2013 - Identificación con técnica FISH de bacterias filamentosas en MBR

IDENTIFICACIÓN CON TÉCNICA FISH DE
BACTERIAS FILAMENTOSAS EN UN
BIORREACTOR DE MEMBRANA DE AGUAS
RESIDUALES DOMÉSTICAS
TRABAJO FINAL DE MÁSTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL
Realizado por:
Marta Lledías Aparici
Dirigido por:
Dr. José Luis Alonso Molina
Dr. Gonzalo Cuesta Amat
VALENCIA, SEPTIEMBRE 2013

AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quisiera agradecer especialmente a mis tutores José Luis Alonso y
Gonzalo Cuesta su tutela, dedicación, inagotable paciencia y completa disponibilidad
durante la duración de este trabajo. Gracias también al Instituto de Ingeniería del Agua
y Medio Ambiente (IIAMA) por permitirme realizar con ellos este trabajo de
investigación.
Indiscutiblemente a Andrés Zornoza, infatigable investigador, por resolver mis dudas,
crearme otras y por estar siempre dispuesto a ayudarme.
A la EDAR Masía del Conde de Loriguilla, por facilitarnos los datos para la realización
de este trabajo.
A Inma, “Las Microbiólogas” y a todos los compañeros del laboratorio que han hecho
que cada día de trabajo mereciera la pena.
A Paulita, Vero, Alba y Clara por esos buenos ratos compartidos durante todo este
tiempo.
Y por supuesto a Chelo, Laura, Horacio, Verena, Javi y el pequeño Emilio, por estar
siempre ahí.
Gracias a todos.

5
ÍNDICE
1 INTRODUCCIÓN...........................................................................................................................15
1.1 LAS AGUAS RESIDUALES, IMPORTANCIA DE SU TRATAMIENTO ..................................................................15
1.2 TRATAMIENTO SECUNDARIO. EL PROCESO BIOLÓGICO Y LOS FANGOS ACTIVOS............................................16
1.3 EL FLÓCULO ..................................................................................................................................16
1.4 LOS REACTORES BIOLÓGICOS DE MEMBRANA (MBR) ............................................................................17
1.5 COMPOSICIÓN DE LA MICROBIOTA.....................................................................................................18
1.6 LA IMPORTANCIA DE LAS BACTERIAS FILAMENTOSAS..............................................................................19
1.6.1 Phylum Chloroflexi................................................................................................................22
Morfotipo 0803 .............................................................................................................................................24
Morfotipo 0914 .............................................................................................................................................25
Morfotipo 0092 .............................................................................................................................................27
1.6.2 Phylum Proteobacterias/Alphaproteobacteria.....................................................................28
Morfotipo Nostocoida limícola......................................................................................................................28
1.7 IDENTIFICACIÓN DE MORFOTIPOS FILAMENTOSOS .................................................................................29
1.7.1 Microscopía convencional ....................................................................................................29
1.7.2 Técnica FISH para identificación de bacterias filamentosas.................................................30
1.8 PARÁMETROS OPERACIONALES DEL PROCESO DE DEPURACIÓN.................................................................33
2 OBJETIVOS...................................................................................................................................36
3 MATERIAL Y MÉTODOS................................................................................................................39
3.1 TOMA DE MUESTRAS ......................................................................................................................39
3.1.1 EDAR Masía del Conde, Loriguilla.........................................................................................39
3.2 MUESTREO...................................................................................................................................41
3.3 PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS Y VARIABLES OPERACIONALES ................................................................41
3.4 HIBRIDACIÓN IN SITU CON SONDAS MARCADAS CON FLUORÓFOROS (FISH) ...............................................42
3.4.1 Preparación de reactivos para FISH......................................................................................42
3.4.2 Tratamiento de los portaobjetos cubiertos de Teflón...........................................................45
3.4.3 Fijación y permeabilización de las muestras.........................................................................46
3.4.4 Aplicación de las muestras a los portaobjetos......................................................................48
3.5 SONDAS UTILIZADAS .......................................................................................................................48
3.6 HIBRIDACIÓN IN SITU ......................................................................................................................50
3.7 OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO .......................................................................................................51
3.8 IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS FILAMENTOSOS ..............................................52
3.8.1 Técnica convencional............................................................................................................52
3.8.2 Técnica FISH..........................................................................................................................52

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3.9 ANÁLISIS ESTADÍSTICO.....................................................................................................................53
3.9.1 Tratamiento por ordenador..................................................................................................54
4 RESULTADOS ...............................................................................................................................58
4.1 CUANTIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS MORFOTIPOS FILAMENTOSOS..................................................58
4.1.1 Microscopía Convencional....................................................................................................58
4.1.2 Método molecular FISH ........................................................................................................60
4.2 ESTADÍSTICA .................................................................................................................................64
5 DISCUSIÓN ..................................................................................................................................69
5.1 TÉCNICAS EMPLEADAS DE IDENTIFICACIÓN...........................................................................................69
5.2 ABUNDANCIA DE LOS MORFOTIPOS FILAMENTOSOS...............................................................................69
5.3 ESTADÍSTICA .................................................................................................................................72
6 CONCLUSIONES ...........................................................................................................................75
7 BIBLIOGRAFÍA..............................................................................................................................78
8 ANEXOS.......................................................................................................................................90
8.1 COMUNICACIÓN DE ACEPTACIÓN BIOMICROWORLD 2013:...................................................................91

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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Árbol filogenético del phylum Chloroflexi basado en las secuencias del gen
16S rRNA de los clones aislados (Yoon et al., 2010)..................................................24
Figura 2. Árbol filogenético del morfotipo filamentoso 0803 basado en el análisis
comparativo de las secuencias del gen 16S rRNA (Kragelund et al., 2011)................25
Figura 3. Árbol filogenético del morfotipo 0914 basado en las secuencias del gen 16S
rRNA (Speirs et al., 2010)...........................................................................................26
rRNA (Speirs et al., 2009)...........................................................................................27
Figura 5. Esquema simplificado del proceso de hibridación in situ con sondas
marcadas con fluoróforos ...........................................................................................32
Figura 6. Diagrama del proceso..................................................................................40
Figura 7. Fijación de las muestras. .............................................................................47
Figura 8. Escala de valoración de la abundancia de bacterias filamentosas...............53
Figura 9. Abundancia de los morfotipos identificados por convencional......................60
Figura 10. Abundancia presentada por cada una de las sondas empleadas para la
identificación mediante FISH ......................................................................................62
Figura 11.Ordenación del biplot basado en el ACC de la matriz Especies/Parámetros
operacionales con un 28,35% de inercia. Dónde el Tipo 0092 (CFX223),
C.”Monilibacter batavus” (MC2-649), Thiothrix (G123T), Tipo 0914 (CFX67a),
Gammaproteobacterias (GAM42a). ............................................................................65
Figura 12.Ordenación del biplot basado en el ACC de la matriz
Especies/Características del afluente con un 25,54% de inercia. Dónde el Tipo 0092
(CFX223), C.”Monilibacter batavus” (MC2-649), Thiothrix (G123T), Tipo 0914
(CFX67a), Gammaproteobacterias (GAM42a)............................................................66

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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1.Posibles identidades filogenéticas de los morfotipos filamentosos.................20
Tabla 2. Fechas de muestreo .....................................................................................41
Tabla 3. Parámetros fisicoquímicos ............................................................................41
Tabla 4. Parámetros operacionales ............................................................................42
Tabla 5. Sondas empleadas en la identificación de las bacterias filamentosas...........48
Tabla 6. Solución de hibridación según porcentaje de formamida...............................50
Tabla 7.Solución de lavado según porcentaje de formamida ......................................51
Tabla 8. Escala de valoración de organismos filamentosos ........................................53
Tabla 9. Morfotipos identificados por métodos convencionales...................................58
Tabla 10. Sondas empleadas y abundancias..............................................................60
Tabla 11. Resumen estadístico...................................................................................64
Tabla 12. Presiones Transmembrana MBR ................................................................90

9
ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS
TRHr : Tiempo de retención hidráulico en reactor
CM : Carga másica
Fex: Fangos en exceso
SSLM: Sólidos Suspendidos del Licor Mezcla
SSVLM: Sólidos Suspendidos Volátiles del Licor Mezcla
%SSVLM: Porcentaje de Sólidos Suspendidos del Licor Mezcla
pH: Ph en afluente
DBO_afl: Demanda Biológica de Oxigeno en afluente
DQO_afl: Demanda Química de Oxigeno en afluente
NT_afl: Nitrógeno Total del afluente
Cond_afl: Conductividad del afluente
DQO_efl: Demanda Química de Oxigeno del efluente
DBO_efl: Demanda Biológica de Oxigeno del efluente
PT_efl:Fósforo Total del efluente
CPT: Carga de Fósforo Total
N_NH4_efl: Nitrógeno Amoniacal en efluente
N_NO3_efl: Nitrato del efluente
N_NO2_efl: Nitrito del efluente
NT_efl: Nitrógeno Total del efluente
CNT: Carga de Nitrógeno Total
NKT_efl: Nitrógeno Kjeldahl Total en el efluente
Turb_efl: Turbidez en el efluente
Rdbo: Rendimiento Demanda Biológica de Oxigeno
rDQO: Rendimiento Demanda Química de Oxigeno
rPT: Rendimiento de Fósforo Total
rNT: Rendimiento del Nitrógeno Total

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rNKT: Rendimiento de Nitrógeno Kjeldahl Total
EDAR: Estación Depuradora de aguas Residuales
MBR: Biorreactor de Membranas
FISH: Hibridación in situ con sondas fluorescentes
IF: Índice de abundancia de filamentos

11
RESUMEN
Estudios recientes sugieren que la concentración de bacterias filamentosas en los
biorreactores de membrana (MBR) debe ser controlada por sus efectos negativos
sobre el ensuciamiento de la membrana. Otros autores afirman que la elevada
presencia de bacterias filamentosas no afecta la calidad del efluente o la
permeabilidad de las membranas. La identificación de los filamentos basada en la
identificación morfológica puede ser ambigua, por lo cual se hace necesario emplear
métodos moleculares tales como la hibridación in situ (FISH) con sondas
fluorescentes de oligonucleótidos dirigidos a diferentes especies filamentosas son
necesarios para una identificación fiable. El objetivo del presente estudio fue
determinar la abundancia de bacterias filamentosas en muestras de fangos
precendentes de un MBR mediante FISH. En el análisis FISH se emplearon sondas
marcadas de ácidos nucelicos del gen16 rRNA, cubriendo phylum, clase, género y
especie. La abundancia de bacterias filamentosas en las 14 muestras de fango
activo se midió de acuerdo con la escala subjetiva de Eikelboom, donde las
observaciones se clasifican en una escala de 0 (ninguno) a 5 (crecimiento
abundante). Muchos filamentos estaban presentes en el 100% de las muestras, lo
que implica que el bulking sigue ocurriendo con frecuencia en las plantas con MBR
que tratan aguas residuales urbanas. En 14 (100%) de las muestras, se observaron
varias especies de filamentosas Chloroflexi (sonda GNSB941+CFX1223). Los
miembros de Chloroflexi, son responsables de la degradación de los productos
microbianos solubles (SMP) incluyendo carbohidratos y materiales celulares, lo que
reduce la suciedad potencial de la membrana. Se observó que mostraron ser
codominantes (IF>5) la población de Caldilinea (sonda caldi0678), el Tipo 0803
(sonda T0803-0654), el Tipo 0092 (sonda CFX197) y Candidatus “Monilibacter
batavus”. El Tipo 0914 (sonda CFX67a) mostró que sus filamentos eran comunes
(IF>3). El Tipo 0092 variante B (sonda CFX223) y Thiothrix (sonda G123T) se
observaron en 10 de las muestras (FI<3). La abundancia del Tipo 0041/0675,
Haliscomenobacter hydrossis (4 muestras con IF>2), y el Tipo 1851 (4 muestras con
IF>5) se estimó por microscopía convencional. No se detectó señal de fluorescencia
con las sondas TM7905 (Tipo 0041/0675), HHY (H. hydrossis), CHL1851 (Tipo
1851). El análisis canónico de correspondencia (ACC) se empleó para revelar las
relaciones entre la aparición de bacterias filamentosas, parámetros operacionales y
características del afluente. En el rango de estudio de la temperatura del reactor (Tr)
(10-28ºC), un aumento en la temperatura derivó en una mayor abundancia de

12
Thiothrix. Por el contrario, el Tipo 0092 y el Tipo 0914 mostraron una relación
negativa con Tr. El biplot del ACC, mostró una relación positiva entre la abundancia
de C. “M. batavus” y Thiothrix, la carga másica (CM) y los fangos en exceso (Fex).
En el afluente el aumento en la disponibilidad de C y N contribuyó positivamente al
cambio en la abundancia relativa de C.”M. batavus” y el Tipo 0092, mientras
Thiothrix y Tipo 0914 lo hicieron negativamente .El Tipo 0914 se relacionó
positivamente con el tiempo de retención hidráulico (TRH), al contrario que C. “M.
batavus” y Thiothrix cuya relación con TRH fue negativa.

