Lineamientos 2013 vigilancia LABORATORIO DENGUE

Dengue–RNLSP/InDRE Página 1 de 77
Versión No. 02 Julio 2013
LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR
LABORATORIO DE DENGUE
DGE-InDRE–RNLSP
2013

Primera edición, 2013
DENGUE–RNLSP
Este documento fue avalado por los representantes de las
instituciones que conforman el Grupo Técnico Interinstitucional del
Comité Nacional de Vigilancia Epidemiológica (CoNaVE).
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“LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE DENGUE”
VERSIÓN NO. 01. INDRE, 2013.
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M EN C IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA
M. EN C. MAURICIO VÁZQUEZ PICHARDO
COORDINADOR DE ENFERMEDADES VIRALES ZOONÓTICAS Y POR VECTOR

LINEAMIENTOS PARA LA
VIGILANCIA POR
LABORATORIO DE DENGUE
DGE-InDRE–RNLSP
2013

ÍNDICE
INTRODUCCIÓN .....................................................................................................................7
ANTECEDENTES.....................................................................................................................7
RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE DENGUE.............9
MARCO LEGAL........................................................................................................................9
OBJETIVO GENERAL...........................................................................................................10
OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................................................................10
ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA
VIGILANCIA DE DENGUE ..................................................................................................10
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE DENGUE ................................12
FUNCIONES DEL LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL .............................12
FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS ESTATALES DE SALUD PÚBLICA (LESP) 13
DEFINICIONES OPERATIVAS............................................................................................14
TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS .....................................................................15
ALGORITMO DIAGNÓSTICO .............................................................................................17
ESTÁNDAR DE CALIDAD....................................................................................................26
CAPTURA DE RESULTADOS ..............................................................................................28
PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO...................................31
CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO............................................34
BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO.................................................................................35
INDICACIONES ESPECIALES PARA LOS LABORATORIOS ESTATALES QUE AÚN
NO REALICEN RT-PCR MULTIPLEX EN TIEMPO REAL PARA DETECCIÓN E
IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DE VIRUS DENGUE..............................................35
LABORATORIOS ESTATALES QUE YA REALICEN RT-PCR MULTIPLEX EN
TIEMPO REAL PARA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DE VIRUS
DENGUE..................................................................................................................................36
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ...................................................................................37
BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................39
ANEXO I. TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS...............41
BIOLOGÍA MOLECULAR.....................................................................................................58
ANEXO II. CARACTERÍSTICAS DE LOS ESTUCHES COMERCIALES .......................73
ANEXO III. FORMATO PARA ENVÍO DE MATERIAL BIOLÓGICO AL InDRE ........77

INTRODUCCIÓN
Las enfermedades virales transmitidas por vector están ubicadas como las
enfermedades a nivel mundial con mayor repercusión en Salud Pública.
Actualmente la Organización Mundial de la Salud (OMS) cataloga a las
Arbovirosis como problema prioritario en Salud y en 1998 son consideradas
como la décima causa de muerte en el mundo por enfermedades infecciosas. La
OMS estima que los cuatro serotipos del virus del dengue constituyen una
amenaza para el 40% de la población mundial que habitan en 112 países
tropicales y subtropicales. Actualmente se considera que existen 50 millones de
casos en todo el mundo, de los que aproximadamente 400,000 son casos graves
y 25,000 fallecen a causa de esta enfermedad.
En el Continente Americano el Dengue tiene un surgimiento importante en los
servicios de salud desde 1989, donde el número de casos aumentó un 60% en
comparación con el lustro anterior. En México es la principal enfermedad viral
transmitida por vector.
El Dengue es una enfermedad febril, transmitida por hembras hematófagas del
género Aedes aegypti, la enfermedad es de curso autolimitado, incapacitante y
con riesgo de complicaciones letales; la cual se puede presentar de manera
benigna conocida como Fiebre por Dengue (FD) y de manera grave conocida
como Fiebre Hemorrágica por Dengue (FHD).
El presente documento establece los lineamientos de operación para la
Vigilancia Epidemiológica basada en Laboratorio para Dengue, los cuales
incluyen funciones y responsabilidades por nivel; toma, manejo, y envío de
muestras, así como las metodologías para el análisis de muestras, evaluación del
desempeño, banco de muestras así como los estándares de calidad.
ANTECEDENTES
La conformación de la Red de Diagnóstico de Dengue se inició en 1995 con 7
Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP). El Laboratorio de Arbovirus y
virus hemorrágicos del Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos
(InDRE) ha ofrecido a esta Red cursos de capacitación, capacitaciones en
servicio, supervisiones y asesorías, incluyendo el apoyo con equipo e insumos en
caso de emergencias epidemiológicas y desastres. También se apoya a los LESP
con el envío de reactivos e insumos para realizar la determinación de
anticuerpos IgM, anticuerpos IgG y para detección de antígeno viral NS1
comerciales. Desde 1999 el Laboratorio inició un programa de control de calidad
en el que la Red enviaba al InDRE el 100% de las muestras positivas y 10% de
las muestras negativas para Dengue. En el 2002 la Red Nacional de
Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) se incorporó al Programa Caminando a
la Excelencia para evaluar el desempeño de los LESP respecto a los programas
prioritarios de la salud para fomentar su desarrollo. En el año 2003 se empieza
a realizar la evaluación del desempeño a través del envío de paneles de eficiencia
y se establece el envío únicamente de probable Fiebre Hemorrágica por Dengue
o Dengue Grave para control de calidad o en su caso muestras con serotipo no
identificado en los últimos años en el estado. Esta evaluación del desempeño se
actualiza y mejora, implementando paneles algorítmicos en julio de 2012, que

