Sac ky long hieu nang cao hplc

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO- HPLC
(High Performance Liquid Chromatography)

MỤC TIÊU HỌC TẬP
1. Giải thích được nguyên tắc hoạt động của máy HPLC
2. Trình bày được cấu tạo của máy HPLC
3. Mô tả được các kỹ thuật của HPLC: sắc ký phân bố, sắc
ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký trên gel, sắc ký ái
lực và sắc ký huỳnh quang.
4. Vận dụng tính toán các chỉ số trong điều kiện chạy HPLC.
3

Sắc ký được ĐN là pp tách một hỗn hợp các chất
thành các chất riêng.
Kỹ thuật này dựa trên sự khác nhau về tốc độ di
chuyển các chất của hỗn hợp qua pha tĩnh dưới ảnh
hưởng của một số dung môi hoặc khí (pha động).
4
SẮC KÝ

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời
năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ PP sắc
ký cột cổ điển.
• HPLC là một PP chia tách trong đó pha động là chất lỏng
và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia
dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất
mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng LKHH với
các nhóm chức HC
5

6
Carbohydrates
1. fructose
2. Glucose
3. Saccharose
4. Palatinose
5. Trehalulose
6. isomaltose
Zorbax NH2 (4.6 x 250 mm)
70/30 Acetonitrile/Water
1 mL/min Detect=Refractive Index
1
2
3
4
5
mAU
time
6

7
Separations
Separation in based upon differential
migration between the stationary and
mobile phases.
Stationary Phase - the phase which
remains fixed in the column, e.g. C18,
Silica
Mobile Phase - carries the sample
through the stationary phase as it
moves through the column.
Injector
Detector
Column
Solvents
Mixer
Pumps
High Performance Liquid Chromatograph
Waste

8
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Mixer
Pumps
Chromatogram
Start Injection
mAU
time
High Performance Liquid Chromatograph

9
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Mixer
Pumps
Chromatogram
Start Injection
mAU
time

10
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Pumps
Mixer
Chromatogram
Start Injection
mAU
time

11
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Pumps
Mixer
Chromatogram
Start Injection
mAU
time

12
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Pumps
Mixer
Chromatogram
Start Injection
mAU
time

13
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Pumps
Mixer
Chromatogram
Start Injection
mAU
time

14
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Pumps
Mixer
Chromatogram
Start Injection
mAU
time

15
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Pumps
Mixer
Chromatogram
Start Injection
mAU
time

16
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Pumps
Mixer
Chromatogram
Start Injection
mAU
time

17
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Pumps
Mixer
Chromatogram
Start Injection
mAU
time

18
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Pumps
Mixer
Chromatogram
Start Injection
mAU
time

19
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Pumps
Mixer
Chromatogram
Start Injection
mAU
time

20
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Pumps
Mixer
Chromatogram
Start Injection
mAU
time

21
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Pumps
Mixer
Chromatogram
Start Injection
mAU
time

22
Separations
Injector
Detector
Column
Solvents
Pumps
Mixer
Chromatogram
Start Injection
mAU
time

23
Separations
Tiêm
Detector
Cột
Dung môi
Bơm
Bắt đầu tiêm mẫu
mAU
Thời gian

24
The Chromatogram
Tiêm
to
tR
mAU
Thời gian
tR
Vùng diện tích (chiều cao)
để định lượng

Tại sao lại dùng HPLC
• Phân tích đồng thời
• Độ phân giải cao
• Độ nhạy cao
• Tính lặp lại tốt
• Điều kiện phân tích trung bình
• Dễ phân đoạn và tinh khiết
• Không độc hại
25

• Trọng lượng phân tử của chất tan
• Độ tan trong nước của chất tan
• Sự phân cực của chất tan
• Tính chất ion hóa, tính chất không ion của chất
tan
26
Các loại HPLC phụ thuộc vào:
2. PHÂN LOẠI HPLC

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng
trong HPLC, người ta chia HPLC thành các loại:
1. SK phân bố
2. SK trao đổi ion hiệu năng cao.
3. SK lỏng hiệu năng cao trên gel
4. SK hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)
5. SK ái lực
6. SK đồng phân quang học
27

• Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất quá
trình sắc ký.
29
Pha tĩnh Loại sắc ký
Chất hấp phụ SK hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo
Chất trao đổi ion SK trao đổi ion
Chất lỏng SK phân bố (SK chiết)
Gel SK gel hoặc rây phân tử

• Các loại HPLC:
1. Sắc ký phân bố
2. Sắc ký trao đổi ion
3. Sắc ký lỏng trên gel
4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)
5. Sắc ký ái lực
6. Sắc ký đồng phân quang học
30

2. Sắc ký trao đổi ion.
31

1. Sắc ký phân bố (partition chromatography)
SK phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích
được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất
rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá
lớn (<3000).
32
PHÂN LOẠI HPLC

33
Pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất
mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
• Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp
phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid
chromatography).
• Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên
kết
2.1. Sắc ký phân bố

• Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên
kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng do:
– Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha
động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và
gây nhiễm đối với hợp chất phân tích.
– Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên
người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient
dung môi.
34

Pha tĩnh
• Hay dùng: dẫn chất siloxan
• Tính chất phân cực phụ thuộc vào các nhóm thế:
- Pha tĩnh ko phân cực: nhóm thế là các gốc
hydrocarbon no hoặc thơm.
- Pha tĩnh phân cực: có các nhóm thế phân cực như
amino, nhóm –OH, nhóm cyano (-CN).
Chú ý: Thường chỉ bên pH từ 2-8. (các pH >8 thì chuyển
sang cột polymer) 35

Ảnh hưởng của pha tĩnh
37
37
C18 (ODS)
Mạnh
C8
MẪU
MẪU
MẪU
C4
Trung bình
Yếu

Dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha
động, Sk phân bố được chia 2 loại :
+ Sắc ký pha thường (SK pha thuận): Pha tĩnh phân
cực > Pha động
+ Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh phân cực < pha động.
38

• SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại SK trong đó pha tĩnh ít
phân cực hơn pha động. PP này dùng phân tích các HC từ ko
phân cực đến phân cực.
• Hầu hết các HCHC có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích
hợp cho phân tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong
SKPĐ là các DM phân cực, trong đó nước đóng vai trò quan
trọng, rẻ tiền. Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ
biến hơn SKPT.
39

Đặc điểm:
- Sắc ký pha thuận: Chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu
tiên → khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu
giảm.
- Sắc ký pha đảo: Ngược lại, các chất phân cực được rửa giải
đâu tiên → khi tăng độ phân cực của pha động thì thời gian
lưu tăng lên.
40

Mối quan hệ giữa độ phân cực và thởi gian lưu
41

Nguyên tắc chọn pha tĩnh, pha động
Chọn pha tĩnh và pha động dựa vào độ phân cực
của các thành phần tham gia theo nguyên tắc:
1. Độ p/cực của chất PT hợp với độ p/cực của pha tĩnh,
và khác xa độ p/cực của pha động.
2. Độ p/cực của chất PT hợp với độ p/cực của pha động
và khác nhiều độ p/cực của pha tĩnh.
42

Pha tĩnh của
SK pha đảo
43

Ứng dụng: chủ yếu SK pha đảo
44
Lĩnh vực Đối tượng phân tích
Dược Kháng sinh, giảm đau, an thần, steroid
Hóa sinh Aminoacid, protein, lipid, carbonhydrat
Thực phẩm Chất làm ngọt, phụ gia, chất chống oxy hóa..
Hóa CN HC thơm, chất màu, chất hđ bề mặt
Môi trường Các chất trừ sâu diệt cỏ, dẫn chất phenol
Hóa pháp lý Các chất độc, thuốc ngủ
Y học lâm sàng Acid mật, các chất chuyển hóa của thuốc

45

2.2. Sắc ký trao đổi ion
• Dựa vào lực hút của ion chất tan và vị trí mang điện tích
trên pha tĩnh.
• Chất trao đổi anion có nhóm mang điện tích (+) trên pha
tĩnh hút anion chất tan.
• Chất trao đổi cation có nhóm mang điện tích (-) trên pha
tĩnh hút cation chất tan.
• Chất trao đổi ion là polymer không tan trong nước mang
các nhóm trao đổi ion.
46