M. Lledías Máster en Ingeniería Ambiental
15
1 INTRODUCCIÓN
1.1 Las aguas residuales, importancia de su tratamiento
El agua es un recurso finito y necesario para la vida, desde que el hombre ha ido
tomando conciencia de ello ha puesto en práctica técnicas para hacer un uso más
correcto del agua y preservar así la vida y el medio ambiente.
Dado que para la evolución del hombre es necesario el uso de los
recursos que nuestro planeta nos brinda, también es necesario evitar los daños
colaterales que derivan del mismo, como puede ser la desaparición de especies
vegetales y animales, la contaminación atmosférica o la contaminación de las aguas,
tema que nos ocupa.
El acceso al agua es un derecho y por tanto debe ser garantizado, sin
duda, es nuestra responsabilidad el hacerlo de manera sostenible. Así, vista la
facilidad con la que las actividades humanas contaminan el agua, se hizo
imprescindible encontrar la manera de minimizar esta contaminación y tratar de
“limpiar” esa agua. Según la Norma UNE-EN 1085, se entiende como agua residual
aquella constituida por cualquier combinación de descargas de actividades
domésticas, y de establecimientos industriales o comerciales, aguas de escorrentía
superficial y de cualquier agua de infiltración de alcantarillados. Con objeto de proteger
el medio ambiente y la salud humana se tratan las aguas residuales, para ello se
emplean generalmente Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales (EDAR) a las
cuales llega el agua procedente de las ciudades (aguas urbanas) y de las industrias
(aguas industriales), por medio del sistema de alcantarillado y de colectores; una vez
en la EDAR el agua es sometida a procesos físico-químicos y biológicos con el objeto
de que sus características al final del proceso sean lo más afines al medio que las va a
recibir.
Existe una legislación que regula qué características debe tener un agua
tras haber pasado por la EDAR, quedando establecidos los parámetros de eliminación
de contaminantes en forma de sólidos en suspensión, materia orgánica,
microorganismos patógenos, compuestos inorgánicos, metales pesados y nutrientes.
Es de vital importancia el llamado límite de vertido, que indica la cantidad máxima de
determinados compuestos que debe contener esa agua para poder salir de la EDAR y
considerar que esta depurada.

16
Generalmente las EDAR están compuestas por un tratamiento primario
(eliminación de sólidos), secundario (biológicos) y terciario (desinfección) (Catalán,
1997)
1.2 Tratamiento secundario. El proceso biológico y los fangos activos
El mecanismo más extendido para la eliminación de compuestos orgánicos en las
aguas residuales y en la mayoría de las industriales es la biodegradación. En la
depuración de aguas residuales existen diversos tratamientos biológicos, de los que
destacamos los de cultivo en suspensión y dentro del mismo el tratamiento de fangos
activos. En la actualidad se emplea con frecuencia este sistema de fangos activos, en
el cual nutrientes y otros componentes son eliminados por la acción de
microorganismos. Así los microorganismos emplean los contaminantes como fuente
de carbono y/o como fuente de energía para su crecimiento, transformándolos en
nueva biomasa, dióxido de carbono y otros compuestos inertes (Ferrer y Seco, 2007).
En las EDAR se han desarrollado esquemas de proceso con otros objetivos además
de la eliminación biológica de la materia orgánica, como son la nitrificación, la
desnitrificación y la eliminación del fósforo.
El proceso de fangos activos puede definirse como aquel tratamiento
biológico de las aguas residuales en el que una mezcla de agua residual y de fangos
activos es agitada y aireada, y posteriormente el fango activo se separa de las aguas
residuales depuradas y se devuelve al proceso (UNE-EN 1085).
1.3 El flóculo
Denominamos flóculo a la unidad estructural y funcional del fango activo compuesto
por microorganismos (bacterias formadoras de flóculo y bacterias filamentosas),
partículas orgánicas e inorgánicas del agua residual afluente y polímeros
extracelulares. El flóculo puede considerarse el resultado de la combinación de las
características biológicas y de las físicas. Ligado al flóculo se dan poblaciones de
microorganismos como protozoos, rotíferos y nematodos que dan lugar a un equilibrio
dinámico condicionado por la edad del fango, la composición del afluente, las variables
operacionales o la presencia de tóxicos entre otros. En el proceso de depuración de
aguas residuales la estructura y la actividad del flóculo son dos puntos imprescindibles
para que sea adecuado.

17
En el flóculo se distinguen dos niveles estructurales: la microestructura y
la macroestructura (Sezgin et al., 1978). La microestructura aparece debida los
procesos de agregación y biofloculación, dando lugar a la formación de flóculos
pequeños, esféricos, compactos y débiles. La macroestructura del flóculo está
originada por las bacterias filamentosas, éstas forman unas estructuras a modo de
esqueleto donde se fijan los flóculos, dando lugar a flóculos más fuertes, grandes y
resistentes a la agitación. Es de vital importancia que la proporción de bacterias
filamentosas del flóculo sea la adecuada, en caso contrario puede dar lugar a
episodios de bulking o flóculo “punta de alfiler”. Cuando la cantidad de filamentosas es
excesiva, éstas impiden el acercamiento de los flóculos, estando estos separados
tanto la compactación como la sedimentación se dificultan. Si, por el contrario, la
proporción de bacterias filamentosas es baja, los flóculos serán pequeños y débiles
pudiendo aparecer en el efluente.
1.4 Los reactores biológicos de membrana (MBR)
Un biorreactor de membrana (MBR) es un proceso de fangos activos donde la
biomasa se separa del agua tratada mediante filtración de membrana, que sustituye a
los clarificadores secundarios. Los procesos MBR son una mejora al proceso
convencional de fangos activos. La introducción de una membrana como unidad de
separación en estos últimos resuelve a priori el problema de la separación de la
biomasa causado por las bacterias filamentosas ya que quedan retenidas en ella.
Según Judd (2006) las ventajas adicionales son una menor producción de lodos que el
proceso de fangos activos y que necesita una menor superficie de terreno para su
construcción.
Como resultado del largo tiempo de retención celular, los MBR requieren
altas concentraciones de biomasa, esto significa que el sistema opera con carga
másica baja para poder reducir la generación de biomasa (Judd, 2006). Por otro lado
la alta concentración de biomasa dificulta la aireación (Krampe and Krauth., 2003).
Son estas características las que favorecen el desarrollo de las bacterias filamentosas
que siempre aparecen en altas concentraciones en los MBR, dando como resultado
episodios de bulking filamentoso y formación de espumas. Estudios recientes sugieren
que las concentraciones de bacterias filamentosas en MBR deben ser controladas por
sus efectos negativos en el ensuciamiento de las membranas, bioensuciamiento (You
and Sue., 2009; Meng et al., 2006), siendo este uno de los principales problemas y
que provoca un aumento de los costos operativos derivados de la limpieza de las

18
membranas y del necesario reemplazo de éstas cuando dejan de ser operativas (Lyko
et al., 2008; Khongnakorn et al., 2007). Con el aumento de la concentración de
bacterias filamentosas, aumenta también la concentración en el fango activo de las
sustancias poliméricas extracelulares (EPS) como resultado de la secreción bacteriana
y de los productos microbiológicos solubles (SPM) (Zhang et al., 2010; Pan et al.,
2010).
Estudios recientes muestran, que la densidad de bacterias filamentosas
no tienen un impacto significativo en el ensuciamiento de la membrana (Li et al., 2008)
y que los sistemas MBR cuyo fango presenta bulking muestran un mejor rendimiento
en la filtración y un ensuciamiento de membrana menor comparado con los MBR con
fangos normales (Wang et al., 2010).
1.5 Composición de la microbiota
La biomasa del fango activo está constituida por bacterias, protozoos, hongos,
rotíferos, algas y nematodos. En el proceso de depuración de aguas los
microorganismos juegan un papel fundamental.
En el fango activo, los microorganismos más abundantes son las
bacterias, que constituyen el 95% de la biomasa, participan principalmente en la
eliminación de materia orgánica por distintas vías y en la eliminación de nutrientes. Sin
las bacterias formadoras de flóculo y las bacterias filamentosas sería imposible la
sedimentación y la obtención de un efluente clarificado y de calidad.
Los protozoos son los siguientes en importancia, por su abundancia y su
aportación al equilibrio de la biomasa de la que constituyen el 5%. Este grupo protista
tiene como funciones principales la eliminación de patógenos y coliformes, el
clarificado del efluente y la biofloculación.
Los hongos no se consideran de importancia en el proceso de depuración
ya que aún cuando las condiciones les permiten proliferar, rara vez compiten con las
bacterias en la utilización de la materia orgánica disuelta.
Las algas proporcionan oxígeno a las bacterias para que éstas puedan
participar activamente en la eliminación de materia orgánica del agua residual en los
sistemas de depuración (Ferrer y Seco, 2007). La proliferación excesiva de algas
puede ocasionar graves problemas en las infraestructuras como atascos en las
conducciones.

19
La cadena trófica de los sistemas de fangos activos está encabezada por
los rotíferos y los nematodos, cuya función principal es depredar organismos
inferiores. Los rotíferos eliminan bacterias dispersas y contribuyen a la formación del
flóculo gracias a la secreción de mucus. Son indicadores de un buen funcionamiento
del proceso de depuración. La presencia de elevadas cantidades de rotíferos y
nematodos indica una edad del fango alta y por tanto cambios en la capacidad de
depuración del fango activo.
1.6 La importancia de las bacterias filamentosas
El papel de las bacterias filamentosas en algunos procesos de la EDAR aún no está
muy definido, pero en cambio su papel físico en la formación del flóculo, su
sedimentación y el foaming sin duda está bien documentado (Kragelund et al., 2007a,
2011; Miura et al., 2007). Las bacterias filamentosas están presentes en todos los
tipos de EDAR con procesos de fangos activos, son responsables de la mayoría de
problemas de bulking y foaming (Jenkins et al., 2004; Seviour and Nielsen, 2010). La
excesiva abundancia de estas bacterias puede ser problemática para la operación de
la planta y no existe una estrategia universal para limitar o prevenir este
comportamiento problemático (Eikelboom, 2000; Jenkins et al., 2004; Kragelund et al.,
2010).
Se han identificado más de 30 morfotipos filamentosos en EDAR de
aguas residuales urbanas (EIkelboom, 2000) y un número mayor ha sido detectado en
plantas que reciben agua de origen industrial (Eikelboom y Geurkink, 2002; Eikelboom,
2006).
Las bacterias filamentosas están involucradas en la degradación de la
materia orgánica, son por tanto un miembro más de la comunidad biológica de los
fangos activos y como tal deben considerarse.
En la actualidad es sabido que tan solo algunos morfotipos filamentosos
pueden ser identificados de forma fiable empleando manuales basados únicamente en
su morfología y microscopía. Esta condición queda restringida a Candidatus
‘M.parvicella’, Thiothrix quizás algunas Mycolata y S. natans, pero poco más. Además
un solo morfotipo filamentoso a menudo abarca varios organismos diferentes.(Seviour
y Nielsen, 2010).

