonio (>2 g/l)
inhiben el crecimiento de Haliscomenobacter y además prefiere un rango de concentración de
fósforo (0.05-0.2 g/l) y una baja concentración de extracto de levadura y peptona (Kämpfer et
al. 1995b)
Unidades de N-acetilglucosamina se encuentran en lipopolisacáridos y peptoglicanos de la
pared celular, los cuales son componentes liberados por las células en descomposición (Barker
and Stuckey, 1999). Cuando se produce la degradación continua de las células en EDAR,
unidades de N-acetilglucosamina pueden proporcionar el crecimiento de las bacterias
filamentosas del phylum Bacteroidetes y por tanto explicar su presencia en muchas EDAR. La
toma de N-acetilglucosamina y mezcla de aminoácidos por finos filamentos Bacteroidetes
también ha sido observada en biofiltros de una EDAR municipal y cultivados en un reactor en
laboratorio (Kindachi et al. 2004).

12
Kragelund et al. (2008) observaron diferentes exo-enzimas excretados por filamentos similares
a H. hydrossis, como glucuronidasas, esterasas y quitinasas, que servirían para la ruptura de los
polisacáridos. La hidrólisis con exo-enzimas de peptoglicanos y lipopolisacáridos en unidades
de N-acetilglucosamina, puede contribuir como continuo aporte de substrato para las
bacterias y promover un nicho altamente especializado en EDAR. Esta especialización en
polisacáridos ha sido confirmada en estudios de cultivo puro en H. hydrossis ((Kämpfer, 1995;
Krul, 1977; Mulder y Deinema, 1992; van Veen et al. 1973, 1982).
1.3.1.4. Operaciones de control
Finos filamentos de Bacteroidetes están presentes en muchas EDAR, tanto municipales como
industriales, pero raramente están involucrados en incidencias de bulking y foaming, sin
embargo contribuyen en el índice global filamentoso de la muestra. Normalmente, no tiene
una gran importancia realizar acciones preventivas para eliminar estos filamentos de las EDAR.
Sin embargo, en raros casos donde causan problemas, el control es necesario (Kraegelund et
al. 2008; Seviour y Nielsen 2010).
Para resolver un problema de bulking se suelen realizar las siguientes operaciones de control
(Eikelboom, 2002; Jenkins et al. 2004; Tandoi et al. 2005):
 Buen mantenimiento.
 Eliminar deficiencias de oxígeno: O2 > 2 mg / l y DBO: N:P= 100:5:1.
 Configuración en dos etapas (aeróbico/ aeróbico o anaeróbio/aerobio), para eliminar
la mayoría de la fracción fácilmente biodegradable antes de que entre al tanque de
aireación.
 Selector aerobio.
 Zona anóxica si hay suficiente nitrito/nitrato disponible para eliminar la fracción
disuelta del influente por medio de desnitrificación.
 Zona anaerobia con combinación de proceso Bio-P.
 Control de síntomas, por ejemplo, aplicando métodos físicos o químicos encaminados
a destruir filamentos o a mejorar la velocidad de sedimentación de los flóculos por
aumentar su peso.
Diferentes autores han propuesto las siguientes condiciones operacionales en las EDAR que
favorecen el crecimiento de H. hydrossis:
 Bajos niveles de oxígeno disuelto, aunque valores exactos de estos niveles no son
conocidos (Eikelboom y van Buisen 1983; Jenkins et al. 2004).

13
 Elevadas edades de fango o altos tiempos de residencia celular.
 Baja Carga másica (CM). Elevadas edades de fango o altos tiempos de residencia
celular. Valores de CM mayores a 0,15 Kg DBO5 /Kg MLSS d (Lemmer y Lind, 2000), en
un rango bastante amplio de CM de 0,1 a 0,75 Kg DBO5 /Kg MLSS d según Richard
(1989) y Eikelboom (2000).
 Deficiencia de nitrógeno o fósforo en los licores mezcla.
 Sustratos solubles fácilmente biodegradables.
Se ha sugerido como control potencial de muchas bacterias filamentosas la selección
metabólica, con cambios de condiciones aerobias a anóxicas o anaerobias estrictas donde las
bacterias no son capaces de crecer (Wanner, 1994). Sin embargo, no parece ser suficiente para
eliminar completamente la presencia de los finos filamentos de Bacteroidetes. De hecho, en
muchas EDAR estudiadas, con diferente configuración de procesos
(nitrificación/desnitrificación y eliminación biológica del fósforo) se encontraban todavía
poblaciones de H. hydrossis y filamentos similares a H. hydrossis (Kragelund et al. 2008). Esto
puede ser debido su alta resistencia al estrés por falta de nutrientes (Chiesa y Irvine, 1985), y
su capacidad en utilizar N-acetilglucosamina y compuestos similares, que comparten con unas
pocas bacterias como las del phylumChloroflexi (Kindachi et al. 2004).
No existe un protocolo de control específico de H. hydrossis y filamentos similares a H.
hydrossis, por su especialización en la degradación de azúcares procedentes de la
descomposición celular de la pared bacteria, que hace imposible eliminar el contenido de
estos sustratos para reducir su abundancia en las aguas de las EDAR (Kragelound et al. 2008).
Se está investigando en nuevas técnicas de control basadas en la utilización de bacteriófagos
específicos. Recientemente, Kotay et al. (2011) realizaron un estudio donde se controlaba la
biomasa de H. hydrossis mediante la aplicación de un bacteriófago lítico (virus).
1.4. Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos
1.4.1 Técnicas convencionales
Los métodos clásicos se basan en la observación microscópica de las muestras para
determinar las características morfológicas, tamaño de la célula y del filamento, y
respuesta a la tinción Gram y Neisser. Eikelboom en 1975 publicó el sistema de
identificación convencional para las bacterias filamentosas más frecuentes en fangos
activos. Posteriormente Eikelboom y van Buijsen (1983) y Jenkins et al. (1993),

