Система Proteon - оптический биосенсор, основанный на технологии поверхностного плазмонного резонанса для оценки силы, динамики, продолжительности взаимодействия между молекулами.

1. September 24, 2013
Система для анализа межмолекулярных
взаимодействий ProteOn XPR36

2. Life Science Group
Методы исследования межмолекулярных
взаимодействий
С использованием метки
 Флуоресцентная
 Радиоизотопная
 Пр.
Без использования метки
В растворе
 Двух и более гибридные системы в
культурах дрожжевых клеток
 Изотермическая титрационная
калориметрия (ITC)
 Аналитическое
ультрацентрифугирование (AUC)
На поверхности (биосенсоры)
 Оптические
– Поверхностный плазмонный
резонанас (SPR)*
– Эллипсометрия
– Поглощение/отражение
 Электрические (Амперометрия,
проводимость, емкость)
 Механические (Акустические,
микромеханические и пр)

3. Life Science Group
Использование меток
Традиционный биохимический анализ –
цветовое мечение продуктов реакции
ELISA: фермент-опосредованный
иммуносорбционный анализ
ИФА – Иммунофлуоресцентный
анализ
Традиционные методологии
(1) Мечение требует
времени и может влиять на
взаимодействие молекул
между собой
(2) Низкая точность
кинетических параметров
(3) Затруднения при работе
с низкомолекулярными

4. Life Science Group
Преимущества биосенсоров
Поглощение/испускание света
Полимерная поверхность
Металлизированная поверхность
Коэффициент преломления/
световая интерференция
Вместо детектирования светового сигнала
из области реакции, можно определять
изменения коэффициента преломления
подложки
SPR – наиболее широко применяемая
технология для измерения
биомолекулярных взаимодействий без
применения меток
Таг-репортер испускает световой сигнал
непосредственно из области реакции
Существует ли другой способ детекции?

5. Life Science Group
Поверхностный плазмонный резонанс….
ППР – это возбуждение электронного газа (плазмона) вдоль поверхности металл/диэлектрик посредством света.
 позволяет обходиться без меток
 обеспечивает измерения в режиме реального
времени
 возникает на поверхности чипа
Детекция SPR
 Измеряются изменения коэффициента преломления на слое золота
 Эти изменения пропорциональны изменениям массы на поверхности
– Масса меняется при иммобилизации белка на чипе
– Масса еще раз меняется при пропускании потока аналита
– Масса меняется при диссоциации аналита
 На выходе = двухфазная кривая, сенсограмма, по которой можно судить о кинетике
взаимодействия (ka и kd)
Что такое SPR?
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 50 100 150 200 250 300

6. Life Science Group
Геометрия Кречманна
Призма
Поляризованный свет Отраженный свет
Слой золота Сенсорная
поверхность
Проточный канал
Светоиспускающие диоды
освещают призму под различными углами
CCD

7. Life Science Group
Базовая терминология SPR
На поверхности взаимодействуют 2 молекулы
• Поверхность: обычно это полимер с функциональными
карбоксильными группами
• Лиганд: один из партнеров взаимодействия,
иммобилизован на поверхности
• Аналит: один из партнеров взаимодействия, протекает
вдоль поверхности
Лиганд
Аналит
Поверхность

8. Life Science Group
Поверхность биосенсора
Иммобилизация лиганда Ток аналита
Присоединение аналита/
взаимодействие
Этапы
Поверхность биосенсора
Технология SPR
СЕНСОГРАММА
Поверхность биосенсора

9. Life Science Group
ПотокПоток
Проточная
ячейка
ДиссоциацияДиссоциация
СвязываниеСвязывание
Достижение равновесияДостижение равновесия
Технология SPR

10. Life Science Group
Преимущества
безметочного подхода
Биомолекулярные взаимодействия
• Белок-Белок
• Белок-Пептид
• Антиген-Антитело
• Белок-Низкомолекулярное соединение
• НК-Белок
• НК-ДНК
• Углеводы-Белок
• Липиды – Низкомолекулярные
соединения
• Насколько специфично взаимодействие?
• Насколько быстро происходит взаимодействие (ka)?
• Насколько стабилен комплекс (kd)?
• Насколько сильно взаимодействие (KD)?