evalúa de manera integral el desempeño de cada LESP con respecto al algoritmo
de diagnóstico vigente y a partir de 2013 serán incluidos los paneles
algorítmicos únicos.
Durante abril del 2008 el Laboratorio implementa un nuevo algoritmo de
diagnóstico que incluye la detección de antígeno NS1 (glicoproteína no
estructural 1 del virus dengue) en formato de Ensayo por Inmunoabsorción
Ligado a Enzimas (ELISA); metodología que es aplicable en muestras obtenidas
únicamente en fase aguda de la enfermedad y que tiene el objetivo de brindar
resultados oportunos y confiables. Los resultados positivos de esta metodología,
son aprovechados para realizar la Vigilancia Virológica (tipificación del virus)
en un porcentaje de muestras mediante la Prueba de Retro-transcripción y de la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-qPCR) en tiempo real.
En marzo de 2010, el Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos del
InDRE, capacitó al personal de 28 laboratorios estatales que conforman la
RNLSP para dar a conocer el protocolo “Detección y Serotipificación de Virus
Dengue Mediante RT-PCR Multiplex en tiempo real” validado por el Centro de
Control y Prevención de Enfermedades, División Dengue [CDC, por sus siglas en
Inglés-Dengue Branch] de San Juan Puerto Rico, con la finalidad de que cada
LESP realice la vigilancia virológica en su entidad. El seguimiento a la
implementación de esta metodología se realizó mediante la aplicación de una
cédula. Trece LESP iniciaron la etapa de control de calidad para RT-PCR tiempo
real para Dengue durante el 2011: Baja California Sur, Chiapas, Guerrero,
Morelos, Nuevo León, Oaxaca, Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí,
Tabasco, Chihuahua, Sonora, Jalisco, Veracruz y Yucatán. A partir de 2012 se
incorporaron 6 LESP a la Red de Vigilancia Virológica de Dengue (Michoacán,
Campeche, Sonora, Sinaloa, Zacatecas y Guanajuato), contando hasta ahora con
21 LESP. Actualmente todos los estados antes mencionados cuentan con la
metodología liberada, debido a que cumplieron con los parámetros de
concordancia requeridos por el Laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos
(promedio de 95% de concordancia en fase de control de calidad y en paneles de
evaluación externa del desempeño (PEED). Los LESP de Nayarit y Colima
actualmente están en fase de control de calidad con resultados del más del
99.5% de concordancia, motivo por el cual en los siguientes meses recibirán la
notificación de liberación de la metodología. El LESP de Hidalgo comenzó en
julio de 2013 la fase de control de calidad, obteniendo un resultado del 100% de
concordancia en el PEED “SMART-ONLY-DEN” 2013-01. Al momento actual el
LESP de Chihuahua, ya cuenta con la implementación de la técnica, pero por ser
un estado no endémico y por no tener muestras positivas al antígeno NS1, la
liberación de la técnica estuvo basada en la aplicación de un panel para la
evaluación externa del desempeño, mismo que obtuvo un resultado
sobresaliente (90-100% de concordancia); este mismo lineamiento aplicará para
aquellos LESP que estén en la misma situación como actualmente se encuentra
el LESP de Durango quien obtuvo 100% de concordancia en el PEED “SMART-
ONLY-DEN” 2013-01. En caso de que él porcentaje de concordancia del panel
no cumpla con los requerimientos, el método no será liberado. Esto último
permitirá que dichos estados tengan habilitados los métodos analíticos las
herramientas para poder utilizarlos ante cualquier contingencia, al presentarse
casos positivos de NS1. Todos los LESP con metodología molecular liberada son
capaces de realizar la vigilancia intencionada directamente en mosquitos

trasmisores del virus (vigilancia entomo-virológica). Esta última deberá ser
realizada en completa coordinación con el InDRE (Laboratorio de Arbovirus y
virus hemorrágicos y el Laboratorio de Entomología), el Programa de Control de
Vectores Nacional y Estatal.
RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE
DENGUE
Los estados de color rojo son aquellos que cuentan con la metodología
implementada de RT- PCR Múltiplex en tiempo real y los estados de color
blanco están en fase de implementación. Estrella color azul indica la
implementación de aislamiento viral.
Los estados de color verde cuentan con la detección serológica básica mediante
detección de antígeno NS1 y anticuerpos IgM, y/o IgG.
Fig. 1. Marco analítico para diagnóstico serológico y molecular de
dengue (31 estados)
MARCO LEGAL
1. Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF
05/02/1917, Última Reforma D.O.F. 15/02/2012.
2. Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y
141. DOF 7/02/1984, Última Reforma DOF 07/06/2012.
3. NORMA Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia
epidemiológica. DOF: 19/02/2013

4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Protección
ambiental-salud ambiental-residuos peligrosos biológico-infecciosos-
clasificación y especificaciones de manejo.
5. NORMA Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005, Que establece las
características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados
de los residuos peligrosos. DOF: 23/06/2006.
6. Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010 para la Vigilancia
Epidemiología, Prevención y Control de Enfermedades Transmitidas por
Vector.
7. Reglamento Interior de la Secretaría de Salud, publicada en el Diario Oficial
de la Federación el 19 de enero de 2004, última reforma publicada DOF 10
de enero de 2011
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Establecer los procedimientos para la aplicación del algoritmo de diagnóstico
por Laboratorio de Fiebre por Dengue (FD) y Fiebre Hemorrágica por Dengue
(FHD).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Brindar información oportuna y veraz al Sistema Nacional de Vigilancia
Epidemiológica (SINAVE).
 Establecer el manejo adecuado de la información generada por laboratorio,
para la toma de decisiones y acciones a través de RNLSP.
 Realizar una rectoría a nivel nacional respecto al diagnóstico por laboratorio
para Dengue, que indique claramente funciones y responsabilidades en cada
nivel.
 Conformar una RNLSP para Dengue, con personal altamente capacitado y
con metodologías de actualidad, capaz de responder oportunamente
cualquier contingencia a nivel nacional.
ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA
LA VIGILANCIA DE DENGUE
El marco analítico de la RNLSP para el diagnóstico de esta enfermedad está
conformado por el diagnóstico serológico (31 LESP realizan determinación de
anticuerpos IgM y determinación de antígeno NS1; 23 realizan también
determinación de IgG, como marcador de reinfecciones activas, únicamente en
regiones endémicas); todos los LESP tienen liberadas las tres metodologías
serológicas. Dos LESP (Sonora y Veracruz) realizan aislamiento viral e
identificación de serotipos por Inmunofluorescencia y actualmente 21 LESP
tienen implementada y liberada la vigilancia virológica mediante RT-PCR en
tiempo real.

Actualmente los estados de Coahuila, Edo de México, y Puebla, están en fase de
implementación y control de calidad de la vigilancia virológica mediante RT-
PCR. Los estados de Aguascalientes, Baja California y Tlaxcala, debido a la
ausencia del vector, no son entidades consideradas para la implementación de la
vigilancia virológica; en el D.F., el InDRE lleva a cabo cualquier identificación
de casos importados que viajaron a zonas endémicas de la enfermedad.