20
Las posibles identidades filogenéticas de los morfotipos filamentosos se recogen en la
tabla1.
Tabla 1.Posibles identidades filogenéticas de los morfotipos filamentosos
Morfotipo Posible identidad filogenética Bibliografía
Haliscomenobacter
hydrossis
Haliscomenobacter hydrossis
(Bacteroidetes)
Otras especies del phylum Bacteroidetes
Especies dentro del phylum ‘Chloroflexi’
(Wagner et al., 1994a; Kindaichi et
al., 2004; Okabe et al., 2005;
Weller et al., 2000)
(Bjornsson et al., 2002; Kragelund
et al., 2007a)
Microthrix parvicella Candidatus ‘Microthrix parvicella’
(Actinobacteria)
Candidatus ‘Microthrix calida’
(Actinobacteria)
(Erhart et al l., 1997)
(Levantesi et al., 2006)
Nostocoida limícola
(morfotipos)
Candidatus ‘Nostocoida limicola’
(Actinobacteria)
Numerosas especies de Alphaproteobacteria,
p.e. Meganema Perideroedes
Especies dentro del phylum Firmicutes
Especies dentro del phylum Planctomycetes
Especies dentro del phylum Chloroflexi
Especies de Thiothrix
(Gammaproteobacteria)
(Blackall et al., 2000)
(Kragelund et al., 2005, 2006;
Levantesi et al., 2004)
(Liu et al., 2000)
(Liu et al., 2001)
(Schade et al., 2002)
(Kragelund et al., 2006; Levantesi
et al., 2004)
Nocardioformes/Myc
olata
Especies de Gordonia y G. amarae
(Actinobacteria)
Especies de Skermania y S.piniformis
(Actinobacteria)
Especies desconocidas
(Soddell, 1999)
(Soddell and Seviour, 1998)
(Kragelund et al., 2007a)
Thiothrix Especies de Thiothrix
Especies dentro del phylum ‘Chloroflexi’ sin
crecimiento adherido
(Kanagawa et al., 2000)

21
Tipo 0041/0675 Especies dentro del phylum ‘Chloroflexi’
Relacionadas con Curvibacter
(Betaproteobacteria)
Candidatas de la división TM7
(Thomsen et al., 2006b)
(Hugenholtz et al., 2001; Thomsen
et al., 2002)
Tipo 0092 Especies dentro del phylum Bacteroidetes
Haliscomenobacter hydrossis
‘Chloroflexi’
(Bradford et al., 1996)
(Speirs et al., 2009)
Tipo 021N Especies de Thiothrix
Candidatus “Meganema Perideroedes”
Alphaproteobacteria
Especies dentro del phylum Firmicutes
Especies dentro del phylum ‘Chloroflexi’
(Kanagawa et al.,2000)
(Levantesi et al., 2004; Thomsen et
al., 2006b)
(Liu et al., 2000)
(Blackall et al., 2000; Schade et al.,
2002)
Tipo 0803 Especies del phylum
Betaproteobacteria
Desconocidas
(Bradford et al., 1996)
Tipo 1701 Relacionadas con Curvibacter
Candidatas de la división TM7 (TM7)
Desconocidas
(Thomsen et al., 2006b; Thomsen
et al., 2002)
Tipo 1851 Kouleothrix aurantica (‘Chloroflexi’)
Especies dentro del phylum Chloroflexi
Relacionadas con Curvibacter
(Beer et al., 2002;Kohno et al.,
2002; Kragelund et al., 2007a)
(Bjornsson et al., 2002)
(Thomsen et al., 2006b)

22
1.6.1 Phylum Chloroflexi
Los organismos del phylum Chloroflexi, previamente conocidos como “bacterias
verdes no sulfúreas” (Woese et al., 1987; Garrity & Holt et al., 2001) fueron asociados
en un primer momento a hábitats extremos como ambientes hipersalinos (Nubel et al.,
2001) donde aparecían como organismos anóxicos fototrofos (Hanada et al., 2002;
Nubel et al., 2002). Posteriormente también se detectaron en los sedimentos
superficiales del fondo marino (Huber et al., 2006) y en el suelo húmedo de la tundra
alpina (Costello y Schmidt, 2006).
Además se ha comprobado que estas bacterias filamentosas son muy
abundantes tanto en EDAR de aguas residuales urbanas como de aguas residuales de
origen industrial por lo que se pueden prever cantidades elevadas de estos filamentos
en el proceso de depuración de fangos activos (Beer et al., 2002; Björnsson et al.,
2002; Kragelund et al., 2007; Speirs et al., 2009).
Los filamentos Chloroflexi pueden constituir hasta el 30% del biovolumen
total en las plantas de eliminación de nutrientes (Beer et al., 2006; Kong et al., 2008;
Morgan–Sagastume et al., 2008a; Nielsen et al., 2010c) y es a menudo el phylum de
organismos filamentosos más abundante. Este phylum, juega un papel importante en
la formación del flóculo (Kragelund et al., 2011) y en la aparición de episodios de
bulking de forma ocasional (Jenkins et al., 2004; Kragelund et al., 2006).
Dentro del phylum Chloroflexi se describieron cuatro clases bien
diferenciadas: Anaerolineae, Dehalococcoidetes, Chloroflexi y Thermomicrobia
(Hugenholz & Stackebrandt, 2004) siendo la más abundante en los fangos activos la
clase Anaerolineae (Hugenholtz et al., 1998; Sekiguchi et al., 1999; Björnsson et al.,
2002; Juretschko et al., 2002). Los filamentos bacterianos fototróficos termofílicos
fueron incluidos en la clase Chloroflexi: Chloroflexus (Pierson and Castenholz, 1974),
Oscillochloris (Gorlenko and Pivovarova, 1977) y Roseiflexus (Hanada et al., 2002).
Dentro de la clase Dehalococcoidetes se aislaron bacterias anaerobias con actividad
deshalogenasa en acuíferos contaminados por sustancias cloradas (Grostern &
Edwards, 2006). Los filamentos termofílicos pertenecían a la clase Thermomicrobia
(Oyaizu et al., 1987; Hensel et al., 1989). Recientemente se ha demostrado que la
subdivisión Anaerolineae comprende dos clases, Anaerolineae y Caldilineae, que
fueron aisladas de fango granular anaeróbico termofílico (Sekiguchi et al., 2003;
Yamada et al., 2006).

23
Estudios realizados en EDAR de origen municipal basados en la técnica
FISH para la cuantificación de bacterias filamentosas han demostrado que el 9-17%
del total de los filamentos del phylum Chloroflexi pertenecen al género Caldilinea
(Yoon et al., 2010). Estudios ecofisiológicos (Kindaichi et al., 2004; Okabe et al., 2005;
Kragelund et al., 2007; Miura et al., 2007; Miura& Okabe et al., 2008) revelan que el
phylum Choloflexi constituye un grupo de bacterias filamentosas especializadas
nutricionalmente consumidoras de carbohidratos, como glucosa y N-acetilglucosamina,
y aminoácidos. Algunos de los filamentos pueden consumir ácidos grasos de cadena
corta como piruvato y butirato pero nunca acetato (Kragelund et al., 2006; Nielsen et
al., 2009). Los filamentos del phylum Chloroflexi pueden ser considerados como
bacterias especializadas capaces de degradar macromoléculas complejas como
polisacáridos y proteínas (Nielsen et al., 2009). La incorporación de sustratos solubles
por parte de las bacterias filamentosas del phylum Chloroflexi solo es observable bajo
condiciones aerobias por lo que el metabolismo fermentativo observado en cultivos
puros probablemente no juega un papel importante en los fangos activos (Nielsen et
al., 2009).
La superficie de los filamentos pertenecientes a este phylum parece ser
más hidrofílica que la superficie de otras bacterias filamentosas del fango activo
(Kragelund et al., 2006, Nielsen et al., 2009). Los filamentos suelen contener pequeños
gránulos de polihidroxialcanoatos y se ha detectado actividad exoenzimática
(Kragelund et al., 2007a).
El phylum Choloflexi engloba muchos tipos de morfotipos Eikelboom
como el tipo 0092, desclasificada del phylum Bacteriodetes y del género
Flavobacterium, (Speirs et al., 2009), el tipo 1851 (Beer et al., 2002; Kragelund et al.,
2007), probablemente también el tipo 0041 con crecimiento epifítico (Kragelund et al.,
2007) y el morfotipo 0581 desclasificado del phylum Actinobacteria (Zornoza et al.,
2006). El árbol filogenético del phylum Chloroflexi se muestra en la figura1.

24
Figura 1. Árbol filogenético del phylum Chloroflexi basado en las secuencias del gen
16S rRNA de los clones aislados (Yoon et al., 2010).
Morfotipo 0803
El morfotipo Eikelboom 0803 ha sido asociado al género Caldilinea (Kragelund et al.,
2011) dentro del phylum Chloroflexi y no en la subdivisión Rubrivivax de las
betaproteobacterias como se había considerado previamente (Bradford et al., 1996). El
tipo 0803 constituye alrededor del 20% del total de la población del phylum Chloroflexi
y junto con el morfotipo 0092 constituyen la fracción dominante de dicho phylum
(Kragelund et al., 2011).
El morfotipo 0803 se localiza principalmente en la superficie de los
flóculos, donde es posible observarlos asociados a granos de arena (Eikelboom, 2000;

25
Jenkins et al., 2004). En estudios posteriores se observó que no siempre se dan estas
circunstancias, y no están asociados a granos de arena ni localizados en la superficie
del flóculo (Kragelund et al., 2011).
Los filamentos del morfotipo 0803 se caracterizan por ser cortos (<50 μm)
y rectos con un diámetro de 0,8 – 1,1 μm y pueden aparecer asociados a partículas
inorgánicas y formando rosetas. Son normalmente filamentos Gram negativos pero
ocasionalmente la tinción Gram puede ser variable. Con la tinción Neisser los
filamentos aparecen como negativos aunque ocasionalmente aparecen con gránulos
positivos (Kragelund et al., 2011). Este morfotipo filamentoso consume glucosa con
oxígeno, nitrito y nitrato como aceptores de electrones, por lo que podría ser
desnitrificante. Además podría jugar un papel importante en la conversión de
macromoléculas por la elevada expresión exonzimática observada (Kragelund et al.,
2011). El árbol filogenético del morfotipo filamentoso 0803 basado en las
secuencias del gen 16S rRNA se muestra en la figura 2.
Figura 2. Árbol filogenético del morfotipo filamentoso 0803 basado en el análisis
comparativo de las secuencias del gen 16S rRNA (Kragelund et al., 2011).
Morfotipo 0914
El morfotipo filamentoso Eikelboom 0914 es identificado como un miembro del phylum
Chloroflexi del subgrupo 1 (Speirs et al., 2010). El morfotipo es descrito como un
filamento con un diámetro de 1-1,2 μm y una longitud inferior a 50 μm que se localiza

26
tanto dentro como fuera del flóculo. Son bacterias Gram negativas y responden de
forma negativa a la tinción Neisser. No presenta vaina ni crecimiento epifítico (Jenkins
et al., 2004). Los morfotipos filamentosos 0803 y 0914 se consideraban a nivel
convencional dos formas de un mismo organismo (Eikelboom et al., 2000), cuando un
morfotipo 0803 aparecía, el tipo 0914 desaparecía y viceversa, por lo que se creía que
eran dos formas complementarias del mismo filamento bacteriano. Posteriormente el
morfotipo 0803 y el morfotipo 0914 fueron considerados dos organismos diferentes
siendo la clave identificativa la presencia de gránulos irregulares de azufre in situ en el
morfotipo 0914 (Jenkins et al., 2004). El árbol filogenético basado en las secuencias
genéticas del 16S rRNA del morfotipo 0914 y otros miembros del phylum Chloroflexi se
muestra en la figura 3.
rRNA (Speirs et al., 2010).