11. Life Science Group
Типы анализов, осуществляемых
посредством SPR
• ДаДа//НетНет – являются ли молекулы партнерами
взаимодействия
• КинетическийКинетический – ka и kd константы скоростей
ассоциации и диссоциации, соответственно
• РавновесныйРавновесный – KD константа аффиности
• КонцентрационныйКонцентрационный – определение активной
концентрации аналита
• ТермодинамическийТермодинамический – свободная энергия,
энтальпия, энтропия. Объяснение значений
кинетических констант связывания

12. Life Science Group
Одинаковая аффинность – различная кинетика
KD=1x10-6
[M]
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 50 100 150 200 250 300
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 50 100 150 200 250 300
ka=1x105
(1/Ms); kd=1x10-1
(1/s(ka=1x102
(1/Ms); kd=1x10-4
(1/s(
Полный спектр кинетических
данных – преимущество SPR

13. Life Science Group
Области применения биосенсоров
Скрининг/ранжирование антител
Характеризация антител
Изотипирование антител
Картирование эпитопов
Скрининг лекарств/
низкомолекулярных соединений
Определение концентраций
Анализ мутантов
Картирование поверхности белка
Формирование белкового комплекса
Лиганд-рецепторное взаимодействие

14. Life Science Group
Ограничения существующих SPR систем
Biosensor Surface
Низкая производительность
 Последовательное пропускание образцов
– Иммобилизация
– Ввод аналита
– Регенерация
– Повтор шагов
Получение кинетических данных в полном объеме требует
проведения серии экспериментов
 Трудоемкость экспериментального дизайна
 Ограниченность автоматизации

15. Life Science Group
Системы с последовательным пропусканием
образца
Ввод аналита
Принцип работы
1 канал - образец
2 канал – канал сравнения 2 канал – канал сравнения
1 канал - образец
2 канал – канал сравнения
Активация Иммобилизация лиганда
1 канал - образец

16. Life Science Group
Анализ белковых взаимодействий
ProteOn XPR36
Система анализа белковых
взаимодействий

17. Life Science Group
ProteOn XPR36
Система анализа белковых взаимодействий
Поверхностный плазмонный резонанс
Система пересекающихся
микроканалов
Измерьте 36 взаимодействий за один запуск
Новое слово в SPR: одновременный анализ нескольких образцов
6 x 6 = 6 Лигандов x 6 Аналитов
Оптический биосенсор

18. Life Science Group
Шаг 1
Иммобилизация
(до 6 лигандов)
• Активация
• Иммобилизация
• Деактивация
Шаг 2
Инъекция до 6 аналитов
в перпендикулярном
направлении
Шаг 3
Увеличенное
изображение одной
из 36 областей
взаимодействий
Особенности XPR подхода
6x6

19. Life Science Group
Параллельная проточная система
Одновременное протекание нескольких образцов в системе ProteOn XPR36
реализовано при помощи системы пересекающихся микроканалов
Преимущества
1. 6 x 6 инъекций в перпендикулярных направлениях
2. Одновременный анализ 36 взаимодействий
3. Снижение длительности эксперимента
4. Высокая производительность при низкой себестоимо
5. Различные варианты нормирования базовой линии

20. Life Science Group
Каналы иммобилизации лиганда
6 Каналов
Сенсорный
чип

21. Life Science Group
Иммобилизация лигандов
Функциональные группы, по которым возможна иммобилизация
 NH2
 COOH
 SH
 COH

22. Life Science Group
Каналы для протекания аналита
6 Каналов для аналита

23. Life Science Group
1.1
3.3
11
100 nM
33
0.37
analyte
1.1
3.3
11
100 nM
33
0.37
Отмывка
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
Вся кинетика одним выстрелом

24. Life Science Group
Лиганды
Аналиты
L1 L2 L3 L4 L5 L6
A1
A2
A3
A4
A
5
A
6
Интерспоты Канал
Life Science Group, Bulletin 3172
Уникальные возможности для установки базовой линии: интерспоты

25. Life Science Group
 6Во время ввода аналитов в ряд подается буфер
 Корректировка в режиме реального времени
Life Science Group, Bulletin 3172
L1 L2 L3 L4 L5 L6
A1
A2
A3
A4
A
5
A
6
Буфер
Уникальные возможности для установки базовой линии: вычитание
сигнала ряда