47

48

Có 2 loại nhựa trao đổi ion:
- Nhựa trao đổi cation: loại acid mạnh mang nhóm acid
sulfonic, loại yếu mang nhóm acid carboxylic.
- Nhựa trao đổi anion: có nhóm base amin liên kết với
phân tử polymer. Chất trao đổi base mạnh có nhóm amin
bậc 4, dạng base yếu có nhóm amin bậc 2 hoặc bậc 3.
49

50
copolymer styren - divinyl benzen

Một số nhóm hoạt động của nhựa trao đổi ion
51
Loại Viết tắt Tên Cấu tạo
1. Trao đổi
cation
- Acid mạnh
-Acid trung bình
- Acid yếu
P
SE
P
CM
Sulfopropyl
Sulfoethyl
Phosphat
Carboxymethyl
-O(CH2)3- SO3H
-O(CH2)2-SO3H
-OPO3H
-OCH2-COOH
2. Trao đổi
anion
- Base mạnh
Base trung bình
- Base yếu
TEAE
QAE
DEAE
PAB
Trimethylaminpethyl
Diethyl (2-
hydroxypropylquartern
aryamino
Diethylaminoethyl
P-amino benzyl
-O(CH2)N+(CH2CH3)3
-O(CH2)2N+(CH2CH3)2
CH2CH(OH)-CH3
-O(CH2)2N(CH2CH3)2
-O-CH2-C6H4-NH2

Ứng dụng:
52

- Dùng cân bằng trao đổi ion để tinh chế nguyên liệu
loại tạp chất. Ví dụ các ion kim loại M2+ và anion X-
để điều chế nước tinh khiết (nước khử ion)
-Dùng nhựa trao đổi ion để tăng nồng độ của các thành
phần vi lượng trong dung dịch đủ cho phân tích.
- Áp dụng cho sắc ký
53
Ứng dụng:

54

• Nguyên lý: Tách riêng các chất dựa vào KT phân tử.
• Ko có liên kết hoặc tương tác hấp phụ với pha tĩnh.
• Các gel có vai trò như các sàng phân tử các chất có
KTPT khác nhau được tách riêng ra. Có các loại:
- SK thấm gel: dùng gel để tách các polymer hòa
tan/dung môi. Pha động kỵ nước.
- Sắc ký lọc gel: dùng gel để tách các polymer sinh học.
Pha động ưa nước
55
2.3. Sắc ký lỏng trên gel

56

57

58

Pha tĩnh (có các lỗ xốp):
• Các loại gel mềm hay dùng: cellulose, dextran,
agarose hoặc poly acrylamid.
• Các gel cứng bán cứng: polystyren, alkyl dextran
trong môi trường không chứa nước.
60

61

63

• Nguyên tắc tách là sự hấp phụ của chất phân tích
trên bề mặt pha rắn.
• Pha tĩnh là chất rắn phân cực. Chất phân tích tranh
chấp với pha động ở các vị trí hấp phụ trên bề mặt
pha tĩnh.
64
2.4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)

65
Sự khác nhau giữa SK phân bố và SK hấp phụ

66
Pha tĩnh
Tương tác
mạnh
Tương tác yếu
Mobile Phase
2
1

• Pha tĩnh:
- Slica: hay dùng/ SK pha thuận. Bề mặt có nhiều
nhóm silanol dạng tự do. Hấp phụ mạnh, pH ổn định
2-8.
- Alumina: pH ổn định 2-12. Tách các base hữu cơ.
- Titan oxyd và zirconi oxyd: pH ổn định rộng.
* Pha động: Sử dụng các dung môi hữu cơ thông dụng
67

69

70

71
• Ứng dụng:
- Thường tách các chất phân tích có M dưới 5000, ít
tan /nước hoặc trong hh nước-dmhc không thích hợp
với SK pha đảo.
- Tách các đồng phân vị trí các HCHC.
- Phân tích các chế phẩm dầu mỏ, thực phẩm, dược
phẩm.