27
Morfotipo 0092
El morfotipo 0092 ha sido desclasificado del phylum Bacteriodetes (Wagner et al.,
1994) para introducirlo dentro del phylum Chloroflexi (Speirs et al., 2009).
Este morfotipo aparece en plantas de fangos activos de todo el mundo, ha
sido asociado a edades de fango elevadas (> 15 días) y a sistemas de eliminación de
fosfatos (EBPR) donde la biomasa es reciclada repetidamente entre la zona anaerobia
y la zona aerobia (Jenkins et al., 2004).
El morfotipo 0092 ha sido descrito en un amplio rango de condiciones, se
ha comprobado la presencia de esta bacteria filamentosa en condiciones aerobias,
anaerobias y anóxicas (Wanner et al., 1989). Son descritos como filamentos cortos
que se extienden desde el flóculo con un diámetro entre 0,8 y 1 μm. Presentan
respuesta negativa a la tinción Gram y positiva a la tinción Neisser (Jenkins et al.,
2004). Se han identificado dos variantes (A y B) del morfotipo filamentoso 0092
diferenciándose en el diámetro del filamento (Speirs et al., 2009). El árbol filogenético
basado en las secuencias genéticas del 16S rRNA del morfotipo 0092 y otros
representantes del phylum Chloroflexi se muestra en la figura 4.
rRNA (Speirs et al., 2009)

28
1.6.2 Phylum Proteobacterias/Alphaproteobacteria
Las filamentosas alfaproteobacterias han sido observadas y descritas en numerosos
estudios previos al año 2006, en los cuales estas bacterias han mostrado ser muy
comunes en EDAR de aguas industriales y a menudo causantes de serios problemas
de bulking (Dionisi et al., 2002; Eikelboom and Geurkink, 2002; Levantesi et al., 2004;
Thomsen et al., 2006a; Van der Waarde et al., 2002), y basandose en la secuencia del
gen 16S rRNA de seis muestras de bacterias no cultivadas y una especie aislada, se
han descrito como constituyendo 7 grupos filogenéticos relativamente distantes:
‘Candidatus Combothrix italica’, ‘Candidatus Catenimonas italica’, ‘Candidatus
Spheronema italicum’, ‘Candidatus Monilibacter batavus’, ‘Candidatus Alysiomicrobium
bavaricum’ (Levantesi et al., 2004) y Meganema perideroedes (Thomsen et al., 2006a).
Todas las especies tienen una morfología parecida al Tipo 021N, o a
Nostocoida limícola, y pueden ser identificadas a nivel de especie con la aplicación de
la técnica FISH. Respecto a la fisiología de las distintas especies no se tiene
demasiado conocimiento, por ello no se han desarrollado aún estrategias de control
para combatir este grupo de filamentosas (Kragelund et al., 2006)
Kragelund et al (2006), dividieron las especies en dos grupos de fisiología similar
según los datos del sustrato utilizado. El Grupo 1 compuesto por “Ca. Monilibacter
batavus” y “Ca. Sphaeronema italicum”, que principalmente utilizan ácidos grasos de
cadena corta. El Grupo 2 “Ca. Alysiomicrobium bavaricum”, “Ca. Alysiosphaera
europaea” y Meganema perideroedes, es más versátil y capaz de utilizar
carbohidratos, aminoácidos y etanol además de ácidos grasos de de cadena corta.
Morfotipo Nostocoida limícola
Existen tres grupos diferenciados de Nostocoida limícola, I, II y III, que difieren en su
diámetro celular (Eikelboom and Van Buijsen, 1983). Tras una secuenciación del gen
16s rRNA de los tres grupos de Nostocoida limícola, cada grupo mostró pertenecer a
un phylum bacteriano distinto (Blackall et al., 2000, Liu, J.R. et al., 2000, Liu, W.T. et
al., 2000). La diversidad filogenética entre los miembros del morfotipo N. limícola II es
la más extensa, conteniendo miembros de los phylum Actinobacterias (Blackall et al.,
2000), Chloroflexi (Shade et al., 2002) y la clase Alfaaproteobacteria (Levantesi et al.,
2004). El morfotipo N. limícola perteneciente a las alfaproteobacterias, que
previamente se mostró predominante en plantas industriales (Kragelund et al., 2006,
Kragelund et al., 2005, Levantesi et al., 2004, Snaidr et al., 2002, Thomsen et al.,

29
2006a) y poco común en las EDAR de aguas domésticas (Seviour et al., 2002)
contiene 6 clusters filogenéticos alejados relacionados. Incluyendo cinco especies no
cultivadas Candidatus ‘Combothrix italica’, Candidatus ‘Alysiophaera europaea’,
Candidatus. ‘Monilibacter batavus’ y Candidatus ‘Sphaeronema italicum’ (Levantesi et
al., 2004).
Se describe con formas desde esférica a ovoide y discoidal, con un
tamaño entre 1,0-1,4 μm., sus septos son generalmente visibles. Se localizan
extendiéndose desde el flóculo al licor mezcla. Responde a la tinción de Gram de
forma variable, también es variable su reacción a la tinción de Neisser pero tiñe todo el
filamento.
1.7 Identificación de morfotipos filamentosos
1.7.1 Microscopía convencional
Los métodos clásicos tienen su base en la observación de la apariencia microscópica
de los microorganismos para determinar las características morfológicas, así como el
uso de tinciones que ponen de manifiesto algunas de las características identificativas
de los microorganismos. La nomenclatura basada en la observación microscópica de
las características morfológicas, la estableció Eikelboom (1975) y otros autores
(Jenkins et al., 2004) la actualizaron posteriormente.
La clasificación de Eikelboom (1975) y de Jenkins et al.,2004, se basa en
los siguientes caracteres morfológicos: presencia o ausencia de ramificaciones,
movilidad, forma del filamento (irregular, curvo, enrollado, etc.), color, ubicación
respecto al flóculo, existencia de crecimiento epifítico, vaina, septos, constricciones
celulares, dimensiones celulares, dimensiones del filamento, forma celular ( cuadrada,
rectangular, ovalada, etc.), presencia de biopolímeros de azufre y gránulos de
polifosfato, reacciones de tinción (Gram y Neisser) y formación de rosetas y gonidios.
Los métodos convencionales son de gran ayuda para la observación de
microorganismos en EDAR de aguas residuales, sin embargo la información que
aportan sobre la identidad exacta de los filamentos observados no es fiable, razón por
la cual se designa a los filamento bajo los términos “tipo” o “morfotipo” en vez de
especie. Actualmente se sabe que un morfotipo específico puede incluir varias
especies y que varios morfotipos puedan representar una sola especie.

30
El uso de técnicas convencionales para la identificación y cuantificación
conlleva algunas dificultades:
 Una misma especie puede mostrar polimorfismos o diferentes especies parecer
iguales.
 Aquellos filamentos ubicados en el interior del flóculo son difíciles de identificar
y cuantificar.
 Estructura abierta de los flóculos.
 Elevada población de filamentos.
 Esta metodología es subjetiva y depende del nivel de entrenamiento y
experiencia del que la lleva a término.
Los métodos clásicos son un complemento de las técnicas moleculares,
proporcionando a éstas datos de interés sobre las características del flóculo y la
presencia de protozoos y otros microorganismos asociados. A pesar de considerar la
microscopía convencional como una herramienta imprescindible en el control del
proceso de depuración, a nivel microbiológico tan sólo un número reducido de
bacterias filamentosas han podido ser identificadas según sus características
morfológicas, así en la actualidad la identificación de las bacterias del fango activo no
se puede limitar únicamente al método convencional (Nielsen et al., 2009).
1.7.2 Técnica FISH para identificación de bacterias filamentosas
Para la identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos, se emplean
los métodos moleculares (Blackall, 1994; Bradford et al., 1996; Erhart et al., 1997;
Kanagawa et al., 2000; Wagner et al., 1994), en concreto la técnica FISH ha sido
especialmente productiva para conseguir dicho objetivo (Nielsen et al., 2009)
La mayoría de los morfotipos filamentosos de Eikelboom reciben una
identificación alfanumérica, es decir no han sido nombrados siguiendo las reglas del
Código Internacional de Nomenclatura, se debe principalmente a que muchos de ellos
muestran una morfología celular diferente a la que presentan en los fangos activos. El
empleo de técnicas moleculares de caracterización y secuenciación del gen 16S rDNA

31
que empieza a distinguir la posición taxonómica de los morfotipos de bacterias
filamentosas, está cambiando esta situación.
La hibridación in situ con sondas u oligonucleótidos 16S rDNA/23S rDNA
marcadas con fluoróforos (FISH) ha sido una técnica común para la detección e
identificación de microorganismos en diferentes ambientes microbianos, en los que se
incluyen comunidades de bacterias como las presentes en los sistemas biológicos de
depuración con fangos activos (Amann et al., 1995).
Esta técnica basada en la hibridación directa de la bacteria diana con una
sonda complementaria de una región del gen 16S o 23S rRNA. El elevado número de
moléculas de rRNA (103
-105
) es una ventaja en la aplicación de la técnica de
hibridación al aumentar su sensibilidad (Amann, 1994). Una secuencia de DNA
(sonda) puede unirse con una secuencia de RNA complementaria (16S rRNA o 23S
rRNA) y se produce un híbrido DNA: RNA. La sonda está marcada con una molécula
fluorescente de tal forma que los híbridos formados se pueden detectar fácilmente con
un microscopio de epifluorescencia.
La especificidad de las sondas puede ser ajustada a diferentes niveles
taxonómicos como son dominio, phylum, clase, familia, género o especie para la
identificación de las bacterias presentes en el fango activo. Las sondas deben ser lo
suficientemente específicas para unirse únicamente a la bacteria que se quiere
identificar. Para asegurar la especificidad, los dos parámetros determinantes son la
temperatura y la concentración de formamida en el tampón de hibridación (Alonso et
al., 2009). La formamida hace que disminuya la temperatura de unión de las sondas
mediante el debilitamiento de los puentes de hidrógeno, es decir, disminuye la
temperatura de fusión de los híbridos DNA: RNA en 0,72ºC por cada 1% de formamida
utilizada y permite realizar la hibridación a 46ºC (Alonso et al., 2009).
La sonda que se utiliza en la técnica FISH está formada por una pequeña
secuencia de nucleótidos de cadena sencilla, en cuyo extremo, normalmente 5’, se
marca un fluoróforo, como puede ser rodamina o fluoresceína. Un esquema
simplificado del proceso de hibridación in situ con sondas marcadas con fluoroforos se
puede ver en la figura 5

32
Figura 5. Esquema simplificado del proceso de hibridación in situ con sondas marcadas
con fluoróforos
El empleo de la técnica de hibridación con sondas marcadas con
fluoróforos in situ (FISH), presenta una serie de ventajas frente a otras técnicas de
detección e identificación, son:
 Permite detectar varias especies o géneros en una misma muestra, utilizando
una sonda para cada especie, género o grupo, marcada con fluoróforos
distintos.
 No parecen existir sustancias inhibidoras que interfieran en la reacción de
hibridación.
 Puede determinar directamente la abundancia de los microorganismos
detectados.
 No necesita cultivo previo de la bacteria ni extracción de los ácidos nucleicos
(Nielsen et al., 2009).
 Las preparaciones pueden conservarse durante mucho tiempo (años).
 Se mantiene la morfología de la célula (Nielsen et al., 2009).
A pesar de todas las ventajas citadas de la técnica molecular FISH, se
aprecian en ella algunas limitaciones:
 La identificación a través de FISH está supeditada a la disponibilidad de la
sonda requerida.
 Se han desarrollado sondas para varias especies filamentosas importantes,
pero aún no para todas las especies que puedan aparecer en el fango activo.

33
 Podría afectar a las características morfológicas de las especies filamentosas.
 Las bacterias filamentosas con bajo contenido ribosomal no dan una señal
fluorescente clara con la sonda.
 Puede ocurrir que una sonda específica para una especie de una señal
fluorescente con otras especies, si sus composiciones de rRNA son muy
parecidas. Tales resultados positivos falsos pueden ser prevenidos mediante la
aplicación de sondas competidoras.
 No aporta información sobre características importantes del fango, tales como
la población de protozoos o las características del flóculo.
1.8 Parámetros operacionales del proceso de depuración
Los parámetros más utilizados para el control de las depuradoras de aguas residuales
son la carga másica (CM) y la edad del fango (EF) (Zornoza et al., 2011).
La carga másica es un parámetro que trata de representar la relación
existente entre la carga orgánica alimentada al reactor y los microorganismos
presentes en él. Dada la dificultad de cuantificar los microorganismos presentes, suele
definirse como la relación entre la DBO5 y los sólidos suspendidos volátiles del licor
mezcla diarios en el reactor, o incluso puede definirse relacionando dicha DBO con los
sólidos suspendidos totales del licor mezcla, por ello es muy importante al hablar de
carga másica establecer a qué concentración de sólidos está referida (Ferrer y Seco,
2007).
La edad del fango relaciona la masa de fango en el reactor con la masa
de fangos eliminada diariamente, por lo que depende principalmente del régimen de
purgas (Zornoza et al., 2011).
Para la determinación de ambos parámetros es necesario tener en cuenta
la inercia del sistema de fangos activos, es decir, la inercia de las poblaciones
microbianas y la estructura flocular (Zornoza et al., 2011).
Ambos parámetros han estado relacionados de forma proporcional e
inversa, pero recientemente se ha demostrado que esta relación no siempre tiene
lugar EDAR a escala real (Zornoza et al., 2011).