Fig. 2 Flujo de trabajo de la RNLSP para el diagnóstico de Dengue
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE DENGUE
FUNCIONES DEL LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL
El Laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos del InDRE, es el Laboratorio
Nacional de Referencia y el rector normativo para el Diagnóstico de Dengue en
México. Las funciones que le competen son las siguientes:
 Proporcionar servicios confiables de diagnóstico, referencia y control de
calidad de Dengue, dentro de los estándares de servicio indicados y ser el
laboratorio de excelencia y líder.
 Coordinar la RNLSP de Dengue, mediante un verdadero análisis de la
información generada.
 Promover una visión objetiva y autocritica, que permita la detección de áreas
de oportunidad para implementar mejoras continuas en la determinación de
anticuerpos IgM, IgG y antígeno NS1, aislamiento y detección molecular de
dengue y otros Arbovirus.

 Mantener y mejorar algoritmos de diagnóstico y referencia.
 Incorporar nuevas metodologías para el diagnóstico diferencial de Dengue y
otros Arbovirus.
 Reglamentar los criterios de interpretación de resultados, que permitan
generar resultados confiables para la toma de decisiones.
 Monitorear continuamente el desempeño de la Red Nacional de Laboratorios
de Diagnóstico de Dengue, mediante la aplicación del PEED.
 Realizar capacitación en servicio para la formación de recursos humanos
altamente capacitados en el diagnóstico de Dengue.
 Supervisar y asesorar directamente a los LESP.
 Desarrollar investigación operativa y desarrollo tecnológico que sea
aplicable, en apoyo al SINAVE.
FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS ESTATALES DE SALUD
PÚBLICA
 Realizar procesos analíticos para la detección de infecciones causadas por
Dengue.
 Asegurar la calidad del diagnóstico en el laboratorio, mediante los
procedimientos, métodos y técnicas que el InDRE promueve.
 Emitir en tiempo y forma los resultados de los exámenes de laboratorio.
 Referir muestras al InDRE para diagnóstico, referencia y control de calidad.
 Referir muestras de banco de sueros al InDRE, para mantener los PEED.
 Generar evidencia y notificar oportunamente al órgano normativo estatal y/o
nacional los casos confirmados y descartados.
 Participar como mecanismo de apoyo técnico, proporcionando la
información relacionada y requerida por el programa sustantivo del área de
su competencia.
 Seleccionar las muestras para control de calidad del área de influencia del
LESP.
 Compilar las muestras de las Jurisdicciones y redes de apoyo.
 Capacitar a epidemiólogos estatales, jurisdiccionales y a todo personal o
institución del Sector Salud que lo demande en relación a toma, manejo y
envío de muestras a través del monitoreo del desempeño en el área de
influencia.
 Recabar, analizar y evaluar la información sobre la prestación de servicios de
diagnóstico de Dengue en su estado.
 Supervisar el manejo del equipo asignado conforme a lo establecido en los
documentos autorizados y manuales de operación correspondiente para el
aseguramiento de la calidad en la red estatal.
 Proporcionar información de importancia mediante informes, notas
informativas o reportes para que sea difundida a las instancias estatales y
nacionales correspondientes contribuyendo a la Vigilancia Epidemiológica
Estatal y Nacional de manera veraz y oportuna.
 Promover capacitación continua de su personal.
 Colaborar y/o elaborar trabajos de investigación operativa que proporcione
información prioritaria estatal, una vez que los protocolos sean aceptados
por los comités de investigación.

 Participar en la elaboración y actualización de los manuales técnicos
referentes a diagnóstico y temas especializados (bioseguridad, manejo de
residuos peligrosos biológico-infecciosos, etc.) para uso en el ámbito estatal
y local.
DEFINICIONES OPERATIVAS
Para los propósitos de la vigilancia epidemiológica se han elaborado
definiciones operacionales de caso, a efecto de unificar los criterios para la
detección, notificación y clasificación de los casos de Dengue. La especificidad
del diagnóstico está dada por los estudios de laboratorio, por lo que es
importante contar con los resultados virológico, serológicos y de gabinete para
el adecuado seguimiento del caso hasta su clasificación final.
Según los lineamientos para la Vigilancia Epidemiológica de Fiebre por Dengue
y Fiebre Hemorrágica por Dengue, las definiciones operativas son las siguientes:
Vigilancia Epidemiológica
Es el estudio permanente y dinámico del estado de salud en la población y tiene
como propósito presentar opciones para la toma de decisiones. Desde el punto
de vista operativo incluye la recopilación, procesamiento y análisis de los daños
y riesgos en salud.
Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SINAVE)
Corresponde a la Dirección General Adjunta de Epidemiología (DGAE)
coordinar la elaboración de las normas y procedimientos para la vigilancia
epidemiológica correspondiente. El SINAVE capta, registra y analiza datos de
morbilidad, mortalidad y daños y riesgos a la salud en este caso,
específicamente para Dengue a través del Sistema Único de Información para la
Vigilancia Epidemiológica (SUIVE), apoyado a su vez en:
- La notificación semanal de casos nuevos de enfermedades
- Los sistemas especiales de vigilancia epidemiológica
- El Sistema Epidemiológico Estadístico de las Defunciones (SEED)
Caso sospechoso de Fiebre por Dengue o Dengue no Grave
Toda persona de cualquier edad que resida o proceda de una región en la que
haya transmisión de la enfermedad y que presente cuadro febril inespecífico o
compatible con infección viral.
Caso probable de Fiebre por Dengue o Dengue Grave
Todo caso sospechoso que presente fiebre y dos o más de las siguientes
características: cefalea, artralgias, mialgias, exantema, dolor reto-ocular. En
menores de 5 años, el único signo a considerar puede ser la fiebre.
Caso confirmado de Fiebre por Dengue o Dengue no Grave
Todo caso probable en el que se confirme infección reciente por virus de Dengue
mediante técnicas de laboratorio, esté asociado epidemiológicamente a otro
caso confirmado o no se disponga de resultado de laboratorio.