14
desarrollaron unas claves de identificación dicotómicas en función de una serie de
características morfológicas y una reactiva a las tinciones diferenciales clásicas.
Los caracteres morfológicos en los que se basa la clasificación de Eikelboom (1975), y de
Jenkins et al. (2004) son: presencia o ausencia de ramificaciones, movilidad, forma del
filamento (curvo, irregular, enrollado, etc.), color, ubicación respecto al flóculo, existencia
de crecimiento epífitico, vaina, septos, constricciones celulares, dimensiones celulares,
dimensiones del filamento, forma celular (cuadrada, rectangular, ovalada, etc.), presencia
de biopolímeros de azufre y gránulos de polifosfato, reacciones de tinción (Gram y
Neisser) y formación de rosetas y gonidios.
Las versiones más actualizadas, Eikelboom (2000, 2006) y Jenkins et al. (2004), son una
modificación de las claves de identificación de Eikelboom y van Buijsen (1983) donde se
recogen las bacterias filamentosas más frecuentes en fangos activos.
Los métodos convencionales son de gran ayuda para la observación de microorganismos
en EDAR de aguas residuales, sin embargo no dan información fiable sobre la identidad
exacta de los filamentos observados, por ello, los filamentos son designados con los
términos “tipo” o “morfotipo” en vez de especie.
La identificación y cuantificación mediante las técnicas convencionales puede resultar
dificultosa por una serie de razones:
 Esta metodología es subjetiva y depende del nivel de entrenamiento y de la
experiencia del que realiza la cuantificación e identificación.
 Una misma especie puede mostrar polimorfismos o diferentes especies parecer
iguales.
 Algunos filamentos que se encuentran en el interior de los flóculos son difíciles de
identificar y cuantificar.
 Estructura abierta de los flóculos.
 Elevada población de filamentos.
Los métodos clásicos complementan a las técnicas moleculares ya que proporcionan
información de interés sobre las características del flóculo y la presencia de protozoos y otros
microorganismos asociados. La microscopía convencional es considerada una herramienta
indispensable para el control del proceso de depuración pero a nivel microbiológico realmente

15
solo unas pocas bacterias filamentosas han podido ser identificadas según sus características
morfológicas, por ello actualmente se sabe que la identificación de las bacterias del fango
activo no puede llevarse a cabo utilizando sólo el método convencional (Nielsen et al. 2009b).
1.4.2. Técnica FISH
Para la identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos, se emplean los
métodos moleculares (Blackall, 1994; Bradford et al. 1996; Erhart et al. 1997; Kanagawa et al.
2000; Wagner et al. 1994), en particular la técnica de hibridación in situ con sondas u
oligonucleótidos 16S rDNA/23S rDNA marcadas con fluoróforos (FISH) ha sido particularmente
productiva a la hora de llevar a cabo dicho objetivo (Nielsen et al. 2009b). Esta técnica es
común para la detección e identificación de microorganismos en diferentes ambientes
microbianos, en los que se incluyen comunidades de bacterias como las presentes en los
sistemas biológicos de depuración con fangos activos (Amann et al. 1995).
La técnica FISH se basa en la hibridación directa de la bacteria a identificar con una sonda
complementaria de una región del gen 16S o 23S ARN ribosómico, que previamente se ha
diseñado para que sea específica de la bacteria que se va identificar. La sonda está marcada
con una molécula fluorescente de tal forma que los híbridos formados se pueden detectar
fácilmente con un microscopio de epifluorescencia. .
La especificad de las sondas puede ser ajustada a diferentes niveles taxonómicos como son
dominio, phylum, clase, familia, género o especie para la identificación de las bacterias
presentes en el fango activo. Las sondas deben ser lo suficientemente específicas para unirse
únicamente a la bacteria que se quiere identificar. Para asegurar la especificidad, los dos
parámetros determinantes son la temperatura y la concentración de formamida en el tampón
de hibridación (Alonso et al. 2009). La formamida hace que disminuya la temperatura de unión
de las sondas mediante el debilitamiento de los puentes de hidrógeno, es decir, disminuye la
temperatura de fusión de los híbridos DNA: RNA en 0,72ºC por cada 1% de formamida
utilizada y permite realizar la hibridación a 46ºC (Alonso et al. 2009).
El paso final de la hibridación in situ es la detección de la sonda marcada que hibridó con las
células. Para ello se requiere de un microscopio de epifluorescencia equipado con diferentes
filtros para los diversos espectros de color, en este caso se debe tener en cuenta el tipo de
fluorocromo con el que fue marcada la sonda y de esta manera emplear la longitud de onda
adecuada que excitará el fluorocromo y emitirá la fluorescencia.

16
La técnica de hibridación con sondas marcadas con fluoróforos in situ (FISH), presenta una
serie de ventajas frente a otras técnicas de detección e identificación:
 Permite detectar varias especies o géneros en una misma muestra, utilizando una
sonda para cada especie, género o grupo, marcada con fluoróforos distintos.
 No se han detectado sustancias inhibidoras que interfieren en la reacción de
hibridación.
 Puede determinar directamente la abundancia de los microorganismos detectados.
 No necesita cultivo previo de la bacteria ni la extracción de los ácidos nucleicos
(Nielsen et al. 2009b).
 Las preparaciones pueden conservarse durante mucho tiempo (años).
 Se mantiene la morfología de la célula y el flóculo (Nielsen et al. 2009b).
 Puede utilizarse junto a la tinción DAPI para determinar si las células estudiadas están
vivas o no, siendo muy útil para la monitorización de estado de la microbiota durante
la adicción de tóxicos para el control de “bulking” y “foaming”.
Sin embargo se aprecian ciertas limitaciones:
 La identificación a través de FISH es solo posible si la sonda requerida está disponible.
 Se han desarrollado sondas para varias especies filamentosas importantes, pero aún
no para todas las especies que puedan aparecer en el fango activo.
 Podría afectar las características morfológicas de las especies filamentosas.
 Las bacterias filamentosas con bajo contenido ribosomal no dan una señal fluorescente
clara con la sonda.
 Puede ocurrir que una sonda específica para una especie de una señal fluorescente
con otras especies, si sus composiciones de rRNA son muy parecidas. Tales resultados
positivos falsos pueden ser prevenidos mediante la aplicación de sondas
competidoras.
 No entrega información sobre características importantes de fango, tales como la
población de protozoos o las características del flóculo.