36
2 OBJETIVOS
El control efectivo de muchos de los problemas que aparecen en el proceso de
depuración se basa en la identificación de los microorganismos que lo causan y en la
modificación de las condiciones que favorecen su crecimiento. El crecimiento excesivo
de bacterias filamentosas puede interferir en el funcionamiento correcto del sistema de
fangos activos produciendo problemas como la sedimentación deficiente del fango o
la formación de espumas.
El principal objetivo de este trabajo es la identificación y cuantificación de
los morfotipos de bacterias filamentosas presentes en la EDAR de Loriguilla
(Valencia), cuyo sistema de depuración se basa en el uso de biorreactores de
membrana (MBR).
Se plantean los siguientes objetivos:
 Aplicar los métodos de microscopía convencional para la identificación de
morfotipos de bacterias filamentosas presentes en muestras procedentes de
una depuradora con sistema MBR de la Comunidad Valenciana (Loriguilla),
como paso previo a la aplicación de la técnica FISH facilitando la elección de
las sondas más adecuadas.
 Aplicar la técnica FISH a las muestras para determinar la presencia de
bacterias filamentosas e identificarlas.
 Determinar la abundancia de las bacterias filamentosas detectadas por FISH
mediante la aplicación de la escala subjetiva de Eikelboom
 Estudiar las posibles relaciones existentes entre los parámetros operacionales
y físico-químicos de la EDAR y la abundancia de las bacterias filamentosas
identificadas.

39
3 MATERIAL Y MÉTODOS
3.1 Toma de muestras
Se tomaron muestras del licor mezcla de la EDAR de Loriguilla (Valencia) con una
frecuencia quincenal durante un año. A continuación se muestra el esquema de
funcionamiento y algunos datos de interés.
3.1.1 EDAR Masía del Conde, Loriguilla
La EDAR de la Masía del Conde está situada en Loriguilla, municipio de la comarca
del Camp de Turia de Valencia. Actualmente da servicio únicamente al municipio de
Loriguilla. Las obras de ampliación de esta ·EDAR finalizaron en el año 2008, está
diseñada para tratar un caudal medio de 1.000 m3/día y un caudal punta de 100 m3/h.
La tipología de las aguas tratadas es urbana, aunque también da servicio a los
desarrollos industriales del municipio. El sistema consiste en (Figura 6) un tratamiento
biológico mediante aireación prolongada con fangos activados, en el que se produce
una nitrificación-desnitrificación, y un sistema de clarificación con membranas de
microfiltración (MBR), gracias al cual se consigue alcanzar los niveles de depuración
que permiten la reutilización de las aguas para riego de parques y jardines; esperando
un efluente con DBO5<10 mg/l; SS<5mg/l y turbidez< 2 NTU.
Para el tratamiento de los fangos se dispone de un sistema de
espesamiento y otro de deshidratación mediante centrífuga. Se cuenta también con un
sistema de desodorización para la línea de fangos.
Ficha técnica:
LINEA DE AGUA
PRETRATAMIENTO
TRATAMIENTO
SECUNDARIO
TRATAMIENTO
TERCIARIO
DESINFECCIÓN
Tamizado Aireación prolongada Ultrafiltración Ultravioletas
Desarenador
Eliminación de
nitrógeno
Desengrasador Eliminación de fósforo
LÍNEA DE FANGO
ESPESADOR DESHIDRATACIÓN
Gravedad Centrífuga

40
Figura 6. Diagrama del proceso
Sus características son:
Caudal Nominal Medio (de proyecto): 1000 m3
/día
Caudal diario: 300 m3
Población servida: 2.041 he
Caudal Punto horario: 100 m3
/h
Sistema de Pre-tratamiento Compacto
Tanque Anóxico en HA 215 m3
Reactor Biológico en HA 460 m3
Reactor Biológico de Membranas, MBR
Espesamiento de fangos en HA 75 m3
Deshidratación de fangos, centrífuga
Desinfección UV y conexión sistema de riego
Potencia total instalada 189 (kW)
Coordenadas UTM (ETRS 89 huso 30)
X: 709875
Y:4373567
Z:96

41
3.2 Muestreo
El muestreo se realizó siempre en el mismo lugar a la salida del reactor biológico. Se
tomaron 1500ml de licor mezcla con un recipiente de plástico, de estas muestras se
tomaron alícuotas para su fijación que se realizó antes de las 24 horas. Los muestreos
se realizaron cada quince días durante el año 2012. El muestreo comenzó en febrero y
finalizó en noviembre de 2012 (tabla 2). Las muestras fueron de carácter simple
realizadas de forma puntual.
Para el transporte y conservación de las muestras fue necesario mantener
las condiciones aerobias de la muestra, lo cual se logró con la cámara de aire que
queda sobre el licor mezcla
Tabla 2. Fechas de muestreo
FECHA Nº MUESTRA
07/02/2012 M1
14/02/2012 M2
28/02/2012 M3
13/03/2012 M4
02/04/2012 M5
26/04/2012 M6
08/05/2012 M7
22/05/2012 M8
05/06/2012 M9
28/06/2012 M10
10/07/2012 M11
26/09/2012 M12
03/10/2012 M13
20/11/2012 M14
3.3 Parámetros físico-químicos y variables operacionales
Los parámetros físico-químicos se determinaron siguiendo los procedimientos
normalizados (APHA, 2005). Los parámetros fisicoquímicos medidos en cada una de
las muestras, se recogen en la tabla X
Tabla 3. Parámetros fisicoquímicos
Parámetros Unidades Abreviatura
LICOR MEZCLA
Sólidos Suspendidos del Licor Mezcla mg l-1 SSLM
Sólidos Suspendidos Volátiles del Licor Mezcla mg l-1 SSVLM
Porcentaje de Sólidos Suspendidos del Licor Mezcla % %SSVLM

42
AFLUENTE
pH en afluente Ud. pH
Demanda Biológica de Oxigeno en afluente mg l-1 DBO_afl
Demanda Química de Oxigeno en afluente mg l-1 DQO_afl
Nitrógeno Total del afluente mg l-1 NT_afl
Conductividad del afluente µS/cm Cond_afl
EFLUENTE
Demanda Química de Oxigeno del efluente mg l-1 DQO_efl
Demanda Biológica de Oxigeno del efluente mg l-1 DBO_efl
Fósforo Total del efluente mg P l-1 PT_efl
Carga de Fósforo Total g PT / Kg SSVLM. d CPT
Nitrógeno Amoniacal en efluente mg N l-1 N_NH4_efl
Nitrato del efluente mg N l-1 N_NO3_efl
Nitrito del efluente mg N l-1 N_NO2_efl
Nitrógeno Total del efluente mg l-1 NT_efl
Carga de Nitrógeno Total g NT / Kg SSVLM. d CNT
Nitrógeno Kjeldahl Total en el efluente mg l-1 NKT_efl
Turbidez en el efluente ntu Turb_efl
RENDIMIENTOS
Rendimiento Demanda Biológica de Oxigeno % rDBO
Rendimiento Demanda Química de Oxigeno % rDQO_
Rendimiento de Fósforo Total % rPT
Rendimiento del Nitrógeno Total % rNT
Rendimiento de Nitrógeno Kjeldahl Total % rNKT
Las variables operacionales determinadas durante la campaña de muestreo se
recogen en la tabla 4.
Tabla 4. Parámetros operacionales
Parámetros Unidades Abreviatura
Tiempo de retención hidráulico en el reactor Horas (h) TRHr
Carga másica kgDBO5/kgSSVLM.d CM
Fangos en exceso Kg.d Fex
Temperatura del reactor °C Tr
3.4 Hibridación in situ con sondas marcadas con fluoróforos (FISH)
3.4.1 Preparación de reactivos para FISH
A continuación se describe el protocolo de preparación de los reactivos necesarios en
los procesos de fijación, lavado e hibridación.

43
 Paraformaldehido (para fijación)
Calentar 65 ml de agua bidestilada hasta 60ºC.
Añadir 4 g de paraformaldehido (PFA).
Añadir 1 gota de una solución de NaOH 2M y agitar rápidamente hasta que la
solución se haya clarificado.
Quitar de la fuente de calor y añadir 33 ml de PBS 3X.
Ajustar el pH a 7,2 con HCl.
Eliminar cualquier resto de cristales por filtración a través de 0,2 µm.
Enfriar rápidamente a 4ºC y conservar a esta temperatura.
 Tampón fosfato salino (para fijación)
─ Concentración PBS 1X
NaCl.............…..…..7,60 g
NaH2PO4∙H2O....... 1,38 g
NaH2PO4∙H2O....... 1,78 g
Agua destilada.......1000 mL
pH 7,2
─ Concentración PBS 3X
NaCl.................... 22,8 g
NaH2PO4∙H2O.... 4,1 g
Na2HPO4∙H2O..... 5,3 g
Agua destilada .... 1000 ml
PH 7,2
Preparación: Primero disolver los fosfatos y luego el cloruro sódico.
Esterilizar por filtración 0,45 µm ó 0,2 µm y conservar a 4ºC.

44
 Solución de gelatina (para preparación de portaobjetos)
Gelatina.................................... 0,1%
Sulfato potásico cromato ........ 0,01% (Sigma ref. C-5926, 12H20)
Calentar previamente el agua destilada hasta 60ºC.
Fundir la gelatina (100 mg 0,1% + 10 mg sal de cromato 0,01%) en 100 ml de
agua destilada.
Enfriar a 50ºC para sumergir los portaobjetos.
 Solución de limpieza de portaobjetos FISH (para preparación de
portaobjetos)
Etanol con 10% KOH
 Etanol (para deshidratación)
50%
80%
100%
 Cloruro sódico 5M (para tampón de hibridación y tampón de lavado)
Cloruro sódico.......... 292.2 g
Agua destilada.......... 1000 ml
Disolver el NaCl en 800 ml de agua destilada y ajustar el volumen hasta 1
litro. Distribuir en alícuotas. Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y
por filtración.
 EDTA 0,5M (cuando la concentración de formamida es mayor o igual a
20%)
EDTA 2H2O.....................186,1 g
Agua destilada................ hasta 1000 mL

45
Preparación: pesar el EDTA y añadir a 800 mL de agua destilada. Ajustar el pH
a 8,0 con NaOH (el reactivo no se disuelve hasta ajustar el pH a 8,0).
Completar hasta 1000 mL con agua destilada. Esterilizar en autoclave 121ºC
durante 15 minutos y por filtración.
 Tris-HCl pH 8.0 (tampón de hibridación y tampón de lavado)
Tris Base ........................ 121,1 g
H-Cl.................................. 42 ml de HCl concentrado
Agua destilada................ hasta 1000 ml
Preparación: pesar el Tris y añadir a 800 ml de agua destilada. Añadir 42 ml de
HCl concentrado y completar hasta 1000 ml con agua destilada. Esterilizar en
autoclave 121ºC durante 15 minutos y filtración.
 SDS 10% (para tampón de hibridación y tampón de lavado)
SDS ........................ 10 g
Agua destilada....... Hasta 100 ml
Esterilizar por filtración.
 Agua Milli-Q
 Reactivo de montaje para evitar la pérdida de fluorescencia.
Vectashield
3.4.2 Tratamiento de los portaobjetos cubiertos de Teflón
Todos los portaobjetos utilizados en la técnica FISH se han de lavar y desengrasar.
Previamente a su empleo se les debe dar un baño en una solución de gelatina y de
sulfato de potasio y cromo para favorecer la adhesión de la muestra. A continuación se
detallan los pasos a seguir para el tratamiento de los portaobjetos:
o Lavar con solución de limpieza.
o Enjuagar con agua destilada.