72

2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography)
Dùng TT liên kết đặc biệt để làm sạch hoặc phân
tích các thành phần trong hỗn hợp. Lưu giữ chất phân
tích là do tương tác thuận nghịch và chọn lọc các cặp
có trong cơ thể sống như: Kháng nguyên – kháng thể,
enzym –cơ chất, hormon – receptor…
73

• Cố định một thành phần của cặp trên một chất mang rắn
làm pha tĩnh đưa vào cột. Mẫu phân tích có thành phần
thứ 2 đưa vào cột nhờ pha động (y/cầu pH, dd đệm). Khi
mẫu phân tích qua cột, các thành phần khác khuếch tán
dễ dàng nên được rửa giải vào pic các chất ko lưu giữ.
• Tương tác đặc hiệu giữa phần chọn lọc và phối tử ái lực
trong cột.
• Nhờ dd đệm rửa giải phá vỡ liên kết và đưa thành phần
chọn lọc ra cột.
76

78

79

• Phối tử ái lực: yêu cầu đặc hiệu cao. Một số phối tử hay dùng:
80
Phối tử Chất liên kết
1. Phối tử nguồn gốc sinh học
- Kháng thể
- Chất ức chế, cơ chất, coenzyme
- Protein A/ Protein G
- Kháng nguyên
- Enzym
- Đường, glucoprotein, glucolipid
- Kháng thể
2. Phối tử hóa học
- Boronat
- Chất màu triazin
- Phức càng cua kim loại
- Đường, glucoprotein, các hc diol
- Protein có liên kết nucleosid, các
enzym
- Acid amin, peptid, protein

• Các loại hình sắc ký ái lực:
- SK ái lực sinh học: chủ yếu tinh chế enzym
- SK ái lực miễn dịch: Phối tử là kháng nguyên hoặc
kháng thể, chủ yếu tinh chế và PT các chất có nguồn
gốc sinh học.
- SKAL phối tử phẩm màu: dùng triazin hoặc
triphenylmethan làm phối tử ái lực để tinh chế enzym,
hoặc các PT sinh học khác.
81

82

83

2.6. Sắc ký đồng phân quang học
• Mục đích: Tách các đồng phân quang học.
• Pha tĩnh thường dùng là slica có gắn cyclodextrin có
khả năng liên kết với các đồng phân đối quang ở các
mức năng lượng khác nhau.
84

85

86

87

88

Tóm lại: Cơ chế của các loại HPLC
89
SK hấp phụ
SK phân bố
SK đồng phân quang học
SK trao đổi ion
SK ái lực
SK trên gel

3. HỆ THỐNG MÁY HPLC
• Bao gồm các bộ phận:
- Hệ thống cấp pha động
- Bơm sắc ký lỏng
- Bộ phận tiêm mẫu
- Cột và pha tĩnh
- Detector
- Hệ thu nhận và xử lý dữ liệu
91

92
System Controller
UV detector
Auto sampler
Column Oven
Pump Unit
Reservior Tray
Degassing Unit
Low pressure
gradient device

- Hệ thống bơm
- Detector
93

3.1. Hệ thống cấp pha động
Pha động thường là 2 dung môi hòa tan vào nhau
để tách với độ phân giải phù hợp. Có 2 cách dùng pha
động rửa giải:
• Đẳng dòng: thành phần ko thay đổi/ qt sắc ký
• Gradient: Tỷ lệ dung môi thay đổi theo chương
trình đã định.
94

95
95
Long Time Analysis
MeOH / H2O = 6 / 4
( Column : ODS )
Bad Separation MeOH / H2O = 8 / 2
Đẳng dòng
Đẳng dòng
MeOH%
Time
Gradient

96
96
Isocratic System
Simple system with one pump and one solvent reservoir.
If more than one solvent is used, solvents should be premixed.
Data
processor
Pump
Injector
Column
Oven
Detector
Mobile Phase

97
High-pressure Gradient System
Data
processor
pump
pump
pump
A
B
C
Injector
Column
Oven
Detector
Mixer
• Excellent gradient accuracy.
• 2-3 pumps required - one pump per solvent used.