17
1.4.3. Análisis de imagen
La tecnología de procesamiento digital de imágenes mejora la detección de la señal mediante
la aplicación de técnicas sobre la imagen con el fin de hacerla más adecuada para una
determinada aplicación o procesamiento posterior. Diversas aplicaciones informáticas han sido
desarrolladas en el estudio del monitoreo microbiano en EDAR utilizando técnicas de análisis
cuantitativo de imagen tal y como se recoge en la Tabla 3 (Costa et al. 2013).
Tabla 5. Estudios sobre las técnicas y procesado de cuantificación y análisis de imagen
Microscopio Aumentos Iluminación Adquisición
de imágenes
Software Referencias
Stereo X50 Campo
oscuro
CCD cámara
(±10)
Microsoft
Visual C++
Grijspeerdt and
Verstraete
(1997)
Luz óptica X400 Contraste de
fases
CCD cámara Visilog 5.1 Amaral et al.
(1999)
Luz óptica X100 Campo claro Vídeo cámara
(70)
Visilog TM
5
da Motta et al.
(2001b)
fases
CCD cámara
(50)
Matlab
Image
Processing
Toolbox
Jenné et al.
(2002)
fases
CCD cámara
(±12)
Global Lab
Image
2.10
Contreras et al.
(2004)
Luz óptica
(filamentos) y
stereo
(agregados)
X100 (filamentos),
x100
(microagregados),
x40
(macroagregados)
Contraste de
fases
(filamentos)
y campo
claro
(agregados)
CCD cámara
(±100)
Matlab Araya-Kroff et
al. (2004)
Luz óptica X100 Campo claro Vídeo cámara
(70)
Visilog
TM5
Pandolfi and
Pons (2004)
Micro lens - Iluminador
halógeno
CCD cámara
(40)
NI Vision
Assitant
Yu et al. (2009)
Luz óptica y
epifluorescencia
X100, x200 Campo claro CCD cámara
(150+100)
Matlab Mesquita et al.
(2011a, b)
El análisis de imagen combinado con FISH es un sistema que se está expandiendo como técnica
biológicas de análisis en EDAR. Esta técnica permite una rápida cuantificación de
microorganismos (Hug et al. 2005) y una precisa caracterización de los agregados microbianos
(Liu et al. 2010).

18
El sistema más sensible utilizado en FISH es mediante el empleo de la cámara CCD (Charge
Coupled Device), la cual detecta fotones con una alta eficacia sobre rangos de amplio espectro
de longitud de onda y que además, mediante un paquete informático apropiado para el
análisis de imágenes, permite la digitalización y manipulación de las mismas.
Otro equipo usado para FISH es el microscopio láser confocal (CLSM). Al restringir la señal a
una sección fina de la muestra que se investiga, la fluorescencia desenfocada es removida, lo
cual genera imágenes más definidas. El sistema es usado para muestras densas como fangos
activos, biopelículas o cortes de tejidos. Así mismo, el CLSM ha permitido el recuento de
microorganismos presentes en la muestra (Stoecker et al. 2010; Trujillo et al. 2010).
Daims et al. (2001) desarrolló un protocolo para determinar la concentración de bacterias en
muestras ambientales con la combinación de FISH, CLSM y análisis digital de imagen,
demostrando la utilidad de esta técnica para células no distribuidas homogéneamente.
Otros estudios se han realizado utilizando empleando FISH y análisis de imagen para conocer
cómo la combinación del contenido y densidad de filamentos afecta a la decantación de la
biomasa en sistemas de fango activo. En este caso se empleó el software ImageJ V1.37 (Jassby
et al. 2014).
1.5. Parámetros operacionales del proceso de depuración.
Los parámetros operacionales básicos de diseño más utilizados en el control y seguimiento de
las EDAR son la carga másica (CM) y la edad del fango (EF) (Zornoza et al. 2012).
La carga másica representa la relación existente entre la carga orgánica alimentada al reactor y
los microorganismos presentes en él. Suele definirse como la demanda bioquímica de oxígeno
en 5 días (DBO5) que llega diariamente al tratamiento biológico en relación con la masa de
fangos en el reactor, los sólidos suspendidos volátiles del licor mezcla (SSVLM) diarios en el
reactor, o incluso puede definirse relacionando dicha DBO con los sólidos suspendidos totales
del licor mezcla (SSLM), por ello es muy importante al hablar de carga másica establecer a qué
concentración de sólidos está referida (Ferrer, 2007).
La EF representa la relación expresada en días entre la masa de fango en el reactor y la masa
de fangos eliminada diariamente de la instalación. Dicho parámetro da una idea acerca del
tiempo de retención de los microorganismos en la EDAR, ya que estos siguen un ciclo desde

19
que son decantados y recirculados al reactor, hasta que salen por la corriente de purga de
fangos en exceso.
Las variables CM y EF conceptualmente guardan entre sí una relación inversa. Recientemente
se ha demostrado que esta relación no siempre tiene lugar en una escala real. El sustrato
puede variar en un espacio corto (días) o largo de tiempo (meses) y la temperatura puede
fluctuar en mayor o menor grado en función de la estacionalidad y de la situación geográfica
de las EDAR (Zornoza et al. 2012).
Otro parámetro operacional es el Tiempo de Retención Hidráulico (TRH). El TRH se define
como el tiempo medio de permanencia del agua o del fango en los reactores de la planta de
eliminación de materia orgánica y nutrientes. Se obtiene a partir del volumen del reactor y del
caudal de alimentación. El TRH de la mezcla de fango activo y afluente es un parámetro
operacional del cual aparecen escasas referencias en los manuales de Eikelboom (2006) y
Jenkins et al. (2004). Este es un parámetro hidráulico está relacionado indirectamente con la
CM.