Caso probable de fiebre hemorrágica por Dengue o Dengue grave
Toda persona que además de un cuadro probable de fiebre por Dengue,
desarrolle fiebre y una o más de las siguientes características: datos de fuga de
plasma, o datos de fragilidad capilar, o hemorragias, o trombocitopenia menor a
100,000 plaquetas por mm3 o hemoconcentración con uno a más de los
siguientes datos: incremento del hematocrito en un 20% o más en la fase aguda;
decremento de hematocrito en al menos 20% después del tratamiento:
tendencia del hematocrito en muestra secuenciales (por ejemplo 40, 43, 45
etc.); relación hematocrito/hemoglobina sugestivo 3.2 a 3.4, indicativo 3.5 o
mayor; o hipoalbuminemia.
Caso confirmado de fiebre hemorrágica por Dengue o Dengue grave
Toda persona con cuadro probable de fiebre hemorrágica por Dengue
confirmado por laboratorio que además presente lo siguiente:
Datos de fuga de plasma, con al menos los siguientes datos:
Clínica - Edema, piel moteada, ascitis o derrame pleural
Laboratorio – Elevación en 20% en etapa aguda o disminución del 20% en etapa
de convalecencia o elevación del hematocrito o hemoglobina en forma
secuencial (a partir del tercer día) o hipoalbuminemia.
Gabinete – Ultrasonido (líquido perivisceral y en cavidad abdominal o torácica)
u radiología (derrame pleural o ascitis).
Datos de fragilidad capilar, prueba de torniquete positiva (petequias, equimosis,
hematomas), trombocitopenia menos a 100000 plaquetas por mm3.
Caso probable de Síndrome de Choque por Dengue (SCHD) o Dengue
Grave
Toda persona con cuadro de FD o FHD y que presente súbitamente datos de
insuficiencia circulatoria, alteraciones en el estado de conciencia, tensión
arterial disminuida o estado de choque profundo.
Caso confirmado de Síndrome de Choque por Dengue o Dengue
Grave
Todo caso probable de SCHD en el que se confirme infección reciente por virus
dengue mediante técnicas de laboratorio.
TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS
Para el diagnóstico por laboratorio de Dengue es necesario contar con suero del
paciente, el cual es obtenido a través de una muestra de sangre completa
extraída por venopunción, en una cantidad aproximada de 5 mililitros sin usar
anticoagulante; 2.5 mL de suero serán obtenidos aproximadamente, los cuales
deberán enviarse al LESP inmediatamente para realizar los ensayos
correspondientes[1]. La muestra debe mantenerse siempre en refrigeración de 2-
1
El sistema básico de triple embalaje consiste en la utilización de un recipiente primario, en el cual está
contenida la muestra biológica (exudado faríngeo, exudado nasofaríngeo, lavado bronquio alveolar,

8° C desde el momento después de la toma hasta su llegada al LESP. La muestra
deberá venir acompañada con el Formato Único de Envío de Muestras del
InDRE, o con el Formato de Enfermedades Transmitidas por Vector o en su
caso con el Formato de Informe de Seguimiento de Fiebre por Dengue y Dengue
Hemorrágico el cual se genera automáticamente de la plataforma para Dengue,
debidamente completados, sin datos alterados o sobre escritos y si es el caso, es
conveniente que se indique la gravedad del paciente; las muestras que no
cumplan con los requisitos establecidos en el Manual para la Toma, Envío y
Recepción de Muestras (REMU-MA-01), serán rechazadas sin ninguna
excepción. Como todos los estados ya capturan en el “Sistema de Plataforma
Única para Dengue” se tiene que adjuntar un listado nominal de las muestras
enviadas, indicando el folio del Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica
(SINAVE), de lo contrario las muestras no serán aceptadas.
De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010, para la
Vigilancia Epidemiológica, Prevención y Control de Enfermedades Transmitidas
por Vector, las técnicas alternativas para confirmar o descartar un caso probable
en los primeros días de haber iniciado con la fiebre (0-5 días) es detectar y
tipificar al virus mediante técnicas virológicas (aislamiento viral en cultivo de
células e identificación por inmunofluorescencia indirecta) o moleculares (RT-
PCR en tiempo real o punto final). A finales del año 2006, apareció una
alternativa analítica en formato de ELISA más fácil, rápida y oportuna para
aplicar en los primeros días de evolución. Esta técnica se basa en la
identificación de la glicoproteína no estructural 1 del virus dengue (NS1),
implicada en los procesos de replicación viral, la cual es secretada por el virus, lo
que permite su detección en la muestra de suero en fase aguda de la
enfermedad. Esta técnica tiene reportada una sensibilidad entre el 80-100%
(dependiente del serotipo y genotipo responsable de la infección, además de la
presencia de altas concentraciones de anticuerpos IgM o IgG) y una
especificidad de 100% y que conjuntamente con las técnicas comerciales ya
existentes para determinación de IgM (sensibilidad de 94.7% y especificidad del
97.2%) y para determinación de IgG de segundas infecciones o reinfecciones por
serotipos distintos (sensibilidad del 94.5% y especificidad del 97.3%) serán las
pruebas consideradas como básicas en la realización del nuevo algoritmo.
Para realizar los tres ensayos inmunoenzimáticos se necesita contar con: un
gabinete de bioseguridad tipo II, un lector de ELISA para placas completas con
biopsia, suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser
hermético para evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre
o número de muestra del paciente. El recipiente primario deberá rodearse de material absorbente como
gasa o papel absorbente y colocarse en un recipiente secundario hermético a prueba de derrames y golpes.
Si se colocan varios recipientes primarios dentro de un recipiente secundario se deberá usar una gradilla y
material absorbente para evitar algún derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente
secundario (hielera) tiene que haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8° C.
Los recipientes secundarios deberán llevar las etiquetas de riesgo biológico y señal de orientación del
recipiente, a su vez el recipiente secundario deberá ir contenido en un paquete externo de envío (caja de
cartón o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado con
los datos del remitente, destinatario y señal de orientación. La documentación que se integre al triple
embalaje deberá colocarse en la parte interior del paquete.