46
o Secar al aire (dejar escurrir todo 1 día, protegiendo del polvo ambiental
cubriendo los portaobjetos con papel aluminio).
o Cubrir con gelatina por inmersión en la solución de gelatina 0,1% con cromato
sulfato potásico 0,01% (preparada en el momento, temperatura 60ºC).
o Secar al aire.
3.4.3 Fijación y permeabilización de las muestras
Para llevar a cabo la técnica FISH fue necesario fijar las bacterias. Este primer paso es
necesario para que la estructura celular se mantenga rígida y estática y se conserve
su morfología favoreciendo la penetración de las sondas. Las células deben ser
permeabilizadas, para ello se utilizan detergentes como el SDS (sodio dodecil sulfato).
Para la fijación de las muestras se utilizó un reactivo diferente según la
pared celular de la bacteria (Gram positiva y Gram negativa). En el caso de las
bacterias Gram negativas la permeabilización se realizó con paraformaldehido. Una
vez fijadas las muestras, se conservan a -20ºC.
Los pasos y reactivos para la fijación y permeabilización se describen en
detalle a continuación para bacterias Gram negativas:
o Lavar 1ml de flóculo con 500μl de PBS 1X (7000 r.p.m durante 3 minutos).
o Añadir 3 vols de PFA (750 μl) a 1 vol (250 μl) de muestra y mantener a 4ºC
durante 1-3 h. (mínimo 1h- máximo 18h).
o Concentrar las células por centrifugación (7000 r.p.m durante 3 minutos) y
eliminar fijador.
o Lavar las células con PBS 1X (500 μl).
o Resuspender las células con con PBS 1X (500 μl) y etanol absoluto (500 μl) y
mantener a -20ºC
Los pasos a realizar en función del tipo de bacteria a fijar, se describen en la figura 7,
en este caso se destaca la fijación para bacterias Gram negativas.

47
Figura 7. Fijación de las muestras.

48
3.4.4 Aplicación de las muestras a los portaobjetos
Los pasos para la aplicación de las muestras son los siguientes:
o Poner un volumen entre 3 y 5 μl de muestra fijada al portaobjetos FISH. En
este caso se ha puesto un volumen de 4 μl en cada pocillo del portaobjetos.
o Secar al aire.
o Deshidratar en etanol 50% durante 3 minutos por inmersión.
o Deshidratar en etanol 80% durante 3 minutos por inmersión.
o Deshidratar en etanol 100% durante 3 minutos por inmersión
o Secar al aire.
3.5 Sondas utilizadas
Las diferentes sondas utilizadas en las hibridaciones se recogen en la tabla 5, así
como su secuencia de nucleótidos del extremo 5’ al 3’ y el porcentaje de formamida
óptimo a utilizar.
Las sondas marcadas con el fluoróforo TAMRA (rodamina, cuya longitud
de onda de absorción es de 565nm y de emisión de 580nm, rojo) fueron las siguientes:
Caldi-0678, T0803-0654, T0803ind-0642, CFX197, CFX223, CFX67a, CFXMIX
(CFX1223+GNSB941), G123T, HHY, TM7905. Mpa645, MC2-649, ALF1B, BET 42 a,
y GAM 42a.
Sólo una sonda se marcó con FAM (Fluoresceína) cuya longitud de onda
absorción es de 494 nm y de emisión de 518nm (verde): CFX67b.
Tabla 5. Sondas empleadas en la identificación de las bacterias filamentosas
Sonda Especificidad Secuencia
%
FA*
Referencia
Caldilinea
Caldi-0678
Género
Caldilinea
TTCCACCACTACACCGGG
30 Kragelund et
al. (2011)
Comp1-Caldi-
0678
Sonda
competidor 1
TTTCACCACTACACCGGG
- Kragelund et
al. (2011)
Comp2-Caldi-
0678
Sonda
competidor 2
TTCCACCGCTACACCGGG
- Kragelund et
al. (2011)
Tipo 0803 T0803-0654 Morfotipo 0803 ACACC CTCTCACYRCCT
30 Kragelund et
al. (2011)

49
T0803ind-0642 Morfotipo 0803 CTGCCTCAAGCTACTCAG
30 Kragelund et
al. (2011)
h1 T0803ind-
0607
Helper AGTTAAGCCAGGAGATTT
- Kragelund et
al. (2011)
h2 T0803ind-
0625
Helper TTTCCAACGACCCCTCCC
- Kragelund et
al. (2011)
h3 T0803ind-
0662
Helper GAATTCTACACCCCTCTC
- Kragelund et
al. (2011)
h4 T0803-0680 Helper ATTCCACCACTACACCGG
- Kragelund et
al. (2011)
TIPO 0092
CFX197 Variante A TCCCGGAGCGCCTGAACT 40
Speirs et al.
(2009)
CFX197comp
Sonda
competidora
TCCCGAAGCGCCTGAACT
- Speirs et al.
(2009)
CFX223 Variante B GGTGCTGGCTCCTCCCAG
35 Speirs et al.
(2009)
CFX223 H202 Helper AGCGCCTGAGCTTCAGTCATC
- Speirs et al.
(2009)
CFX223 H241 Helper CGTTACCTTACCAACTAGCTGATGG
- Speirs et al.
(2009)
TIPO 0914
CFX67a Tipo 0914 TTCCGAAGATCAGGTTCG
35 Speirs et al.
(2010)
CFX67-H46 Helper TTCGACTTGCATGTGTTARGC
- Speirs et al.
(2010)
CFX67 comp
Sonda
competidora
TTCCGAAGATCGGGTTCG
- Speirs et al.
(2010)
CFX67b Tipo 0914 TTCCGAAGATTAGGTTCG
35 Speirs et al.
(2010)
CFX67-H95 Sonda helper CCGTRCGCCACTAACCYT
- Speirs et al.
(2010)
Phylum
Chloroflexi
CFX1223
Phylum
Chloroflexi
CCATTGTAGCGTGTGTGTMG
35 Björnsson et
al. (2002)
CFX1223-
H1206
Helper CCCWGGAYATAAAGGCC
- Speirs et al.
(2010)
CFX1223-
H1243
Helper TTTAGCAACYYATTGTACCGR
- Speirs et al.
(2010)
GNSB914
Phylum
Chloroflexi
AAACCACACGCTCCGCT
35 Gich et al.
(2001)
GNSB914-H927 Helper GCTTGTGCGGGCCC
- Speirs et al.
(2010)
GNSB941-H958 Helper TTCTTCGYGTTGCATCGAATT
- Speirs et al.
(2010)
TIPO 1851 CHL1851 Tipo 1851 AATTCCACGAACCTCTGCCA
35 Beer et
al.(2002)
β
Proteobacteria BET42a
β
Proteobacteria
GCCTTCCCACTTCGTTT
35 Manz et al.
(1992)
γ
Proteobacteria GAM42a
γ
Proteobacteria
GCCTTCCCACATCGTTT
35 Manz et al.
(1992)
Microthrix
parvicella
Mpa645
Microthrix
parvicella
CCGGACTCTAGTCAGAGC
20 Erhart et al.
(1997b)
C.
“Monillibacte
r batavus”
MC2-649
C.
“Monillibacter
batavus”
CTCTCCCGGACTCGAGCC
35 Snaidr et al.
(2002)
Haliscomeno
bacter
hydrossis
HHY
Haliscomenob
acter
hydrossis
GCCTACCTCAACCTGATT
20 Wagner et al.
(1994)
TIPO
0041/0675
TM7905
TIPO
0041/0675
CCGTCAATTCCTTTATGTTTTA
20 Hugenholtz et
al. (2001)
Thiothrix
spp.
G123T Thiothrix spp. CCTTCCGATCTCTATGCA
40 Kanagawa et
al. (2000)
*Porcentaje de formamida óptimo para la hibridación.

50
3.6 Hibridación in situ
Para el proceso de hibridación se deben seguir los siguientes pasos y emplear los
reactivos que se detallan a continuación:
En primer lugar se prepara la solución de hibridación con formamida en
un microtubo de 2 ml. La cantidad de reactivos dependerá del porcentaje óptimo de
formamida que a su vez dependerá de la sonda utilizada (tabla 6).
Tabla 6. Solución de hibridación según porcentaje de formamida
Reactivo % DE FORMAMIDA
10% 20% 25% 30% 35% 40% 45%
NaCl 5M 360μl 360μl 360μl 360μl 360μl 360μl 360μl
HCl-Tris 1M 40μl 40μl 40μl 40μl 40μl 40μl 40μl
Formamida 200μl 400μl 500μl 600μl 700μl 800μl 900μl
H2O MiliQ 1398μl 1198μl 1098μl 998μl 898μl 798μl 698μl
SDS 10% 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl
Volumen Final 2000 μl 2000 μl 2000 μl 2000 μl 2000 μl 2000 μl 2000 μl
o Poner 9 μl de la solución de hibridación + 1 μl de sonda en cada pocillo y
repartir homogéneamente por todo el campo. En el caso de que junto con la
sonda se tengan que añadir sondas competidoras y/o helper se deberá hacer
una combinación de todos ellos con la sonda hasta alcanzar la cantidad de 1
μl. A partir de la puesta en contacto con la sonda hay que evitar el contacto con
la luz para evitar la pérdida de fluorescencia del fluoróforo.
o Poner un trozo de papel de celulosa dentro de un tubo Falcon de 50ml y echar
sobre el papel la solución de hibridación sin sonda que sobra, este paso es
necesario para crear una atmósfera húmeda.
o Introducir el portaobjetos dentro del tubo Falcon de 50ml en posición horizontal.
o Incubar a 46ºC durante al menos 1h 30 min.

51
o Para eliminar el exceso de sonda que no ha hibridado y la formamida de los
portaobjetos se prepara 50 ml de solución de lavado mezclando los reactivos
presentes en la siguiente tabla dependiendo del porcentaje de formamida que
ha sido utilizado en la solución de hibridación (tabla 7)
Tabla 7.Solución de lavado según porcentaje de formamida
Reactivo % DE FORMAMIDA
10% 20% 25% 30% 35% 40% 45%
NaCl 5M 4500μl 2150μl 1490μl 1020μl 700μl 460μl 300μl
EDTA 0,5M - 500μl 500μl 500μl 500μl 500μl 500μl
HCl-Tris 1M 1000μl 1000μl 1000μl 1000μl 1000μl 1000μl 1000μl
H2O MiliQ 44,45ml 46,3ml 47,94ml 47,43μl 47,75ml 47,06μl 48,15ml
SDS 10% 50 μl 50μl 50μl 50μl 50μl 50μl 50μl
Volumen Final 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml
o Sacar de la estufa y rápidamente lavar los portaobjetos e introducirlos dentro
del tubo con la solución de lavado, los tubos se forran con papel de aluminio
para protegerlos de la luz. Incubar en un baño a 48ºC durante 15-20 minutos.
o Lavar con agua MilliQ.
o Secar al aire en la oscuridad.
o Si no se observa al microscopio inmediatamente, guardar el porta a -20ºC.
3.7 Observación al microscopio
Una vez realizada la hibridación in situ con las sondas específicas, es posible proceder
a la observación con el microscopio y a la toma de imágenes.
Para poder observar las muestras con el microscopio de epifluorescencia
se precisa la aplicación de Vectaschield, líquido de montaje que evita la pérdida de
fluorescencia. Se debe disponer una pequeña cantidad de este líquido en la zona
central del portaobjetos y colocar encima un cubreobjetos, a continuación con ayuda
de una punta se ejerce una pequeña presión sobre éste para que el líquido de montaje

52
se extienda de forma uniforme por toda la muestra, ya se puede observar el pocillo con
los objetivos de 60X o 1000X (con aceite de inmersión).
El microscopio utilizado para la observación de las muestras ha sido un
Olympus BX 50 con los filtros: U-MWIB (Fluoresceína, FAM) y U-MWIG (Rodamina,
TAMRA). Las fotografías en color se realizaron con una cámara digital Olympus DP 10
acoplada al microscopio
3.8 Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos
Uno de los objetivos del presente estudio fue identificar y cuantificar los morfotipos
filamentosos presentes. Las dos técnicas utilizadas en la identificación y cuantificación
de las bacterias filamentosas en el presente estudio fueron:
3.8.1 Técnica convencional
Las técnicas convencionales se emplearon únicamente como análisis preliminar para
la elección de las sondas previa a la aplicación de la técnica FISH. La observación de
los filamentos bacterianos del flóculo mediante métodos clásicos se realizó antes de
las 48 horas posteriores a la toma de muestras.
En un número reducido de muestras y con carácter informativo se estimó
la densidad de filamentos aplicando la escala subjetiva (0-5) propuesta por Eikelboom
(2000,2006) y Jenkins et al (2004).
3.8.2 Técnica FISH
Para la cuantificación de los microorganismos se realizó un barrido de todos los
pocillos del portaobjetos con el microscopio de epifluorescencia una vez realizado el
proceso de hibridación in situ.
La valoración de la abundancia de las bacterias filamentosas se realizó
aplicando la escala subjetiva de Eikelboom (2000,2006), (tabla 8).