20
2. OBJETIVOS
 El desarrollo de este trabajo tiene como objetivo principal la identificación y
cuantificación de la población de bacterias filamentosas del morfotipo
Haliscomenobacter hydrossis en 4 EDAR (Quart Benáger, Castellón, Denia y Carraixet)
de la Comunidad Valenciana, durante un período de un año.
 Se estudiará la dinámica poblacional de Haliscomenobacter hydrossis y las relaciones
entre las variables operacionales y físico-químicas, que pueden afectar a su actividad y
crecimiento.
 Como último objetivo se comparará el índice de Eikelboom con la técnica de FISH
combinada con el análisis de imagen para la cuantificación de bacterias filamentosas.
De esta forma se tratará de optimizar la metodología de cuantificación de bacterias
filamentosas en muestras de agua de EDAR mediante la técnica de FISH combinada
con el análisis de imagen.

21
3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. Toma de muestras
En el presente estudio se tomaron muestras del licor mezcla de cuatro EDAR de la Comunidad
Valenciana con una frecuencia quincenal durante un año.
Las muestras analizadas en este proyecto son proporcionadas por el Instituto de Ingeniería del
Agua y Medio Ambiente (IIAMA).
A continuación se presentan algunas de las características de estas depuradoras, así como sus
esquemas de funcionamiento.
3.1.1. EDAR Quart Benàger (QB)
La depuradora de Quart-Benàger (Figura 5) se ubica en la comarca valenciana de L´Horta Oest,
dando servicio a los municipios de Alacuás, Aldaia, Manises, Mislata, Quart de Poblet, Valencia
y Xirivella.
Figura 5. Vista aérea EDAR Quart Benàger (QB)
Según datos del 2013, trata un caudal de agua residual y urbana de 33.785 m3
/día,
abasteciendo a una población de 154.421 habitantes equivalentes y presenta unos
rendimientos de eliminación para sólidos suspendidos y DBO5 del 98% y del 95% para DQO.
El tratamiento biológico se desarrolla en cuatro reactores paralelos anóxico-anaerobio de
geometría rectangular (Figura 6).

22
Figura 6. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR QB
3.1.2. EDAR Cuenca del Carraixet (CX)
La EDAR Cuenca del Carraixet (Figura 7) está ubicada en la comarca valenciana de L´Horta
Nord, en el municipio de Alboraya. Trata un caudal de agua de 36.843 m3
/día, procedente de
13 municipios colindantes (177.666 he) según datos publicados del 2013 de la EPSAR. Para
este mismo año, los rendimientos de eliminación obtenidos fueron para los sólidos
suspendidos del 98%, para DBO5 del 97% y para DQO del 96%.
Figura 7. Vista aérea EDAR Cuenca del Carraixet (CX)

23
La depuradora consta de cuatro líneas de agua residual compuestas de pretratamiento,
tratamiento primario y tratamiento de biológico por el sistema convencional de fangos
activados y desinfección. En cuanto al tratamiento de la línea de fangos primarios y en exceso,
se realiza en cuatro líneas con espesamiento, digestión anaerobia, acondicionamiento químico
y secado mecánico. Para el tratamiento biológico, cuenta con dos líneas aerobias: línea A+B y
línea C+D, ambas con una zona anaerobia (Figura 8).
Figura 8. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR CX
3.1.3. EDAR Dénia - Ondara - (DE)
La EDAR Dénia - Ondara – Pedreguer (Figura 9) se ubica en la provincia de Alicante, en la
comarca de La Marina Alta y da servicio a los tres municipios que su nombre indica.

24
Figura 9. Vista aérea EDAR Dénia – Ondara – Pedreguer (DE)
Trata un caudal de 17.086 m3
/día con una población servida de 66.414 he (datos EPSAR 2013).
El tratamiento consta de una sola línea con proceso de oxidación total y tiene un rendimiento
de eliminación del 97% para sólidos suspendidos, 97% de DBO5 y 95% de DQO (Figura 10).
Figura 10. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR DE
3.1.4. EDAR Castellón de la Plana (CS)
La EDAR de Castellón de la Plana (Figura 11) se encuentra localizada en la comarca de la Plana
Alta en la provincia de Castellón, abasteciendo únicamente a dicha población.

25
Figura 11. Vista aérea EDAR Castellón de la Plana (CS)
Para el año 2013, la EPSAR da como datos de funcionamiento un caudal tratado de 39.126
m3
/d, prestando servicio a 205.650 habitantes equivalentes (he). Los rendimientos de
eliminación son los siguientes: 95% para SS, 96%para DBO5 y 93% para DQO (Figura 12).
Figura 12. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR CS
3.2. Muestreo
La campaña de muestreos se realizó quincenalmente desde diciembre de 2008 a diciembre de
2009. Las muestras fueron simples realizadas de forma puntual.
El muestreo se realizó siempre en el mismo punto, generalmente a la salida del reactor
biológico. Se tomaron 1.500 ml de licor mezcla con un recipiente de plástico, a partir de estas
muestras se tomaron alícuotas para su fijación que se realizó antes de las 24 horas.

26
El transporte y conservación de las muestras en los botes fue en condiciones aerobias, dejando
en los mismos una cámara de aire sobre el licor mezcla.
En el caso que la planta presentaba problemas de espumas se tomaron muestras tanto del
licor mezcla como de las espumas de forma independiente. Sólo se encontraron problemas de
espumas en el periodo muestreado en la EDAR del Carraixet (CX).
Todas las EDAR estudiadas tratan aguas de origen doméstico, aunque las plantas de
tratamiento de Quart Benàger y Carraixet reciben además aguas industriales.
En la Tabla 6 se muestra el número de líneas de tratamiento independientes de cada EDAR y el
número de muestreos realizados en cada punto. El cómputo total de muestras fue de 148.
Tabla 6. Número de muestras por depuradora
EDAR Número de muestras
Abreviatura Nº líneas Reactor Espumas
QB 1 24 -
DE 1 24 -
CX 2 (A+B y C+D) 46 8
CS 2 (R1 y R2) 46 -
A continuación se muestra por cada depuradora sus respectivas fechas de muestreos (Tabla 7):