un filtro de 450 nanómetros (nm) y otro de referencia entre 600-650 nm, un
lavador para placas completas, una incubadora o baño María (28-37° C) y
micropipetas multicanales y sencillas con diferentes volúmenes variables,
además de todo el material requerido no incluido en los estuches de diagnóstico.
Los procedimientos se deben realizar como lo indican los insertos
correspondientes para poder cumplir con la validación de cada ensayo.
Es importante aclarar que las muestras a procesar por cualquiera de éstas
técnicas se manejen en estricta red fría, es decir que no deben permanecer a
temperatura ambiente; para lo cual se sugiere sacar las muestras del
refrigerador hasta el momento de realizar cada procedimiento y una vez
terminado el uso de las mismas, se deben mantener almacenadas a 4° C. De ser
posible, se recomienda que para el manejo de las muestras (ya sea al momento
de rotularlas, usarlas en cada técnica y separar en alícuotas) se coloque la
gradilla sobre una cama de hielo o de refrigerantes congelados. En caso de
manejar un gran número de muestras por corrida (arriba de 50), deberá hacerse
en bloques de 25 o 30 muestras para asegurar la red fría y se deberán cambiar
los congelantes y el hielo durante cada bloque.
El énfasis para el manejo de muestras en estrictas condiciones de red fría, radica
en aumentar las posibilidades de aislamiento viral y detección de material
genético, ya que los cambios de temperatura promueven la degradación de las
proteínas de superficie de la partícula viral así como evitar la degradación del
ARN del virus, que es altamente termolábil e inestable.
ALGORITMO DIAGNÓSTICO
La propuesta del algoritmo para el diagnóstico de Dengue deriva de tres
premisas básicas:
1) La necesidad de mejorar el porcentaje de casos confirmados por laboratorio
con respecto de los casos probables utilizando una sola muestra.
2) La necesidad de contar con un diagnóstico oportuno, que promueva una
completa y mejor vigilancia virológica en el país. La implementación del
algoritmo apoyará el Programa Nacional de Prevención y Control del Dengue
al contar con información veraz, oportuna y de calidad para iniciar las
intervenciones adecuadas, e
3) Identificar aquellas muestras que no son Dengue y promover el diagnóstico
diferencial.
El algoritmo propuesto fue consensuado en cuatro diferentes reuniones
celebradas en México entre los laboratorios de la RNLSP y el InDRE. También
fue sometido a la crítica de expertos internacionales en la reunión: American
Dengue Prevention Board–Dengue Surveillance, celebrada en la Ciudad de
México del 17 al 19 de enero de 2008. Durante los días 26 al 29 de febrero del
mismo año, se realizó, en instalaciones del InDRE, el Taller teórico-práctico
para la Implementación del nuevo algoritmo para el diagnóstico por laboratorio
para Dengue, el cual fue dirigido a los 31 laboratorios estatales que conforman la
RNLSP. Los últimos comentarios se discutieron durante la visita de Evaluación
del Programa Nacional de Control y Prevención del Dengue en México por parte
de la Organización Panamericana de la Salud, del 24 de marzo al 2 de abril de

2008. La solicitud por parte del InDRE a la RNLSP fue iniciar la
implementación del algoritmo a partir del mes de abril de 2008.
Este algoritmo involucra la calidad y la oportunidad de la información generada
por el componente de laboratorio que coadyuva en la prevención y control del
Dengue; el algoritmo se muestra en la siguiente figura:
Fig. 3. Algoritmo de diagnóstico por laboratorio para Dengue
Clave de tabulador: 1A3512001, 1A3512002, 1A3512003 y 1A3512004
El algoritmo involucra tres metodologías serológicas básicas (NS1, IgM e IgG).
La determinación de antígeno NS1 aplica únicamente en fase aguda de la
enfermedad, La determinación de anticuerpos IgM e IgG es aplicada en la fase
aguda y convaleciente. La Vigilancia virológica deberá ser aplicada en al menos
el 10% de las muestras de FD NS1+ y en el 100% de las FHD NS1+ en los LESP
que tengan liberada la metodología y para los que no deberán enviarlas al
InDRE para tipificación. Todas las muestras para Diagnóstico diferencial
deberán cumplir con definición de caso para cada agente etiológico a estudiar.

El algoritmo diagnóstico serológico inicia con:
 Muestras recibidas en el laboratorio entre 0-5 días de haber
iniciado la fiebre.
Determinación del antígeno viral (NS1) por ELISA (Platelia BIORAD,
Catálogo 72830 o Early ELISA NS1 Inverness Medical Innovations,
Catálogo E-DEN02P)
Si el resultado obtenido es:
Positivo: Confirma caso. El laboratorio reportará este resultado. En este
momento se da por terminado el algoritmo. No se realizará ninguna otra
prueba, ni se reportará ningún otro resultado (a excepción del serotipo
identificado por RT-PCR, si es que fue seleccionada para la vigilancia
virológica). El valor reportado que representa a un positivo es mayor o igual a
1.0 unidad.
Negativo: El laboratorio reportará el resultado y se realizará la siguiente
prueba indicada en el algoritmo: ELISA para IgG (cuando la muestra tenga 0-3
días de iniciada la fiebre) o ELISA para IgM (cuando la muestra tenga de 4-5
días de iniciada la fiebre).
Determinación de IgM por ELISA (Panbio No. catálogo E-DEN01M),
únicamente para las muestras que tengan entre 4-5 días de haber
iniciado la fiebre. Si el resultado obtenido es:
Positivo: Confirma caso. El laboratorio reportará este resultado. En este
momento se da por terminado el algoritmo. No se realizará ninguna otra
prueba, ni se reportará ningún otro resultado. El valor reportado que representa
a un positivo es mayor o igual a 11.0 unidades.
Negativo: El laboratorio reportará el resultado y realizará la determinación de
IgG.
Determinación de IgG por ELISA (Panbio, No. de catálogo E-
DEN02G), únicamente para muestras que estén entre 0-3 días,
infección reciente (infecciones secundarias). Si el resultado
obtenido es:
Positivo: Confirma caso. Este resultado precisa que bajo el diseño de la prueba,
permitir identificar concentraciones muy altas del marcador a analizar, que
representan infección reciente y activa como sinónimo de una reinfección por
dengue pero por un serotipo diferente al de la primera infección. El laboratorio
reportará este resultado. En este momento se da por terminado el algoritmo. No
se realizará ninguna otra prueba, ni se reportará ningún otro resultado. El valor
reportado que representa a un positivo es mayor o igual a 22.0 unidades.
Negativo: El laboratorio reportará este resultado, asegurando que todas las
pruebas antes mencionadas fueron realizadas y tuvieron un resultado negativo.
En este momento se da por terminado el algoritmo. El valor reportado que
representa a un negativo es menor o igual a 18.0 unidades.