26. Life Science Group
Дрейф базовой линии обусловлен подтеканием лиганда с
захватывающей поверхности
sec sec
Рабочий буфер
Подача буфера – пустой «впрыск» - в
режиме реального времени полностью
компенсирует наклон базовой линии
Дрейф базовой линии
Уникальные возможности для установки базовой линии: двойной
контроль в режиме реального времени

27. Life Science Group
Возможности экспериментального дизайна
“1 к 1” (Оптимизация взаимодействия)
6 лигандовГрадиент 1 лиганда
“6 к 1” (Высокопроизводительная
кинетика)
6разведений1аналита
6разведений1аналита

28. Life Science Group
“6 к 6” (мультиплексный скрининг)
1аналит
36 лигандов6 лигандов
6аналитов
“36 к 1” (высокопроизводительный скрининг)
Возможности экспериментального дизайна

29. Life Science Group
Эффективность эксперимента
A1
A2
A3
A4
A5
A6
L1 L2 L3 L4 L5 L6
Дизайн типичного эксперимента “1 к 1”(Набор «Низкомолекулярное
соединение» )
L1
L1
L1
L1
L1
L1
L6
L6
L6
L6
L6
L6
L2
L2
L2
L2
L2
L2
L3
L3
L3
L3
L3
L3
L5
L5
L5
L5
L5
L5
L4
L4
L4
L4
L4
L4
L1: CA II
L2: CA II
L3: CA II
L4: CA II
L5: CA II
L6: CA II
Лиганд: CA II
A1: CBS 6.67 μM
A2: CBS 2.22 μM
A3: CBS 0.74 μM
A4: CBS 0.25 μM
A5: CBS 0.08 μM
A6: CBS 0.00 μM
Аналит: CBS
в разведениях
High
Low
Градиен

30. Life Science Group
За 1 запуск:
(1) получены достоверные данные по кинетике
(2) подобраны оптимальные условия эксперимента без использования
регенерации. Это и есть “Кинетика одним выстрелом”.
Эффективность эксперимента

31. Life Science Group
Выбор чипа
GLC/GLM/GLH LCP HTG/HTE NLC MNT
Чипы для
Конъюгации
через
аминогруппу
различной
емкости
Поверхность
для
иммобилизации
липосом
Поверхность
для захвата
белков
с His- тагами
(3-NTA-комплекс),
Различная
емкость
Нейтрави
диновая
поверхность
для захвата
Биотини
лированных
молекул
Чип для
обслуживания
Виды сенсорных чипов

32. Life Science Group
Изучение свойств рецептора IL-1 человека
Рецептор IL-1 иммобилизовали в буферах с различными значениями
pH , :для поиска оптимальных условий при которых
 достигается достаточная плотность лиганда
 лиганд остается активным
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
pH
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
pH
Пример 1:
Оптимизация экспериментальных условий за 1 запуск

33. Life Science Group
Результаты взаимодействия рецептора с IL-1 и его
антагонистом
1500
2000
2500
3000
3500
3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5
pH
Liganddensity(RU)
0
100
200
300
400
500
Rmax(RU)
Ligand density Rmax IL-1 Rmax IL-1 ra
• Максимальную плотность лиганда наблюдали при pH 5.0
• Наибольшая активность - при pH 5.5

34. Life Science Group
Интерлейкин-1 человека и его антагонист
ka
(1/Ms) kd (1/s) KD [M]
3.42E+06 8.81E-03 2.57E-9
ka
(1/Ms) kd (1/s) KD [M]
5.13E+05 5.21E-05 1.02E-10
Антагонист IL-1
IL-1

35. Life Science Group
С помощью одного экспериментального протокола на одном чипе:
1. Рецептор IL-1 человека был иммобилизован на поверхности в буфере при пяти различных
значениях pH (pH 4 - 6)
2. Наивысшая плотность лиганда - при pH 5.0
3. Инъекция IL-1 и его антагониста показывает, что оптимальная активность (по Rmax) – при pH 5.5
4. Более высокиое значение KD антагониста обусловлено более медленной диссоциацией
Рецептор IL-1 человека: резюме