27
Tabla 7. Relación de muestras estudiadas
QB DE CS CX
04/12/08 R 10/12/08 R 03/12/08 R.1 03/06/09 R.2 10/12/08 R.(A+B) 22/07/09 R.(A+B)
17/12/08 R 22/12/08 R 03/12/08 R.2 17/06/09 R.1 10/12/08 R.(C+D) 22/07/09 R.(C+D)
14/01/09 R 08/01/09 R 17/12/08 R.1 17/06/09 R.2 23/12/08 R.(A+B) 16/09/09 R.(A+B)
28/01/09 R 21/01/09 R 17/12/08 R.2 01/07/09 R.1 23/12/08 R.(C+D) 16/09/09 R.(C+D)
11/02/09 R 04/02/09 R 15/01/09 R.1 01/07/09 R.2 07/01/09 R.(A+B) 30/09/09 R.(A+B)
25/02/09 R 18/02/09 R 15/01/09 R.2 15/07/09 R.1 07/01/09 R.(C+D) 30/09/09 R.(C+D)
11/03/09 R 04/03/09 R 28/01/09 R.1 15/07/09 R.2 21/01/09 R.(A+B) 14/10/09 R.(A+B)
25/03/09 R 16/03/09 R 28/01/09 R.2 09/09/09 R.1 21/01/09 R.(C+D) 14/10/09 R.(C+D)
07/04/09 R 01/04/09 R 11/02/09 R.1 09/09/09 R.2 04/02/09 R.(A+B) 14/10/09 Esp(A+B)
22/04/09 R 29/04/09 R 11/02/09 R.2 23/09/09 R.1 04/02/09 R.(C+D) 14/10/09 Esp(C+D)
06/05/09 R 13/05/09 R 25/02/09 R.1 23/09/09 R.2 18/02/09 R.(A+B) 27/10/09 R.(A+B)
20/05/09 R 27/05/09 R 25/02/09 R.2 07/10/09 R.1 18/02/09 R.(C+D) 27/10/09 R.(C+D)
03/06/09 R 10/06/09 R 11/03/09 R.1 07/10/09 R.2 04/03/09 R.(A+B) 27/10/09 Esp(A+B)
17/06/09 R 24/06/09 R 11/03/09 R.2 21/10/09 R.1 04/03/09 R.(C+D) 27/10/09 Esp(C+D)
01/07/09 R 08/07/09 R 25/03/09 R.1 21/10/09 R.2 01/04/09 R.(A+B) 11/11/09 R.(A+B)
15/07/09 R 22/07/09 R 25/03/09 R.2 04/11/09 R.1 01/04/09 R.(C+D) 11/11/09 R.(C+D)
09/09/09 R 16/09/09 R 22/04/09 R.1 04/11/09 R.2 29/04/09 R.(A+B) 11/11/09 Esp(C+D)
23/09/09 R 30/09/09 R 22/04/09 R.2 18/11/09 R.1 29/04/09 R.(C+D) 25/11/09 R.(A+B)
07/10/09 R 14/10/09 R 06/05/09 R.1 18/11/09 R.2 13/05/09 R.(A+B) 25/11/09 R.(C+D)
21/10/09 R 11/11/09 R 06/05/09 R.2 16/12/09 R.1 13/05/09 R.(C+D) 25/11/09 Esp(A+B)
04/11/09 R 11/11/09 Esp. 20/05/09 R.1 16/12/09 R.2 27/05/09 R.(A+B) 09/12/09 R.(A+B)
18/11/09 R 25/11/09 R 20/05/09 R.2 29/12/09 R.1 27/05/09 R.(C+D) 09/12/09 R.(C+D)
16/12/09 R 15/12/09 R 03/06/09 R.1 29/12/09 R.2 10/06/09 R.(A+B) 09/12/09 Esp.(A+B)
29/12/09 R 21/12/09 R 10/06/09 R.(C+D) 21/12/09 R.(A+B)
24/06/09 R.(A+B) 21/12/09 R.(C+D)
24/06/09 R.(C+D) 21/12/09 Esp(A+B)
08/07/09 R.(A+B)
08/07/09 R.(C+D)
R: reactor
Esp: Espumas
A, B, C, D, R.1, R.2: diferentes líneas
3.3. Parámetros físico-químicos y variables operacionales
3.3.1 Parámetros físico-químicos
Los parámetros físico-químicos se determinaron siguiendo los procedimientos normalizados
(APHA, 2005). La fracción filtrada se ha obtenido a través de un filtro de lana de vidrio
(Whatman GF/C), con un tamaño nominal de poro de 1.2 μm, y la fracción soluble se obtuvo a
través de un filtro de 0.45 μm (Grady, 1989).
Las tablas 8 y 9 muestran los parámetros medidos en el licor mezcla y en el afluente al reactor
de las distintas EDAR. El índice Volumétrico de Fango (IVF) se calculó según el procedimiento
descrito por Jenkins et al. (2004), el cual se define como el volumen en ml ocupado por 1 g de
fango seco después de decantar media hora.