Una muestra negativa a las tres pruebas previas se considera negativa a Dengue
y se deberá realizar diagnóstico diferencial para otras Arbovirosis, las muestras
serán enviadas al InDRE con base en el diagnóstico clínico y previa solicitud de
Vigilancia Epidemiológica Estatal (para casos graves y defunciones), ya sea para
identificación de flavivirus no Dengue o alfavirus como: Virus del Oeste del Nilo
(VON), Encefalitis de San Luis (ESL), Fiebre Amarilla (FA), Encefalitis Equina
del Oeste (EEO), Encefalitis Equina del Este (EEE), Encefalitis Venezolana
(EEV) y virus Chikungunya (CHIKV); además de EFE’s, Leptospira, Rickettsias
o Hantavirus (en caso de signos hemorrágicos). En noviembre del 2012 la
RNLSP recibió la capacitación para iniciar la realización del diagnóstico
diferencial serológico y molecular de Arbovirosis y con esto comenzar a
implementar la “ARBO-RED” en México.
Ante casos de fiebre icterohemorrágica, se sugiere realizar diagnóstico
diferencial con Fiebre Amarilla a personas que viajaron a zonas endémicas. En
zonas endémicas para leptospira se sugiere realizar la prueba rápida al mismo
tiempo que se inicie con el algoritmo de Dengue.
Una vez que se cuente con los diagnósticos implementados se ofrecerán al
Sistema de Vigilancia Epidemiológica y en el momento que esté lo considere
pertinente, se realizara en el InDRE la detección ampliada para otras familias de
Arbovirus identificados en las Américas, como Bunyanvirus (virus Oropuche, La
Crosse), Arenavirus hemorrágicos (virus Machupo, Guaranito, Junin, Lassa).
 Muestras recibidas en el laboratorio con ≥6 días de haber iniciado
la fiebre
Se inicia el proceso con:
Determinación de IgM por ELISA. Si el resultado obtenido es:
Positivo: Confirma caso. El laboratorio reportará este resultado, en este
momento se da por terminado el algoritmo. NO se realizará ninguna otra
prueba, ni se reportará ningún otro resultado. El valor reportado que representa
a un positivo es mayor o igual a 11.0 unidades.
Negativo: El laboratorio reportará el resultado y realizará la siguiente prueba
indicada en el algoritmo. En este caso será determinación de IgG.
Determinación de IgG por ELISA. Si el resultado obtenido es:
Positivo: Confirma caso. Este resultado precisa que bajo el diseño de la
prueba, permitir identificar concentraciones muy altas del marcador a analizar,
que representan infección reciente y activa como sinónimo de una reinfección
por dengue pero por un serotipo diferente al de la primera infección. El
laboratorio reportará únicamente este resultado, en este momento se da por
terminado el algoritmo. NO se realizará ninguna otra prueba, ni se reportará
ningún otro resultado. El valor reportado que representa a un positivo es mayor
o igual a 22.0 unidades.
Negativo: El laboratorio reportará este resultado, asegurando que todas las
pruebas antes mencionadas fueron realizadas y tuvieron un resultado negativo.

En este momento se da por terminado el algoritmo. El valor reportado que
representa a un negativo es menor o igual a 18.0 unidades.
Una muestra negativa a las dos pruebas previas se considera negativa a Dengue
y se deberá realizar diagnóstico diferencial, las muestras serán enviadas a
InDRE con base en el diagnóstico clínico y previa solicitud de vigilancia
epidemiológica estatal (para casos graves y defunciones), ya sea para
identificación serológica de flavivirus no Dengue o alfavirus como: Virus del
Oeste del Nilo, Encefalitis de San Luis, Fiebre Amarilla, Encefalitis del Oeste,
del Este, Venezolana y Virus Chikungunya; además de EFE’s, Leptospira,
Rickettsias o Hantavirus (en caso de signos hemorrágicos). Ante casos de fiebre
icterohemorrágica, se sugiere realizar diagnóstico diferencial con Fiebre
Amarilla a personas que viajaron a zonas endémicas. En zonas endémicas para
leptospira se sugiere realizar la prueba rápida al mismo tiempo que se inicie con
el algoritmo de Dengue. Se pueden solicitar que se realicen otros diagnósticos
según las necesidades que el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica
considere pertinentes.
En dado caso que se obtengan resultados “indeterminados” por alguna de las
técnicas mencionadas anteriormente se procederá de la siguiente forma:
Indeterminado para determinación de NS1 por ELISA. No se deberá
reportar el resultado como indeterminado y se procederá a procesar
nuevamente la muestra por duplicado como lo indica el inserto y si se obtiene el
mismo resultado (indeterminado), realizar la siguiente prueba indicada en el
algoritmo según corresponda. Este resultado deberá ser reportado en
plataforma una vez que este activo el campo de resultado indeterminado.
Indeterminado para determinación de IgM por ELISA. No se deberá
reportar el resultado como indeterminado, y se procederá a procesar
mismo resultado (indeterminado), realizar la siguiente prueba indicada en el
algoritmo según corresponda. Este resultado deberá ser reportado en
plataforma una vez que este activo el campo de resultado indeterminado.
Indeterminado para determinación de IgG por ELISA. No se deberá
reportar el resultado como indeterminado, y se procederá a procesar
mismo resultado (indeterminado) se enviará al InDRE para referencia ya que a
partir de septiembre se realizara inhibición de la hemaglutinación (IH) y una
vez estandarizada la metodología de microneutralización (MNT) se
incorporaran las dos metodologías como Referencia para estos resultados. Este
resultado deberá ser reportado en plataforma una vez que este activo el campo
de resultado indeterminado. El InDRE reportará sus resultados de referencia
una vez que en plataforma se encuentren activos los campos para IH y MNT.
*Cualquier otra metodología diferente a la indicada y validada por el InDRE
para la vigilancia serológica, NO será considerada válida y los resultados
obtenidos NO serán avalados, hasta no ser enviadas al InDRE las muestras de
interés.

