El análisis de balance de flujo en procesos biotecnologicos en modelo caja negra

1. El análisis de balance de flujo (ABF)
Es un método matemático para analizar el metabolismo en un sistema biológico. A diferencia de otros
métodos de modelaje, no requiere conocer previamente las concentraciones de los metabolitos o los
detalles de la cinética enzimática del sistema. Se asume que el sistema bajo estudio se encuentra en
estado estacionario. La técnica entonces intenta responder a la pregunta: dados algunos nutrientes
conocidos, ¿cuál es el conjunto de flujos metabólicos que maximizan la tasa de crecimiento de un
organismo preservando la concentración interna de metabolitos?
Un ejemplo notable del éxito del ABF es la capacidad de predecir con precisión la tasa de crecimiento
del procarionte E. coli al ser cultivado en diferentes condiciones.1 Los organismos apropiados para
este análisis pueden ser cultivados en concentraciones de nutrientes definidas, midiendo sus tasas de
crecimiento. Estas tasas de crecimiento experimentales son comparadas con las predicciones del ABF,
lo que permite corregir el modelo con las observaciones.
La Red Metabólica
Las primeras seis reacciones de la Glucólisis preparadas para ABF mediante la adición de una función
objetivo (rojo) y la importación y exportación de nutrientes (ATP, ADP, BDG, ADG) a través de las
barreras del sistema (la línea punteada verde)
Las redes metabólicas pueden variar en alcance, describiendo el metabolismo en sólo una ruta
metabólica, una única célula, un tejido o un organismo. El único requisito para ser usada en ABF es
que la red no contenga huecos. Esto usualmente implica una curación manual, es decir, la revisión de
artículos científicos por humanos para extraer las reacciones metabólicas reportadas en el sistema. La
curación puede tomar meses o incluso años. Algunos programas computacionales (Simpheny,8 9
CellDesigner10 y MetNetMaker11 ) aceleran la anotación de nuevas redes listas para su uso en ABF.
Las primeras seis reacciones de la Glucólisis preparadas para ABF mediante la adición de una función
objetivo (rojo) y la importación y exportación de nutrientes (ATP, ADP, BDG, ADG) a través de las
barreras del sistema (la línea punteada verde)
Generalmente los modelos son creados en formato BioPAX o SBML de modo que se pueda llevar a
cabo un análisis o visualización más profundo; sin embargo estos formatos no son un requisito de ABF.
Restricciones: Un punto clave del Análisis de Balance de Flujos es la habilidad de añadir restricciones
a las tasas de flujo de las reacciones en las redes, forzándolas a mantenerse dentro de un rango de
valores seleccionados. Esto le permite al modelo simular con mayor precisión el metabolismo real. Las

2. restricciones pueden dividirse en dos grupos: aquellas que regulan la ingesta y excreción de
metabolitos, y aquellas que limitan el flujo a través de las reacciones metabólicas en el sistema. Los
modelos metabólicos adaptados para ABF pueden ser analizados con COBRA toolbox12 o FAME.
Medio de Crecimiento
Los sistemas metabólicos requieren cierta entrada de nutrientes. Típicamente la tasa de obtención de
nutrientes está regida por su diponibilidad en el medio (un nutriente que se encuentra ausente en el
exterior no puede ser absorbido), su concentración y sus constantes de difusión (altas concentraciones
de metabolitos con difusión rápida se absorben con mayor velocidad) y el método de absorción
(marcando una diferencia entre transporte activo, difusión facilitada y difusión simple).
Si la tasa de absorción (o excreción) de ciertos nutrientes puede ser experimentalmente medida, la
información puede añadirse como restricción a la tasa de flujo en los extremos del modelo metabólico.
Esto garantiza que los nutrientes que no estén presentes o que no pueden ser ingeridos por el sistema
no entren en su metabolismo (la tasa de flujo se restringe a cero), y que la simulación respete las tasas
de absorción. Se provee así de un método secundario de asegurar que el metabolismo simulado
contenga propiedades experimentalmente verificadas, que son algunas de todas las
matemáticamente aceptables. En términos matemáticos, la aplicación de restricciones reduce el
espacio de soluciones del problema en estado estacionario.
Restricciones internas
Además de las restricciones aplicadas en los extremos de la red metabólica, se pueden constriñir las
reacciones de la sección interna de la red. Estas restricciones son usualmente sencillas; pueden dirigir
una reacción en sólo un sentido debido a consideraciones energéticas o pueden fijar un límite máximo
en la velocidad de una reacción debido a la velocidad finita de todas las reacciones en la naturaleza.
Función Objetivo
En ABF existe un gran número de soluciones matemáticamente aceptables para el problema del
estado estacionario {displaystyle (S{vec {v}}=0)} {displaystyle (S{vec {v}}=0)}. Sin embargo algunas
soluciones no tienen sentido biológico (no reflejan procesos que ocurran en la biología del sistema en
la realidad), y las soluciones de interés son sólo aquellas que producen los metabolitos deseados en
las proporciones correctas. El conjunto de metabolitos en proporciones correctas que el modelo de
ABF intenta generar es llamado la función objetivo. Cuando se modela un organismo, la función
objetivo es generalmente la biomasa del organismo y simula el crecimiento y la reproducción. La
función de biomasa juega un papel muy importante en hacer los resultados del ABF aplicables
biológicamente (al asegurar que la proporción de metabolitos producida por el metabolismo sea la
correcta, por ejemplo) por lo que debe ser definida con sensibilidad o medida experimentalmente.
Al modelar redes más pequeñas la función objetivo se modifica de acuerdo con estas. Un ejemplo
sería, en el estudio del metabolismo de la glucosa, definir la función objetivo como cierta proporción
de ATP y NADH para simular la producción de metabolitos de alta energía por la ruta.
Descripción Matemática
Una red metabólica se compone de nodos (metabolitos) conectados por aristas con dirección
(reacciones), por lo que puede representarse como una matriz. Las propiedades de esta matriz son
bien conocidas permitiendo analizar con computadoras problemas biológicos. Un sistema biológico
real es extremadamente complejo. La medición de suficientes parámetros para definirlo es difícil e
imprecisa, y hacer simulaciones puede consumir grandes cantidades de tiempo. El Análisis de Balance