28
Tabla 8. Parámetros físico-químicos determinados en el licor mezcla
Parámetro Abreviatura Unidades
pH Phlm Ud
Sólidos suspendidos en el licor mezcla SSLM mg/l
Sólidos suspendidos volátiles del licor mezcla SSVLM mg/l
Índice Volumétrico del fango IVF ml/g
Nitrógeno total del licor mezcla NTSSVLM
mg/g SSVLM
Fósforo total del licor mezcla PTSSVLM
mg/g SSVLM
Temperatura T ºC
Tabla 9. Parámetros físico-químicos determinados en el afluente al reactor
Nitrógeno Total NT mg/l
Nitrógeno Amoniacal N-NH4 mg/l
Fósforo Total PT mg/l
Fósforo del ortofosfato PO4 mg/l
DBO5/NKT DBO5NKT ud
DBO5/PT DBOPT ud
Carga de carbohidratos CCARBO Kg/d
Proteínas Prote mg/l
Ácidos grasos volátiles AGV mg/l
3.3.2 Parámetros operacionales
Las variables operacionales determinadas durante la campaña de muestreo se muestran en la
Tabla 10.
Los valores de carga másica (CM) y tiempo de retención hidráulico en el reactor (TRHr) se
determinaron calculando el promedio de los tres días anteriores al muestreo del licor mezcla.
Los valores de oxígeno disuelto (OD) en el reactor fueron distribuidos en tres intervalos: <0,8,
0,8-2 y <2 ppm, expresados en porcentaje de tiempo (%), y por tanto representando
indirectamente la variabilidad de oxígeno a lo largo del periodo de muestreo.
La edad del fango (EF) determinada para cada depuradora fue aquella en la que el proceso se
encontraba más estable.
Tabla 10. Variables operacionales
Tiempo de retención hidráulico en reactor TRH3 Horas (h)
Carga másica promedio de los 3 días
anteriores al muestreo expresada en DBO5
CMdbo3 kgDBO5/kgSSVLM.d
Carga másica promedio de los 3 días
anteriores al muestreo expresada en DQOs
CMdqo3 kgDQOs/kgSSVLM.d
Edad de fango EF 7 Días
Oxígeno disuelto en reactor Obajo, Omed, Oalt %

29
3.4. Fijación y permeabilización de las muestras
El primer paso para realizar la técnica FISH es la fijación de las bacterias, para que su estructura
celular se mantenga rígida y estática y se conserve su morfología, favoreciendo la penetración
de las sondas. Para la permeabilización de las células se utilizan detergentes como el SDS
(sodio dodecil sulfato). Los reactivos utilizados para la fijación de las muestras son diferentes
según la pared celular de la bacteria (Gram positiva y Gram negativa). En el presente estudio,
puesto que las bacterias analizadas fueron Gram negativas la fijación se realizó con
paraformaldehido (PFA). Una vez fijadas las muestras, se conservan a -20ºC.
Los pasos y reactivos para la fijación y permeabilización se describen en detalle a continuación:
- Para bacterias Gram negativas:
 Lavar 1ml de flóculo con 500μl de tampón salino fosfato (PBS) 1X (7000
r.p.m durante 3 minutos).
 Añadir 3 vols de PFA (750 μl) a 1 vol (250 μl) de muestra y mantener a 4ºC
durante 1-3h (mínimo 1h-máximo 18h).
 Concentrar las células por centrifugación (7000 r.p.m durante 3 minutos) y
eliminar fijador.
 Lavar las células con PBS 1X (500 μl).
 Resuspender las células en PBS 1X (500 μl) y añadir etanol absoluto frío
(4ºC) (500 μl) .
 Guardar a -20ºC.
La Figura 13 describe los pasos a realizar para las bacterias Gram -.

30
Gram -
1 ml de muestra
Centrifugar 3 min 7000 rpm
Lavar 1000 µl PBS 1X
Resuspender 250 µl PBS 1X +
750 µl PFA durante 3h a 4ºC
Resuspender 500 µl PBS 1X
Resuspender 500 µl PBS 1X + 500 µl EtOH abs
Figura 13. Fijación de las muestras
3.5. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA marcadas con fluorófors (FISH)
3.5.1. Preparación de reactivos para FISH
En primer lugar se describe el protocolo de preparación de los reactivos necesarios en los
procesos de fijación, lavado e hibridación.
Paraformaldehido (Fijación)
Los pasos a seguir para preparara este reactivo son los siguientes, debiéndose realizar en
campana de extracción de humos:
 Calentar 65 ml de agua bidestilada hasta 60ºC.
 Añadir 4 g de paraformaldehido (PFA).
 Añadir 1 gota de una solución de NaOH 2M y agitar rápidamente hasta que la solución
se haya clarificado.
 Quitar de la fuente de calor y añadir 33 ml de PBS 3X.
 Ajustar el pH a 7,2 con HCl.
 Eliminar cualquier resto de cristales por filtración a través de 0,2 µm.
 Enfriar rápidamente a 4ºC y conservar a esta temperatura.

31
Tampón fosfato salino (para fijación)
 Concentración PBS 1X
- NaCl.............…..…..7,60 g
- NaH2PO4∙H2O....... 1,38 g
- NaH2PO4∙H2O....... 1,78 g
- Agua destilada.......1000 mL
- pH 7,2
 Concentración PBS 3X
- NaCl.................... 22,8 g
- NaH2PO4∙H2O.... 4,1 g
- Na2HPO4∙H2O..... 5,3 g
- Agua destilada.... 1000 ml
- pH 7,2
- Preparación: Primero disolver los fosfatos y luego el cloruro sódico.
- Esterilizar por filtración 0,45 µm ó 0,2 µm y conservar a 4ºC.
Solución de gelatina (preparación de portaobjetos)
- Gelatina.................................... 0,1%
- Sulfato potasico cromato ........ 0,01% (Sigma ref. C-5926, 12H20)
- Calentar previamente el agua destilada hasta 60ºC en un baño.
- Fundir la gelatina (100 mg 0,1% + 10 mg sal de cromato 0,01%) en 100 ml de agua
destilada en un vaso de precipitados, homogenizando la muestra agitando con una
varilla.
- Enfriar a 50ºC para sumergir los portas.
Solución de limpieza de portaobjetos (preparación de portaobjetos)
Etanol con 10% KOH (reactivo de limpieza).
Etanol (para deshidratación)
- 50%
- 80%
- 100%

32
Cloruro sódico 5M (tampón de hibridación y tampón de lavado)
- Cloruro sódico.......... 292.2 g
- Agua destilada.......... 1000 ml
- Disolver el NaCl en 800 ml de agua destilada y ajustar el volumen hasta 1 litro.
- Distribuir en alícuota.
- Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y por filtración.
EDTA 0,5M (cuando la concentración de formamida es mayor o igual a 20%)
- EDTA 2H2O.....................186,1 g
- Agua destilada................ hasta 1000 mL
- Preparación: pesar el EDTA y añadir a 800 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 8,0 con
NaOH (el reactivo no se disuelve hasta ajustar el pH a 8,0). Completar hasta 1000 mL
con agua destilada.
- Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y por filtración.
Tris-HCl pH 8.0 (tampón de hibridación y tampón de lavado)
- Tris Base ........................ 121,1 g
- H-Cl.................................. 42 ml de HCl concentrado
- Agua destilada................ hasta 1000 ml
- Preparación: pesar el Tris y añadir a 800 ml de agua destilada. Añadir 42 ml de HCl
concentrado y completar hasta 1000 ml con agua destilada.
- Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y filtración.
SDS 10% (para tampón de hibridación y tampón de lavado)
- SDS ........................ 10 g
- Agua destilada....... Hasta 100 ml
- Esterilizar por filtración.
Agua Milli-Q
Reactivo de montaje para evitar la pérdida de fluorescencia
Vectashield® (Vector Laboratories, USA).