53
Tabla 8. Escala de valoración de organismos filamentosos
FI Abundancia Descripción
0 “Ninguno” Ningún filamento presente
1 “Pocos” Pocos filamentos y de forma ocasional en el flóculo
2 “Algunos” Filamentos en aproximadamente la mitad de los flóculos
3 “Comunes” Filamentos en todos los flóculos con baja densidad (1-5/flóculo)
4 “Muy comunes” Filamentos en todos los flóculos con densidad media (5-20/ flóculo)
5 “Abundantes” Filamentos en todos los flóculos con alta densidad (>20/ flóculo)
La escala utilizada para valorar la abundancia de las bacterias
filamentosas se muestra en la figura 8.
Figura 8. Escala de valoración de la abundancia de bacterias filamentosas
3.9 Análisis estadístico
En el análisis estadístico primeramente se realizó un resumen estadístico donde se
tabularon los valores mínimos, máximos, la media y la desviación estándar de cada
una de las variables operacionales y físico-químicas.
Posteriormente se realizó un análisis de correspondencia canónica (ACC).
Se trata de una técnica multivariante que permite representar en un espacio

54
geométrico de pocas dimensiones las proximidades existentes entre un conjunto de
objetos condicionado por una serie de variables predictoras. Permite a los ecologistas
relacionar la abundancia de especies (variables independientes) con las variables del
entorno (variables dependientes o explicativas) (Ter Braak, 1986). Se empleó este
análisis puesto que, contrariamente al análisis de componentes principales, no se trata
de una técnica exploratoria (Ramette, 2007). Además proporciona mejores
conclusiones, realiza un análisis directo del gradiente, nos permite conocer los valores
óptimos e incluso con gradientes cortos ofrece buenos resultados.
El ACC utiliza el modelo unimodal para modelar la respuesta de la
especie a la variación ambiental como una simplificación matemática para permitir la
estimación de un gran número de parámetros y la identificación de un pequeño
número de ejes de ordenación (Ramette, 2007). Este modelo de especies parece, sin
embargo, ser robusto incluso cuando algunas especies muestran respuestas
bimodales, intervalos desiguales o máximos desiguales a lo largo de gradientes
ambientales (ter Braak y Smilauer, 2002). Por lo tanto, es particularmente adaptado
para la interpretación y ordenación ambiental de tablas de abundancia y ocurrencia de
especies (Ramette, 2007).
3.9.1 Tratamiento por ordenador
Para realizar el ACC se utilizó el programa XLSTAT-ADA 2012, donde se introdujo la
matriz de datos previamente normalizados (log (variable+1)) y se especificaron las
variables deseadas en cada caso para realizar el ACC. El test de permutación
realizado sugirió la conveniencia de utilizar un método unimodal (ACC).
El programa genera un gráfico “biplot” en el cual aparecen puntos y
flechas que representan la ordenación de las variables respecto a dos ejes. Cada
punto representa a una especie, la distancia entre el símbolo en el diagrama aproxima
la disimilaridad de la distribución de la abundancia relativa de dicha especie a través
de los lugares. Especies cuyos puntos que las representan aparecen próximos en el
gráfico significa, que a menudo son especies que aparecen juntas (ocurren
conjuntamente), y por tanto, aparecerán en lugares que representan las mismas
condiciones ambientales, y ellas presentan óptimos similares para todas las variables
ambientales.
Cada flecha marca la dirección esperada de mayor incremento de los
valores de la variable medioambiental a la que representa, es lo que se conoce como

55
dirección del gradiente. La longitud de la misma se refiere a su variabilidad. La flecha
se inicia desde el promedio (ponderado) de la variable ambiental, y los valores
aumentan hacia la punta de la flecha y disminuyen en la dirección opuesta. Los
ángulos entre dos flechas indican la correlación entre las variables ambientales que
representan, por tanto, un ángulo agudo indica correlación alta positiva, y un ángulo
cercano a 180° indica correlación alta negativa; un ángulo próximo a 90° indicaría que
su correlación es aproximadamente 0.
Los puntos especie pueden ser proyectados perpendicularmente sobre la
línea imaginaria superpuesta al vector que representa a una variable particular. Dichas
proyecciones pueden ser utilizadas para aproximar el óptimo de dicha especie con
respecto a dicha variable ambiental. De esta forma, las especies cuya proyección está
más cercana a la punta de la flecha del vector que representa a la variable indica que
prefiere valores más altos de dicha variable (es decir, que su óptimo son valores más
altos de dicha variable). Al contrario sucedería si proyecta sobre el lado opuesto a la
flecha en esa línea imaginaria, que tendría como óptimo valores más bajos de dicha
variable.

58
4 RESULTADOS
Los resultados que se presentan a continuación corresponden tanto a la identificación
como a las abundancias de los morfotipos detectados en las muestras analizadas por
el método molecular FISH, así como al análisis estadístico realizado entre dichos
morfotipos filamentosos y los parámetros físico-químicos y operacionales del proceso
de depuración con sistema MBR. Se incluyen también los resultados obtenidos en la
identificación preliminar por métodos convencionales como apoyo al estudio.
4.1 Cuantificación e identificación de los morfotipos filamentosos.
4.1.1 Microscopía Convencional
Las bacterias filamentosas se identificaron gracias a características morfológicas
distintivas. No obstante algunos morfotipos tienen un gran parecido y no permiten una
identificación por estos métodos como organismos diferentes. Es el caso de los
morfotipos 0803/0914 y 0041/0675. Existen otros morfotipos cuya identificación reviste
especial dificultad por presentar una morfología muy variable o por sus reducidas
dimensiones. Los morfotipos de bacterias filamentosas identificados por métodos
convencionales se muestran en la tabla 9.
*Morfotipos que revisten gran dificultad de identificación.
Tabla 9. Morfotipos identificados por métodos convencionales
Morfotipo Filamentoso Presente
TIPO 0803/0914 Si
Nocardioformes No
TIPO 0041/0675 Si
TIPO 021N Si
TIPO 0961 Si
TIPO 0092 Si*
N. limicola Si
TIPO 0581 Si*
TIPO 1851 Si
H. hydrossis Si*

59
A continuación se muestran imágenes de las bacterias filamentosas identificadas por
métodos convencionales, observadas con microscopía de contraste de fases a 1000
aumentos (100X) (Imagen 1).
Imagen 1. Bacterias filamentosas identificadas por métodos convencionales,
microscopía de contraste de fases 1000X. 1. Haliscomenobacter hydrossis, 2.
Nostocoida limícola, 3. Tipo 0092, 4 Tipo 0041/0675, 5. Tipo 0803/0914, 6. Tipo 021N, 7.
Tipo 0961, 8. Monilibacter Batavus, 9. Tipo 1851.
Con fines únicamente informativos, se estimó la abundancia de los morfotipos
identificados por métodos convencionales de algunas de las muestras. (figura 9)

60
Figura 9. Abundancia de los morfotipos identificados por convencional
El empleo de métodos convencionales de identificación sirvió de ayuda en la selección
de las sondas adecuadas para la identificación por el método molecular FISH.
4.1.2 Método molecular FISH
Una vez identificadas las bacterias presentes por métodos convencionales, se
procedió a la hibridación con las sondas disponibles más adecuadas. Las sondas
empleadas para la identificación de los morfotipos de bacterias filamentosas
empleando la técnica FISH y su Índice de Abundancia de Filamentosas (IF), se
muestran en la tabla 10.
Tabla 10. Sondas empleadas y abundancias
Bacteria Filamentosa Sonda IF
Tipo 1851 CHL 1851 0
C."Monilibacter batavus" MC2-649 4-5
Microthrix parvicella mpa645 1
Caldilinea Caldi-0678 5
Tipo 0803 T0803-0654 5
Tipo 0803 T0803ind-0642 0
Tipo 0092 (variante A) CFX197 5
Tipo 0092 (variante B) CFX223 <3
Tipo 0914 CFX67a <3

61
Tipo 0914 CFX67b 0
Chloroflexi CFX1223 5
Betaproteobacteria BET42a 0
Gammaproteobacteria GAM42a <3
Thiothrix sp. G123T <2.5
Tipo 0041/0675 TM7905 0
Halyscomenobacter hydrossis HHY 0
Los recuentos correspondientes a cada día de muestreo para cada sonda empleada
en la identificación con el método molecular FISH, se muestran en la figura 10.

62
Figura 10. Abundancia presentada por cada una de las sondas empleadas para la identificación mediante FISH

63
A continuación se muestran imágenes de las bacterias filamentosas identificadas por
mediante FISH (Imagen 2).
Imagen 2. Bacterias filamentosa identificadas mediante FISH. 1a y b. Candidatus
`Molinibacter batavus´ (sonda MC2-649), (FISH, contraste Fases), 1000X; 2a y b. Phylum
Chloroflexi (sondas GNSB 941 y CFX 1223), 1000X; 3a y b. Bacterias filamentosas del
Tipo 0092 variante A phylum Chloroflexi (sonda CFX197, (FISH, contraste Fases), 1000X;
4. Bacterias filamentosas del género Caldilinea phylum Chloroflexi (sonda Caldi-0678),
1000X.

64
La aparición del Tipo 0041/0675, Haliscomenobacter hydrossis (4 muestras
con IF>2), y el Tipo1851 (4 muestras con IF>5) fue estimada por microscopia
convencional. No se detectó señal de fluorescencia en las hibridaciones con las
sondas TM7905 (Tipo 0041/0675), HHY (H. hydrossis), CHL1851 (Tipo 1851).
4.2 Estadística
Inicialmente se realizó un Resumen Estadístico donde se tabularon los valores
mínimos, máximos, la media y la desviación estándar de cada una de las variables
operacionales y físico-químicas (tabla 11). Para los cálculos estadísticos se empleó el
programa XLSTAT-ADA 2012 con el que se realizó un Análisis de Correspondencia
Canónica (ACC) para determinar las relaciones entre la aparición de bacterias
filamentosas, los parámetros operacionales y las características del afluente, se
incluyeron únicamente aquellas pruebas de hibridación en las que se obtuvo
variabilidad durante el estudio: Thiothrix sp., Gammaproteobacterias, C.”M.batavus”,
Tipo 0092 y Tipo 0914. Los resultados fueron los siguientes.
Tabla 11. Resumen estadístico
Abreviatura Rango Media D. estándar
TRHr 47.10-65.73 56.96 6.41
CM 0.01-0.02 0.01 0.00
Fex 180.26-2326.45 1004.73 814.88
LICOR MEZCLA
SSLM 10264.00-17166.00 12800.21 2026.66
SSVLM 7720.00-12990.00 9749.00 1511.31
%SSVLM 74.08-80.50 77.39 2.36
AFLUENTE
pH 8.04-8.36 8.19 0.09
DBO_afl 180.00-290.00 234.28 37.15
DQO_afl 371.00-636.00 521.14 85.74
NT_afl 60.10-79.70 69.61 6.30
Cond_afl 2680.00-2830.00 2780.93 58.14
EFLUENTE
DQO_efl 16.00-25.00 19.00 2.98
DBO_efl 4.00-10.00 7.50 1.83
PT_efl 3.42-6.06 4.41 0.96
CPT 0.00-0.00 0.00 0.00
N_NH4_efl 0.12-4.65 2.01 1.31
N_NO3_efl 2.13-6.80 4.64 1.08
N_NO2_efl 0.12-0.36 0.22 0.06
NT_efl 9.01-13.20 10.49 1.28
CNT 0.00-0.01 0.00 0.00
NKT_efl 3.94-8.42 5.63 1.40

65
Turb_efl 0.44-1.10 0.80 0.18
RENDIMIENTOS
rDBO 95.00-97.78 96.78 0.77
rDQO_ 94.88-97.30 96.26 0.82
rPT 14.20-54.53 38.26 11.81
rNT 81.49-88.34 84.91 1.47
rNKT 88.25-94.27 91.93 1.80
En el rango de estudio de la temperatura del reactor (Tr) (10-28ºC), un
aumento en la temperatura derivó en una mayor abundancia de Thiothrix. Por el
contrario, el Tipo 0092 y el Tipo 0914 mostraron una relación negativa con Tr.(figura
11)
Figura 11.Ordenación del biplot basado en el ACC de la matriz Especies/Parámetros
operacionales con un 28,35% de inercia. Dónde el Tipo 0092 (CFX223), C.”Monilibacter
batavus” (MC2-649), Thiothrix (G123T), Tipo 0914 (CFX67a), Gammaproteobacterias
(GAM42a).
El biplot del ACC de Especies/Parámetros operacionales, mostró una relación
positiva entre la abundancia de C. “M. batavus” y Thiothrix, la carga másica (CM) y los
fangos en exceso (Fex). El Tipo 0914 se relacionó positivamente con el tiempo de
retención hidráulico (TRH), al contrario que C. “M. batavus” y Thiothrix cuya relación
con TRH fue negativa. (figura 11). En el afluente el aumento en la disponibilidad de C y

66
N contribuyó positivamente al cambio en la abundancia relativa de C.”M. batavus” y el
Tipo 0092, mientras Thiothrix y Tipo 0914 lo hicieron negativamente (figura 12).
Figura 12.Ordenación del biplot basado en el ACC de la matriz Especies/Características
del afluente con un 25,54% de inercia. Dónde el Tipo 0092 (CFX223), C.”Monilibacter
batavus” (MC2-649), Thiothrix (G123T), Tipo 0914 (CFX67a), Gammaproteobacterias
(GAM42a).