DETERMINACIÓN DE MATERIAL GENÉTICO MEDIANTE RT-PCR
MÚLTIPLEX EN TIEMPO REAL
Esta determinación aplica únicamente en muestras NS1 positivas que fueron
seleccionadas para su tipificación. Si el resultado obtenido es:
Positivo: Se reportará el serotipo identificado o serotipos identificados. El
laboratorio tendrá que informar el resultado obtenido al remitente de la
muestra según sea el caso. Cabe aclarar que las muestras que resulten positivas
por RT-PCR Múltiplex en tiempo real ya habían sido confirmadas mediante
determinación de antígeno NS1, por lo que se deberá considerar como único
caso confirmado. Esta metodología únicamente tiene el objetivo de realizar la
vigilancia virológica de serotipos circulantes en México.
Negativo: El laboratorio deberá también informar este tipo de resultado. Cabe
aclarar que las muestras que resulten negativas por RT-PCR Múltiplex en
tiempo real ya habían sido confirmadas mediante determinación de antígeno
NS1, por lo que se deberá considerar como único caso confirmado.
El estándar de servicio para RT-qPCR es de 3 días.
En caso de extrema urgencia, los resultados deberán ser emitidos en 24 horas
una vez recibida la muestra en el laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos
del InDRE o en el LESP.
VIGILANCIA ENTOMO-VIROLÓGICA MEDIANTE RT-PCR EN
TIEMPO REAL
Esta nueva vigilancia es consecuencia de las necesidades que se identifican por
la Coordinación de Enfermedades Virales Zoonóticas y por Vector del InDRE
(CEZV-InDRE) y las exigencias que plantea la enfermedad y son el efecto de la
implementación de la Epidemiología Inteligente basada en laboratorio que
permite coadyuvar con el programa de vectores para lograr una verdadera
epidemiologia oportuna y preventiva. Durante 2011 se capacitaron los LESP de
Oaxaca, Morelos, San Luis Potosí, Nuevo León, Guerrero, Chiapas, Guanajuato
y Zacatecas, los cuales fueron seleccionados por contar con los componentes
entomológicos y virológicos. Una vez que otros LESP, hagan llegar al InDRE la
indicación de que se cuenta con los dos componentes, estos serán seleccionados
para la capacitación de este tipo de Vigilancia. En julio de 2102 se realizó una
capacitación vía webex a toda a RNLSP para la implementación de este tipo de
técnica.
1. Esta vigilancia será realizada únicamente por aquellos LESP que tengan
liberada la metodología de RT-PCR Multiplex en tiempo real y que cuenten
con la contraparte entomológica, quienes se harán cargo de la captura y
clasificación de los especímenes, los cuales serán entregados en red fría o
vivos según sea el caso al área responsable de la vigilancia virológica y estos
poder llevar a cabo el macerado y clarificado de los especímenes.
Este tipo de vigilancia se realizará en grupos con número de especímenes
menores a 30.

2. El tipo de muestra para la vigilancia Entomo-Virológica aunque puede ser de
larvas o de mosquitos adultos, esta última es la más indicada.
3. En caso de captura de huevecillos, estos deberán ser cultivados para obtener
mosquitos adultos; análisis que servirá para determinar zonas con
transmisión vertical. Actualmente la (CEZV-InDRE) está realizando la
estandarización de la detección directa en huevecillos.
4. El LESP es el responsable de notificar inmediatamente al InDRE y al
Programa de Vectores de los resultados obtenidos, para la toma de acciones
pertinentes.
5. Como seguimiento de los resultados, el LESP deberá enviar al InDRE el 100%
de sus clarificados positivos y el 10 % de los negativos, esto NO representa un
control de calidad, únicamente servirá para tener un banco de clarificados de
mosquitos. El control de calidad aplicará cuando se identifique un serotipo
diferente al circulante en ese momento.
El estándar de servicio será de 5 días una vez que los especímenes sean
recibidos en los LESP.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS MEDIANTE
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
Si el resultado obtenido es:
Positivo: Se reportará el serotipo o serotipos identificados. El laboratorio que
cuente con la metodología correspondiente, tendrá que informar el resultado
obtenido al remitente de la muestra, según sea el caso. Cabe señalar que las
muestras que resulten positivas para aislamiento viral, ya habían sido
confirmadas mediante determinación de antígeno NS1, por lo que deberá ser
considerado como un único caso confirmado.
Negativo: El laboratorio deberá también informar el resultado. Cabe
mencionar que las muestras que resulten negativas para aislamiento viral, ya
habían sido confirmadas mediante determinación de antígeno NS1, por lo que
se deberá considerar como un único caso confirmado.
*Todos los resultados negativos por esta metodología deberán ser corroborados
mediante RT-PCR en tiempo real.
*Para aquellos laboratorios que estén realizando aislamiento viral como técnica
para la vigilancia virológica de Dengue y que requieran de una evaluación
mediante PEED por parte del InDRE, deberán realizar la solicitud por escrito y
dirigida a la Dirección de Servicios y Apoyo del InDRE, para que se les asigne un
PEED especial para esta metodología.
USO DE PRUEBAS RÁPIDAS PARA EL DIAGNÓSTICO
Durante situaciones de emergencia, como en las inundaciones hay sitios
inaccesibles y el exceso de muestras satura el LESP, por lo que se requiere