33
3.5.2. Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón
Todos los portaobjetos utilizados en la técnica FISH se han de lavar y desengrasar. Previamente
a su empleo se les debe dar un baño en una solución de gelatina y de sulfato de potasio y
cromo para favorecer la adhesión de la muestra.
A continuación se detallan los pasos a seguir para el tratamiento de los portaobjetos:
 Lavar con solución de limpieza.
 Enjuagar con agua destilada dos veces
 Secar al aire (dejar escurrir todo 1 día, protegiendo del polvo ambiental cubriendo los
portas con papel aluminio).
 Cubrir con gelatina por inmersión en la solución de gelatina 0,1% con cromato sulfato
potásico 0,01% (preparada en el momento, temperatura 60ºC).
 Secar al aire.
3.5.3. Aplicación de las muestras a los portaobjetos
La aplicación de las muestras a los portaobjetos se realiza de la siguiente forma:
 Poner un volumen entre 3 y 5 μl de muestra fijada al portaobjetos FISH. En este caso se
ha puesto un volumen de 4 μl en cada pocillo del portaobjetos.
 Secar al aire.
 Deshidratar en etanol 50% durante 3 minutos por inmersión.
 Secar al aire.
3.5.4. Sondas utilizadas
Las diferentes sondas utilizadas en las hibridaciones se muestran en la Tabla 11. Asimismo, se
especifica la secuencia de nucleótidos del extremo 5´al 3´ de las sondas y el porcentaje de
formamida óptimo a utilizar (%F).

34
Tabla 11. Sondas empleadas en la identificación de bacterias filamentosas
Sonda Secuencia (5´-3´) Especificidad %F Comentarios Referencia
HHY GCCTACCTCAACCTGATT
Haliscomenobacter
hydrossis
20-25
Wagner et al.
(1994)
SAP-309 TCTCAGTACCCGTGTGGG
Mayoría de
miembros de
Saprospiraceae
25
Tanto
filamentos como
células simples
Schauer and
Hahnn (2005)
EUB 338 I GCTGCCTCCCGTAGGAGT Bacteria 0-50 Amann (1990)
EUB 338 II GCAGCCACCCGTAGGTGT Planctomycetes 0-50 Daims et al (1999)
EUB 338 III GCTGCCACCCGTAGGTGT Verrumicrobiales 0-50 Daims et al (1999)
Las sondas HHY y SAP-309 fueron marcadas con el fluoróforo TAMRA (rodamina, cuya longitud
de onda de absorción es de 565nm y de emisión de 580nm, rojo).
3.5.5. Hibridación “in situ”
Los pasos a seguir y reactivos utilizados del proceso de hibridación se describen en detalle a
continuación:
 Preparar la solución de hibridación con formamida en un microtubo de 2 ml. La
cantidad de reactivos dependerá del porcentaje óptimo de formamida que a su vez
dependerá de la sonda utilizada (Tabla 12).
Tabla 12. Tampón de hibridación según porcentaje de formamida
Reactivo
% DE FORMAMIDA
10% 20% 25% 30% 35% 40% 45%
NaCl 5M 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl
HCl-Tris 1M 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl
Formamida 200 µl 400 µl 500 µl 600 µl 700 µl 800 µl 900 µl
H2O MiliQ 1398 µl 1198 µl 1098 µl 998 µl 898 µl 798 µl 698 µl
SDS 10% 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl
Volumen Final 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl
 Poner 9 µl de la solución de hibridación + 1µl de sonda en cada pocillo y repartir
homogéneamente por todo el campo para HHY. En caso de que junto con la sonda
se tengan que añadir sondas competidoras y/o facilitadoras se deberá hacer una
combinación de todos ellos con la sonda hasta alcanzar la cantidad de 1 µl. A partir
de la puesta en contacto con la sonda hay que evitar el contacto con la luz para
evitar la pérdida de fluorescencia del fluoróforo.
 Poner un trozo de papel de celulosa dentro de un tubo Falcon de 50 ml y echar
sobre el papel la solución de hibridación sin sonda que sobra, para crear una
atmósfera húmeda.
 Introducir el portaobjetos dentro del tubo Falcon de 50 ml en posición horizontal.
 Incubar a 46ºC durante al menos 1h 30 min.