36. Life Science Group
Быстрый отбор супернатантовБыстрый отбор супернатантов
высокоаффинных антителвысокоаффинных антител
Быстрый отбор супернатантовБыстрый отбор супернатантов
высокоаффинных антителвысокоаффинных антител
ЦельЦель::
скрининг и определение кинетических констант искрининг и определение кинетических констант и
равновесной константы 250 супернатантовравновесной константы 250 супернатантов
Пример 2:
скрининговые работы с применением техники захвата

37. Life Science Group
Анти-мы
ш
ины
е
Анти-мы
ш
ины
е
IgG
IgG
1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6
Захват мышиных АТ к антителам человекаЗахват мышиных АТ к антителам человека;;
номер супернатантаномер супернатанта
5
разведений
человеческого
5
разведений
человеческого
антигена
антигена
БуферБуфер
-10
15
40
65
90
115
-50 50 150 250 350
sec
RU
-10
15
40
65
90
115
-50 50 150 250 350
sec
RU
-10
10
30
50
70
90
-50 50 150 250 350
sec
RU
-10
30
70
110
-50 50 150 250 350
sec
RU
-10
15
40
65
90
115
-50 50 150 250 350
sec
RU
-10
15
40
65
90
115
-50 50 150 250 350
sec
RU
Базовая линия поБазовая линия по
интерспотаминтерспотам
11
22
33
Скрининг и ранжирование супернатантов:
схема работы
РегенерацияРегенерацияРегенерацияРегенерация
44

38. Life Science Group
-10
40
90
140
190
240
290
-50 150 350 550 750
sec
RU
-10
40
90
140
190
240
290
-50 150 350 550 750
secRU
-10
30
70
110
150
190
-50 150 350 550 750
sec
RU
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
170
190
-50 150 350 550 750
sec
RU
-10
15
40
65
90
115
140
165
190
-50 50 150 250 350 450 550 650 750
sec
RU
-10
15
40
65
90
115
140
165
190
-50 50 150 250 350 450 550 650 750
sec
RU
11 супернатант в 1 каналесупернатант в 1 канале 2 супернатант во 2 канале2 супернатант во 2 канале 3 супернатант в 3 канале3 супернатант в 3 канале
4 супернатант в 4 канале4 супернатант в 4 канале 5 супернатант в 5 канале5 супернатант в 5 канале 6 супернатант в 6 канале6 супернатант в 6 канале
Используемые концентрации: 50 (красный), 25 (розовый), 12.25 (желтый), 6.25 (голубой) и
3.12 (зеленый) nM
Данные одного из запусков: 6 супернатантов

39. Life Science Group
1.0E-06
1.0E-05
1.0E-04
1.0E-03
1.0E-02
1.0E+04 1.0E+05 1.0E+06
ka [1/Msec]
kd[1/sec]
Скрининг и ранжирование супернатантов:
результаты
ВысокоаффинноеВысокоаффинное
взаимодействиевзаимодействие
НизкоаффинноеНизкоаффинное
взаимодействиевзаимодействие
100100nMnM
1010nMnM
11nMnM
0.10.1nMnM
0.010.01nMnM
Линии изоаффинностиЛинии изоаффинности

40. Life Science Group
Скрининг и ранжирование супернатантов:
итоги
НаНа 11 ЦиклЦикл::
• Супернатант: 5 минут на 6 супернатантов.
• Антиген: ассоциация 2 минуты + диссоциация 10 минут.
• Регенерация: 1 минута.
Полное время 1 цикла: 18 минут на 6 супернатантов
НаНа 11 ЦиклЦикл::
• Супернатант: 5 минут на 6 супернатантов.
• Антиген: ассоциация 2 минуты + диссоциация 10 минут.
• Регенерация: 1 минута.
Полное время 1 цикла: 18 минут на 6 супернатантов
Всего для 250 супернатантовВсего для 250 супернатантов: 250/6*18 =: 250/6*18 =
12.512.5 часовчасов длядля 250250 супернатантовсупернатантов
Полная кинетикаПолная кинетика!!!!!!
Всего для 250 супернатантовВсего для 250 супернатантов: 250/6*18 =: 250/6*18 =
12.512.5 часовчасов длядля 250250 супернатантовсупернатантов
Полная кинетикаПолная кинетика!!!!!!

41. Life Science Group
Спасибо за внимание!Спасибо за внимание!
ProteOn XPR36

42. Life Science Group