69
5 DISCUSIÓN
5.1 Técnicas empleadas de identificación
Los métodos convencionales de detección e identificación de morfotipos filamentosos,
son una gran ayuda para la observación de bacterias filamentosas en fangos activos
de EDAR, a pesar de lo cual no son una herramienta fiable debido a su bajo nivel de
especificidad. Es deseable el uso complementario de la técnica FISH para conocer la
verdadera abundancia y ecofisiología de los morfotipos filamentosos.
A pesar de realizarse hibridaciones con distintas sondas teniendo en cuenta la
identificación previa por métodos convencionales, esta no siempre se produjo. Se
atribuye este resultado a diversas causas, entre otras a niveles insuficientes de
ribosomas en las bacterias presentes en las muestras estudiadas, a la falta de
información de algunos morfotipos de bacterias filamentosas que impide una
identificación más correcta y a la no existencia de sondas específicas de todos los
morfotipos para la aplicación de las técnicas moleculares FISH para todos los
morfotipos. El hecho de no hibridar con la sonda elegida, no implica necesariamente
que no existan bacterias filamentosas de ese morfotipo en la muestra.
5.2 Abundancia de los morfotipos filamentosos
Las bacterias filamentosas del phylum Chloroflexi hibridadas con la sonda CFXmix
(CFX1223+GNSB941) presentaron una abundancia elevada (IF= 5), abundantes”)
durante todo el periodo de muestreo. Miura et al., (2007) reportaron que la abundancia
de Chloroflexi en MBR era superior a la que se daba en el sistema de fangos activos,
indicando que era debido a que las condiciones del MBR propiciaban su crecimiento.
Otros estudios han apuntado que los filamentos del phylum Chloroflexi son
abundantes en EDAR tanto de origen municipal como de origen industrial
constituyendo un porcentaje elevado del total de la biomasa de los fangos activos
(Kragelund et al., 2011).
Los filamentos del género Caldilinea hibridados con la sonda específica Caldi-
0687 también aparecieron en todas las muestras de la EDAR con índices de
filamentos elevados (IF=5. Los miembros del género Caldilinea y clase Caldilineae
constituyen entre un 9 y un 12 % de la comunidad bacteriana del phylum Chloroflexi,
según la técnica molecular FISH (Yoon et al., 2010; Kragelund et al., 2011).

70
El morfotipo 0803 hibridado con la sonda específica T0803-0654 para aguas
urbanas, fue detectado en todas las muestras de la EDAR con abundancia elevada
(IF=5). La elevada presencia de este morfotipo filamentoso coincide con las
referencias de otros autores (Kragelund et al., 2011) en las que se calcula que el
morfotipo 0803 constituye alrededor del 20 % de la población de Chloroflexi. La
hibridación con la sonda específica para aguas industriales T0803ind, como era de
esperar dio un resultado de IF=0.
El morfotipo 0914 se detectó con abundancias menores que el morfotipo 0803
en la EDAR. La sonda CFX76b no hibridó con ningún filamento bacteriano presente en
las muestras de las EDAR. Mientras que la sonda CFX67a mostró resultados variables
a lo largo del periodo de muestreo, desde IF=0, hasta IF=5. Speirs et al. (2010)
observaron en su estudio sobre el morfotipo 0914, que de las veintiséis depuradoras
estudiadas sólo en cuatro de ellas la sonda CFX67b hibridó con los filamentos
presentes en las muestras mientras que en diecisiete de las EDAR la sonda CFX67a
dio señal positiva. Según Speirs et al. (2010) y Andújar et al. (2012), el filamento
bacteriano que hibride con la sonda CFX67b presenta una menor incidencia en las
EDAR.
El morfotipo 0092 en su variante A (sonda CFX197) mostró una abundancia
elevada durante todo el periodo (IF=5), su aparición dominante junto al tipo 0803
coincide con las referencias de otros autores (Kragelund et al., 2011) en las que se
indica que ambos morfotipos pueden aparecer de forma conjunta siendo ambos la
fracción dominante del phylum Chloroflexi. La variante B (sonda CFX223) mostró una
abundancia variable a lo largo del periodo de muestreo, desde IF=0 hasta IF=3 aunque
por lo general su abundancia fue “pocos”.
El morfotipo Microthrix parvicella, se detectó (sonda MPA645) con una
abundancia de “pocos” o “ninguno”, este morfotipo es conocido por causar bulking y
foaming sus bajos niveles eran esperables ya que no se dio ningún episodio de este
tipo y las condiciones de operación con tiempos de retención cortos y alto OD (>2mg/l)
no favorecen su crecimiento (Rossetti et al., 2005), aunque en los sistemas MBR estos
episodios son menos comunes que en fangos activos.
La abundancia de bacterias filamentosas tiene una gran importancia, diversos
estudios (Waite, 1999; Wilén et al., 2003; Lee et al., 2005; Li et al., 2008a) mostraron
que las bacterias filamentosas están estrechamente relacionadas con el tamaño del

71
flóculo y la dimensión fractal. El crecimiento de los microorganismos filamentosos
podría conducir a un tamaño mayor de flóculo (Wilén et al., 2003; Meng et al., 2006) y
los fangos con menor contenido en bacterias filamentosas, tienden a tener una
estructura más “compacta”, mientras un excesivo crecimiento de las bacterias
filamentosas podría derivar en flóculos dispersos e irregulares (Waite, 1999; Li et al.,
2008a).
Los EPS comprenden básicamente una variedad de materiales poliméricos
entre los cuales las proteínas y los carbohidratos son los dos componentes principales
(Li et al., 2012). Algunos autores (Zahng et al., 2010; Pan et al., 2010) sostienen que a
medida que aumenta la concentración de las bacterias filamentosas, hay un aumento
de los EPS y de los productos microbianos solubles (SPM). Otros autores (You et al.,
2009; Meng et al., 2006) asocian la concentración de bacterias filamentosas con el
bioensuciamiento de la membrana. Por el contrario Li et al., (2008) y Parada et al.,
(2012) afirman en sus estudios que la densidad de filamentosas no tiene un impacto
significativo en el bioensuciamiento de la membrana. Reforzando esta afirmación,
Miura et al., (2007) reportó que los miembros del phylum Chloroflexi son
metabólicamente versátiles y pueden utilizar preferentemente glucosa y N-acetil
glucosamina (componente del peptidoglicano de la pared celular de las bacterias) bajo
condiciones óxicas y anóxicas. Esto sugiere que los miembros de Chloroflexi son
ecológicamente significativos en los MBR que tratan aguas urbanas y son
responsables de la degradación de los SPM incluyendo carbohidratos y material
celular, lo que en consecuencia reduce el potencial ensuciamiento. En el MBR
analizado los datos de presión transmembrana (tabla 12, Anexo) correspondientes a
parte del periodo de estudio muestran que la membrana no sufrió grandes variaciones
de presión. Las bacterias filamentosas dominantes en el MBR analizado mantuvieron
una abundancia elevada (IF= 5) constante y son miembros de Chloroflexi, que debido
a su capacidad enzimática extracelular de hidrólisis de moléculas de elevado peso
molecular (polisacáridos) podría disminuir el bioensuciamiento de las membranas.
Tan solo un número reducido de estudios han comparado operando en paralelo
la comunidad microbiana entre MBR y el sistema convencional fangos activos (CAS), y
todos revelaron diferencias significativas entre las estructuras comunitarias generales
(Luxmy et al. 2000; Hall et al., 2010; Wan et al. 2011). Parece que los MBR
seleccionan una comunidad microbiana más estable en comparación con sistemas
CAS, donde se observa una mayor dinámica (Hall et al. 2010; Wan et al. 2011).

72
Además, se han encontrado un amplio conjunto de secuencias bacterianas no
cultivadas y nuevas en un MBR (Wan et al. 2011), lo que refleja la actual falta de
conocimiento sobre las poblaciones microbianas presentes en los MBR.
5.3 Estadística
El rango normal de temperatura en fangos activos es de 8 a 25ºC, se puede
generalizar que los organismos filamentosos crecen más rápido a medida que la
temperatura aumenta dentro de este rango hasta los 35ºC, entre los 35 y 40ºC los
organismos filamentosos se estresan progresivamente, creciendo frecuentemente en
estado disperso (Jenkins et al.,2004). Dado que muchos de estos organismos son
mesofilicos, su crecimiento cesa cerca de los 40ºC, sin embargo el Tipo 0914 parece
ser termotolerante desde que Norris et al. (2000) observo su crecimiento en fangos
activos a temperaturas de 50ºC. Eikelboom (2000) sugiere que el Tipo 0092 es
dominante a temperaturas por encima de los 15ºC. Siguiendo estas premisas parece
lógico que Thiothrix se vea favorecida por el rango alto de temperatura del reactor,
mientras que la correlación con la temperatura del Tipo 0092 no coincide con los
resultados de estos autores, es posible que la diferencia en los métodos estadísticos
empleados sea la causante de esta discrepancia. La falta de estudios que relacionen
estos morofotipos con los parámetros operacionales de un sistema MBR nos impide
establecer una pauta específica de comportamiento.
Yi et al., (2012) en su estudio sobre la estructura poblacional de la comunidad
microbiana (MCS) y su dinámica en fangos activos utilizó el ACC, en sus resultados i
del ACC lla concentración de DBO en el afluente juega el papel más importante en los
cambios del MCS, seguido de la concentración de SST del afluente, además en el
efluente las concentraciones de SST y de PT se vieron afectadas significativamente
por el cambio en la MCS. En nuestro estudio también hemos observado como las
variaciones de la DBO y DQO del afluente propiciaban el crecimiento de distintos
morfotipos, estableciéndose así una relación positiva con C.”Monilibacter batavus” y el
Tipo 0092 y negativa con Thiothrix y el Tipo 0914. Unos valores de carga de DBO altos
podrían influir en la diversidad microbiana reduciendo la competición entre los
microorganismos heterótrofos (Tan et al., 2008), el cual podría afectar ligeramente a
MCS generales. En los MBR se ven favorecidas las bacterias de crecimiento lento,
favorecidas por las condiciones de limitación de nutrientes impuesta por los
prolongados tiempos de retención de la biomasa característicos de los MBR (Chen y
Lapara, 2006; Lapara et al., 2002)

75
6 CONCLUSIONES
Los morfotipos filamentosos del phylum Chloroflexi (tipo 0803, 0914 y 0092)
identificados con la técnica FISH comprendían el grupo dominante en el reactor
biológico. El morfotipo secundario identicado ha sido Candidatus ”Monilibacter
batavus” . El resto de morfotipos filamentosos mostraron abundancias variables a lo
largo del estudio.
Los morfotipos identificados del phylum Chloroflexi no han presentado variaciones
estacionales en su abundancia durante el período del estudio de Febrero a Noviembre.
En el MBR estudiado no se han presentado incrementos significativos de la presión
transmembrana. Las bacterias filamentosas del phylum Chloroflexi con valores de FI
altos podrían disminuir el bioensuciamiento de las membranas al consumir las
proteínas y carbohidratos que dan lugar al bioensuciamiento.
Los métodos convencionales de identificación de bacterias filamentosas son una
ayuda en la identificación pero no son fiables en la especificidad, y deben emplearse
de forma conjunta con la técnica FISH para un mejor control del proceso de
depuración.

2013 - Identificación con técnica FISH de bacterias filamentosas en MBR

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