35
 Preparar 50 ml de solución de lavado (precalentar a 48ºC) para eliminar el exceso
de sonda que no ha hibridado y la formamida de los portaobjetos (Tabla 13).
Tabla 13. Solución de lavado según porcentaje de formamida
Reactivo
% DE FORMAMIDA
10% 20% 25% 30% 35% 40% 45%
NaCl 5M 4500µl 2150 µl 1490 µl 1020 µl 700 µl 460 µl 300 µl
EDTA 0,5M - 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl
HCl-Tris 1M 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl
H2O MiliQ 44,45ml 46,3ml 47,94ml 47,43 µl 47,75ml 47,06 µl 48,15ml
SDS 10% 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl
Volumen Final 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml
 Sacar de la estufa y rápidamente lavar los portaobjetos e introducirlos dentro del tubo
con la solución de lavado. Para proteger los tubos de la luz, se forran con papel de
aluminio.
 Incubar en un baño a 48ºC durante 15-20 minutos.
 Lavar con agua MilliQ.
 Secar al aire en la oscuridad.
 Si no se observa al microscopio inmediatamente, guardar el porta a -20ºC.
3.6. Observación al microscopio de epifluorescencia
Una vez realizada la hibridación in situ con las sondas específicas se procede a la observación
con el microscopio y a la toma de imágenes.
Para observar las muestras con el microscopio de epifluorescencia se precisa utilizar un líquido
de montaje (Vectashield) que evita el deterioro y la pérdida de fluorescencia. Se vierten unas
gotas de este líquido en la zona central del portaobjetos y se coloca encima un cubreobjetos,
con ayuda de una punta se ejerce una pequeña presión sobre éste para que el líquido de
montaje se extienda de forma uniforme por toda la muestra. A continuación se observa el
pocillo a 600X con aceite de inmersión.
El microscopio utilizado para la observación de las muestras ha sido un Olimpus BX 50
equipado con condensador de campo claro, contraste de fases e interferencial de Nomarsky y
sistema de iluminación por epifluorescencia. Las fotografías en color se realizaron con una
cámara digital Olimpus DP 12 acoplada al microscopio con los filtros U-MWIB (Fluoresceína,
FAM) y U-MWIG (Rodamina, TAMRA).

36
3.7. Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos
La cuantificación de la población de filamentos se realizará de dos formas: siguiendo el criterio
subjetivo de Eikelboom y por medio del análisis de imagen con el programa Matlab 7.1.
3.7.1. Criterio subjetivo de Eikelboom (2000,2006)
Para la cuantificación de los microorganismos se realizó un barrido de todos los pocillos del
portaobjetos con el microscopio de epifluorescencia, una vez realizado el proceso de
hibridación in situ.
La densidad de organismos fue estimada según el criterio subjetivo propuesto por Eikelboom
(2000, 2006), que establece el índice de filamentos (IF) dentro de una escala ordinal del 0-5
(Tabla 14).
Tabla 14. Escala de valoración de organismos filamentosos
IF Abundancia Descripción
0 “Ninguno” Ningún filamento presente
1 “Pocos” Pocos filamentos y de forma ocasional en el flóculo
2 “Algunos” Filamentos en aproximadamente la mitad de los flóculos
3 “Comunes” Filamentos en todos los flóculos con baja densidad (1-5/flóculo)
4 “Muy comunes” Filamentos en todos los flóculos con densidad media (5-20/ flóculo)
5 “Abundantes” Filamentos en todos los flóculos con alta densidad (>20/flóculo)
En la Figura 14 se muestra la escala utilizada para valorar la abundancia de bacterias
filamentosas.
Figura 14. Criterio de valoración de abundancia de filamentos
Este índice se utilizó para cuantificar la abundancia de Haliscomenobacter Hydrossis utilizando
la sonda HHY en las 148 muestras correspondientes a las 4 depuradoras estudiadas.

37
3.7.2. Análisis de imagen con el programa Matlab 7.1
Para la cuantificación de los microorganismos de las muestras hibridadas de las 4 depuradoras
objeto de estudio con las sondas HHY y SAP-309, se observaron las muestras con microscopio
de fluorescencia, se capturaron las imágenes correspondientes y posteriormente fueron
procesadas por el software desarrolado por Borrás (2008).
Se realizaron fotos a unos 20 - 25 campos de cada pocillo; por cada campo se adquirieron dos
fotos: una correspondiente a las bacterias objeto de estudio (sonda específica) y otra de toda
la comunidad bacteriana (sonda EUBmix), y en ocasiones una tercera con el filtro de doble
banda que ayuda a diferenciar las falsas señales de la sonda de hibridación.
En total se realizaron 11.120 fotos aproximadamente, correspondientes a los 296 pocillos de
todas las muestras (148 pocillos por cada una de las dos sondas que dieron resultados
positivos). La toma de fotos de cada pocillo duró aproximadamente 20 minutos lo que dio un
total de 5.920 minutos, equivalentes a 99 horas empleadas en la toma de fotos.
Tras la captura de imágenes, éstas fueron tratadas con el programa Photoshop CS2 9.0, para la
eliminación de falsas señales de la sonda de hibridación, con el objeto de que la cuantificación
posterior fuera lo más precisa posible.
El análisis de imagen se realizó haciendo uso del software de cuantificación desarrollado por
Borrás (2008). Este software desarrollado para Matlab 7.1 descompone las imágenes digitales
tomadas en RBG a escala binaria para realizar el conteo de píxeles a partir del cual se
calcularán los porcentajes de la población de bacterias.
El algoritmo del programa permite con un simple ajuste eliminar las partes de la imagen que
no son de interés o que son falsos positivos mediante los parámetros Low_in y Gamma_in.
Con el primero se consigue eliminar la parte de la imagen que representa imagen de fondo
(background) y establece un valor de 0 a 1, por debajo del cual es un falso positivo (Borrás,
2008).
El parámetro Gamma_in representa la forma de la curva que describe la relación entre los
valores de intensidad de la imagen original y la nueva imagen. Cuando Gamma_in es menor a
1 la nueva imagen tendrá una intensidad más alta, es decir que será más brillante, si por el
contrario este parámetro es superior a 1 la nueva imagen será más oscura (Borrás, 2008).

38
Todas las imágenes capturadas de cada pocillo se introducen en el software de cuantificación
desarrollado por Borras, 2008, generando un archivo en Excel con los porcentajes de las áreas
ocupadas por las bacterias estudiadas, su desviación estándar, así como su error estándar de la
medida. Este error (incertidumbre) es calculado dividiendo la desviación estándar por la raíz
cuadrada de “n”, donde n es el número de campos examinados (Borrás, 2008).
En la Figura 15 se muestra el flujo de procesos para la cuantificación en el software
utilizado.
Figura 15. Flujo de procesos para la cuantificación de bacterias
3.8. Análisis estadístico
Para el análisis estadístico de las todas las variables medidas se utilizó el paquete informático
SPSS versión 19.0.

2014 - Identificación y cuantificación del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis formador de bulking mediante la técnica FISH y estudio de su relación con los parámetros operacionales y físico-químicos en EDAR de la Comunidad Valenciana.

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