3. de Flujo simplifica la representación del sistema al requerir menos parámetros (tasas de cinética
enzimática, concentraciones de compuestos y constantes de difusión entre otros), reduciendo
considerablemente el tiempo computacional requerido para efectuar la simulación.
Las concentraciones de todos los metabolitos y los flujos a través de todas las reacciones en este
sistema pueden ser representados por las siguientes tres ecuaciones diferenciales.
Resolver éste sistema de ecuaciones diferenciales no es difícil, pero rápidamente se vuelve
computacionalmente caro conforme el número de ecuaciones en el sistema crece. Existe un segundo
obstáculo en la resolución del sistema: las tasas de reacción v1 y v2 dependen de factores
generalmente determinados por la teoría cinética de Michaelis-Menten, incluyendo los parámetros
cinéticos de las enzimas y las concentraciones de los metabolitos. Aislar enzimas y medir sus
parámetros cinéticos es una labor difícil, como lo es medir las concentraciones internas y las
constantes de difusión de los metabolitos dentro del organismo. Por ello el acercamiento de
ecuaciones diferenciales sirve únicamente para modelar el metabolismo los organismos más
estudiados.
El poder de la homeostasis
Gran parte del poder del ABF proviene de aplicar el principio de estado estacionario al problema.
Asumiendo que las concentraciones de los metabolitos en un sistema biológico permaneces casi
constantes en el tiempo podemos aplicar la condición homeostática de que las concentraciones de
metabolitos no cambian en el tiempo:

4. La matriz estequiométrica
Las ecuaciones diferenciales pueden ser representadas usando matrices. La matriz estequiométrica
de las ecuaciones de arriba es:
Las matrices estequiométricas se utilizan también en química, Análisis de Control Metabólico14 y
sistemas dinámicos,15 y son usualmente denotadas por la letra N (refiriéndose al número en relación
con la estequiometría, S está comúnmente reservada para la entropía). En Análisis de Balance de Flujo
se denotan por la S. En este punto es útil definir un vector v en el que cada componente representa la
tasa (o flujo a través) de la reacción respectiva dentro de la matriz estequiométrica.
Aplicación en la biología del sistema[editar]
El análisis del espacio nulo de matrices es común en álgebra lineal y muchos páquetes de software
como Matlab y Octave pueden ayudar con el proceso. Sin embargo, conocer el espacio nulo de S sólo
nos dice todas las posibles colecciones de vectores de flujo (o combinaciones lineales de ellos) que
balancean los flujos con la red metabólica. ABF tiene dos objetivos más: representar con precisión los
límites del sistema y regresar la distribución de flujo más cercana a la que ocurre naturalmente dentro
del sistema modelado.
Restricciones La matriz estequiométrica está casi siempre indeterminada, es decir, el espacio de
soluciones de Sv=0 es muy grande. El tamaño del espacio de soluciones puede reducirse y reflejar
mejor la biología del problema mediante la aplicación de restricciones sobre las soluciones.

5. Restricciones termodinámicas
En principio todas las reacciones son reversibles. Sin embargo en los sistemas vivos muchas reacciones
ocurren en una sola dirección. Esto puede deberse a la alta concentración de los reactivos comparados
con los productos de la reacción, y más frecuentemente a la mucho menor energía libre de los
productos comparados con los reactivos, lo que favorece masivamente la dirección directa de la
reacción. Para reacciones ideales:
Medición de tasas de flujo
Algunas tasas de flujo pueden ser medidas experimentalmente (vi,m) y los flujos dentro un modelo
metabólico pueden ser constriñidos, dentro de cierto rango de error (E), para asegurar que estos flujos
conocidos sean reproducidos con precisión en la simulación.
La medición de flujos en los bordes de la red (en la ingesta y excreción de metabolitos) es sencilla,
pero las mediciones en la región interna son más complejas y requieren técnicas que utilizan isótopos
de metabolitos marcados radiactivamente o visibles en Resonancia magnética nuclear o
Espectrometría de masa.
Optimización (la función objetivo)
Incluso después de la aplicación de restricciones existe un gran número de posibles soluciones al
problema de balance de flujo. Si se define un objetivo de optimización, se puede utilizar programación
lineal para encontrar una única solución óptima. El objetivo de optimización más común para la red
metabólica de un organismo sería escoger el vector de flujo v que maximiza el flujo a través de una
función de biomasa, compuesta de los metabolitos constitutivos del organismo puestos en la matriz
estequiométrica y denotada como vbiomasa o simplemente vb.
En el caso más general cualquier reacción puede ser definida como una función de biomasa con la
condición de ser maximizada o de ser minimizada si solo una solución óptima es deseada.
Alternativamente y en el caso más general, se define un vector C que contenga el conjunto de
reacciones ponderadas que el modelo de programación lineal debe maximizar o minimizar:
En el caso en el que se tiene una sola función de biomasa/reacción separada, dentro de la matriz
estequiométrica, C se simplifica a un vector de ceros con un valor de 1 (o cualquier valor diferente de
cero) en la posición correspondiente a esa función de biomasa. Cuando existen múltiples funciones
objetivas separadas C se simplifica a un vector de ceros con valores de ponderación en todas las
funciones objetivo.