• Một vài loại khí tan /DMHC, khi áp suất cao được
bơm, sự hình thành bong bóng khí tăng làm ảnh
hưởng đến qt tách, giảm hiệu lực cột, nhiễu đường
nền và hình dạng của đỉnh.
• Do đó việc loại khí là rất quan trọng và nó có thể
được thực hiện bằng nhiều cách khác nhau: chạy
siêu âm, sục khí trơ heli…
98

• Lọc chân không: không phải là luôn luôn đáng tin
cậy và đầy đủ.
• Đưa khí Heli: cho khi heli vào dung môi, rất hiệu
quả nhưng Heli rất đắt.
• Siêu âm: sử dụng siêu âm làm chuyển đổi tần số cực
cao thành rung động cơ học
99

- Hệ thống bơm
- Detector
100

• Tạo áp suất khoảng 5000 psi trở lên
• Các vật liệu trong bơm chịu được tác động của các
dmôi (ko bị ăn mòn). Bơm, van mẫu, cột… được chế
từ kim loại titan (tránh ảnh hưởng đến mẫu sinh học)
• Đảm bảo tốc độ dòng chảy dao động từ 0,01 -10 ml /
phút
• Bơm phải có khả năng lấy dmôi từ một bình chứa hoặc
nhiều bình chứa có chứa dmôi khác nhau cùng một lúc.
102
3.2. Hệ thống bơm

103
Các loại bơm
trong HPLC
Bơm đẩy một
piston
Bơm đầy
nhanh
Bơm kéo đẩy

104
• Nhược điểm: dòng chảy xuất hiện xung dòng, gây
nhiễu detector, giảm độ nhạy.
Bơm đẩy một pistong

105
105
motor and cam
plunger
plunger seal
check valve
pump head
5 - 50µL
out
in
Mobile phase
check valve

106
106
106
motor and cam
plunger
plunger seal
check valve
pump head
5 - 50µL
out
in
Mobile phase
check valve

• Dung môi được bơm qua lại
bằng một động cơ piston
• Hai van kiểm tra mở và đóng
kiểm soát lưu lượng
• Piston tiếp xúc trực tiếp với
dung môi
• Thể tích nội bộ nhỏ 35-
400μL
• Áp suất ra cao đến 10.000
psi
• Khả năng thích ứng tạo hệ
dung môi gradient và tốc độ
dòng chảy liên tục 107

Bơm làm đầy nhanh
108
Hay dùng
Rẻ

Bơm kéo đẩy kéo
Kết nối hai bơm
một pistong
109

- Hệ thống bơm
- Detector
110

3.3. Hệ tiêm mẫu
• Dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay
ở đầu cột mà ko cần dừng dòng bằng một van tiêm có
vòng chứa mẫu.
• Van tiêm tự động hóa, máy tính điều khiển, kiểm soát
hệ bơm mẫu tự động
112

- Hệ thống bơm
- Detector
113

3.4. Cột và pha tĩnh
115
Đầu vào
Cột bảo vệ
Vỏ bảo vệ
bằng nhôm
Đầu ra
Cột chính

116
Cột chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh, chất dẻo
- Dài 10-30cm, đường kính trong 4-10 mm.
- Cột nhồi có cỡ hạt 5-10micromet
- Chất nhồi cột: silic dioxyd, các hạt gel, nhôm oxyd,
polymer xốp, nhựa trao đổi ion… tùy thuộc vào sắc
ký.

• Đặt trước cột sắc ký
• Bảo vệ và kéo dài tuổi thọ của cột tách.
• Ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại nhưng
có kích thước hạt lớn hơn
117
Cột bảo vệ (guard column)

Điều nhiệt cột
• Để có được sắc ký đồ tốt hơn và có thể lặp lại được,
cần duy trì nhiệt độ cột ổn định.
• Thường trong sắc ký lỏng, vận hành ở RT ko cần
điều nhiệt cột (sắc ký khí phải có). Các máy HPLC
hiện đại thường có thêm hệ thống điều nhiệt cột có
thể lên đến 150oC
118

- Hệ thống bơm
- Detector
119

3.4. Detector
• Phát hiện các chất phân tích có thể dựa vào:
• Đáp ứng chọn lọc với chất phân tích khi detector hấp
thụ bức xạ UV hoặc huỳnh quang.
• Tính chất chung của chất phân tích trong pha động,
như detector chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện
120

Hiện nay có nhiều loại detector, thường dùng
6 loại thuộc 2 nhóm quang học và điện hóa:
1. Detector hấp thụ UV-VIS
2. Detector huỳnh quang
3. Detector chỉ số khúc xạ
4. Detector tán xạ bay hơi
5. Detector đo dòng
6. Detector hấp thụ UV-VIS
121
3.4. Detector

• Detector hấp thụ UV-VIS
- Phổ biến nhất, dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV-VIS
Ba cấu hình của detector hấp thụ UV-VIS:
+ Detector có bước sóng cố định
+ Detector đo ở bước sóng thay đổi: có bộ thay đổi bước
sóng
+ Detector mảng diod
122
3.4. Detector

124
Spectra
Absorbance
Chromatogram

• Detector chỉ số khúc xạ
126
Sample
Reference
Photodiode
W Lamp
Refraction
3.4. Detector

• Detector huỳnh quang: Rất nhạy, chọn lọc. Dùng trong
phân tích vết.
128
128
3.4. Detector

• Ưu điểm:
- Độ nhạy cao hơn máy dò UV-Vis
- Tính chọn lọc cao vì ít chất có huỳnh quang
• Nhược điểm:
- Khó đoán được huỳnh quang
- Bị ảnh hưởng lớn bởi môi trường: Dung môi, pH,
nhiệt độ, độ nhớt, cường độ ion, khí tan
129
129

Detector tán xạ
bay hơi:
Là detector vạn
năng đ/ứng với
bất kỳ chất ptích
nào kém bay hơi
hơn so với pha
động của sk lỏng
130
3.4. Detector

Detector điện hóa: Phát hiện chất ptích dựa vào độ dẫn
điện của pha động có mặt các chất ptích ion hoặc dòng
điện tạo thành do p/ứ oxy hóa khử ở điện thế xác định
Có 2 loại:
- Detector độ dẫn: Thích hợp sk ion, chất phân tích là ion
mang điện.
- Detector đo dòng: Loại này nhạy nhất, điện cực dễ bị
nhiễm bẩn
131
3.4. Detector

4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG
4.1. Hằng số cân bằng K
Là tỉ lệ phân bố giữa 2 pha được tính như sau:
Với CS: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh.
CM: nồng độ cấu tử trong pha động.
Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất
phân tích.
132

4.2. Thời gian lưu
tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi
vào cột đến detector.
tO : thời gian để cho chất nào đó không
có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; cũng là
thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối
cột (còn gọi là thời gian lưu chết).
tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử.
133

134
4.3. Hệ số dung lương k’
Với VS : thể tích pha tĩnh
VM : thể tích pha động
Nếu k’~ 0, tR~ tM: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng
giữ chất lại.
Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời
gian phân tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù.
Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp
phức tạp, k’ có thể chấp nhận từ 1-20.

4.4. Số đĩa lý thuyết N
đặc trưng cho khả năng tách mũi
sắc ký của các cấu tử trên cột.
N càng lớn, hiệu năng tách càng cao.
Với:
W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi
W: chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi
135

4.5. Độ chọn lọc
Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.
Thông thường, α dao động 1,05-2 là tốt. Nếu α càng lớn
thì thời gian chạy sắc ký sẽ kéo dài.
136

4.6. Độ phân giải
Là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc
ký: sự giải hấp phụ, sự chọn lọc và hiệu quả tách. Nó
được xác định qua phương trình sau:
137

Bài 1. Khi chạy sắc ký một hỗn hợp 2 chất A và B thu
được thời gian lưu lần lượt là 10,8 phút và 11,7 phút,
chiều dài của cột là 40 cm. Một chất không lưu giữ qua
cột ở 1,7 phút. Chiều rộng đáy pic của A và B tương ứng
là 1,51 phút và 1,65 phút. Tính:
a. Tính số đĩa trung bình?
b. Hệ số chọn lọc cho A và B?
c. Độ phân giải?
138

Tên chất tR (phút) W1/2 (phút)
Chất không lưu giữ 1,9 -
A 10,1 0,77
B 10,4 0,83
C 13,5 1,07
139
Bài 2. Dữ kiện sau thu được bằng sắc ký trên cột dài 40 cm
Tính:
a. Số đĩa lý thuyết trung bình của cột?
b. Chiều cao của đĩa?
c. Độ phân giải giữa: B và A, A và C.

Sac ky long hieu nang cao hplc

Recommandé

Recommandé

Contenu connexe

Tendances

Tendances (20)

Similaire à Sac ky long hieu nang cao hplc

Similaire à Sac ky long hieu nang cao hplc (20)

Plus de Nguyen Thanh Tu Collection

Plus de Nguyen Thanh Tu Collection (20)

Dernier

Dernier (20)

Sac ky long hieu nang cao hplc