contar con un diagnóstico oportuno y confiable y con soporte costo beneficio.
Para ello, se propone un algoritmo que permita confirmar casos de una forma
rápida y práctica con el uso de pruebas rápidas, las cuales reportan una
sensibilidad y especificidad superior al 70%. La decisión de cuándo usar esta
prueba será en base al Manual de Vigilancia Epidemiológica y debe ser definido
por Vigilancia Epidemiológica Estatal, previa autorización por la Dirección
General Adjunta de Epidemiología, del Nivel Federal. Este tipo de metodología
deberá ser realizada únicamente por los LESP. En situación normal se deberán
realizar las pruebas indicadas en el algoritmo vigente. Los resultados positivos
confirmaran caso únicamente y cuando se haya confirmado casos por
metodologías de ELISA o moleculares.
Prueba rápida Dengue Dúo Cassette (Panbio, No. de catálogo E-
DEN01D). Esta prueba está diseñada para analizar los marcadores
IgM e IgG y deberá ser utilizada según algoritmo vigente. Si el
resultado obtenido es:
Positivo: Confirma caso. El laboratorio reportará este resultado. Se realizará
una selección aleatoria, para que de uno de cada 10 casos positivos se siga el
procedimiento del nuevo algoritmo. El resultado se reportará en plataforma una
vez que estén activos los módulos de resultado para prueba rápida.
Negativo: Se reportará el resultado en plataforma una vez que estén activos los
módulos de resultado para prueba rápida. La muestra deberá ser procesada
siguiendo el nuevo algoritmo con base en los días de evolución.
Prueba rápida SD-Dengue duo (Dengue NS1 y anticuerpos IgM-IgG)
(Panbio, No. de catálogo 11FK45 y 46. Una prueba inmunocromatográfica
de un paso diseñada para detectar el antígeno del virus del dengue NS1 y los
anticuerpos contra el virus del Dengue (Dengue IgG/IgM) de manera cualitativa
y diferencial en sangre total, suero y plasma. Es el primer y único producto a
nivel mundial con formato para los tres marcadores serológico indicados en el
algoritmo vigente. Contrarresta la debilidad de solamente una prueba.
Positivo a cualquiera de los tres marcadores: Confirma caso. El
laboratorio reportará este resultado. Se realizará una selección aleatoria, para
que de uno de cada 10 casos positivos se siga el procedimiento del nuevo
algoritmo. El resultado se reportará en plataforma una vez que estén activos los
módulos de resultado para prueba rápida. En caso de IgG positivos, estos
evidencian la presencia de reinfecciones activas por serotipos diferentes a la
primera infección, como en el formato de ELISA.
Negativo para los tres marcadores: Se reportará el resultado en
plataforma una vez que estén activos los módulos de resultado para prueba
rápida. La muestra deberá ser procesada siguiendo el nuevo algoritmo con base
en los días de evolución.
Si el InDRE tuviera la evaluación de cualquier otra técnica y que cumpliera con
los estándares requeridos para ser usada en el diagnóstico de Dengue en
México, se informara inmediatamente a los LESP para ser utilizada en la
Vigilancia Epidemiológica bajo los estándares del uso de pruebas rápidas.

*Cualquier otra metodología diferente a la indicada y que no esté evaluada por
el InDRE y que cumpa con los requerimientos para la vigilancia serológica, NO
será considerada válida y los resultados obtenidos NO serán avalados, hasta no
ser enviadas al InDRE las muestras de interés.

MUESTRAS DE DEFUNCIONES
La Coordinación de Enfermedades Virales Zoonóticas y por Vector del InDRE,
con el objetivo de brindar mayor información al CONAVE Estatal y Nacional
para una mejor dictaminación de defunciones, realiza la indicación que las
muestras de suero de defunciones por probable FHD deberán ser procesadas
por los LESP para los tres marcadores; NS1, IgM e IgG, en caso de muestras en
fase aguda y para los dos marcadores; IgM e IgG en caso de muestras de fase
convaleciente. En caso biopsias postmortem deberán ser analizadas mediante
RT-qPCR.
Se deben enviar al InDRE únicamente las muestras con resultado negativo para
todos los marcadores serológicos o moleculares para Dengue, con la finalidad de
realizar diagnóstico diferenciales para otros arbovirus, basándose en el cuadro
clínico (hemorrágico, neurológico etc.) Por lo que para el dictamen de
defunciones en los Comités de Vigilancia Epidemiológica, Estatal y Nacional
(CEVE y CONAVE) se tomarán únicamente los resultados obtenidos en los
LESP. Si se presenta el caso, el InDRE notificará los resultados del diagnóstico
diferencial a los LESP. Si se requiere el envío de las muestras al InDRE por
alguna circunstancia determinada en el CONAVE, se solicitará al LESP el envío
de las muestras.
Para aquellos laboratorios que obtengan clasificación No aceptable en la
evaluación del desempeño, deberán enviar todas las muestras de defunciones al
InDRE (100% de positivas y negativas), hasta que la clasificación en la
evaluación del desempeño sea aprobatoria y se emita un documento al LESP en
cuestión, en donde se le indicará que se suspende el envío de muestras de
defunciones ya que el diagnóstico se realizará en el LESP nuevamente.
El estándar del servicio para emitir un resultado será de 5 días
hábiles
ESTÁNDAR DE CALIDAD
FASE PRE-ANALÍTICA
Esta fase está relacionada con la toma de muestra, manejo y envío de la misma
al laboratorio. Para cumplir con esta parte todas las muestras requeridas para
realizar la detección de infecciones causadas por cualquiera de los cuatro
serotipos del virus dengue, deberán cumplir con las definiciones de caso
probable para FD y FHD, además de cumplir con los requisitos establecidos
como lo indica el manual de recepción de muestras del InDRE (REMU-MA-01),
de lo contrario las muestras serán rechazadas. A continuación se anexa una
tabla con el resumen de estas especificaciones.
Tabla 1. Especificaciones de las muestras
Tipo de
muestr
a
Volumen
requerido
Condiciones de
manejo y envío
Condicione
s de
almacenaje
Característ
icas
Suero Mínimo
500
Tubos tipo eppendorff
o crioviales con
En estricta
refrigeración
Sin
contaminació

microlitros
(µL)
capacidad para 2.0
mililitros, etiquetados
con nombre y folio.
Acompañados con los
formatos
correspondientes y el
oficio de solicitud
(2-8° C) n bacteriana
o fúngica, no
hemolizadas,
ni lipémicas
Biopsia
de
hígado,
bazo,
ganglios,
etc.
un
centímetro
cúbico
En frascos estériles,
con solución salina al
0.85% (solución
fisiológica)
identificados con
nombre y tipo de
tejido. Acompañadas
con los formatos
correspondientes y el
oficio de solicitud
En estricta
refrigeración
(2-8° C)
No usar
formol
Muestras
de
mosquito
s
(clarifica
dos o
adultos)
0.5 mL de
clarificado o
grupos de
30
especímene
s adultos
Para Clarificados:
Tubos tipo eppendorff
o crioviales con
capacidad para 2.0
mililitros, etiquetados
con clave o folio.
Para adultos: tubos
cónicos de 15 o de 50
mL etiquetados con
clave o folio. En
ambos casos se deberá
enviar los formatos
debidamente
requisitados, que se
indicaron en sesión
webex
En estricta
refrigeración
(2-8° C)
Clarificado
sin
evidencias de
contaminació
n bacteriana
o fúngica
FASE ANALÍTICA
En esta etapa se considera la aplicación del algoritmo de diagnóstico como está
indicado, además de cumplir con el tiempo establecido para el reporte de
resultados, sin tomar en cuenta la vigilancia virológica hasta finalizar con el
algoritmo, es decir hasta la realización de IgG, (si fuera el caso), que será de 3
días hábiles. En caso de emergencia epidemiológica cada LESP deberá elaborar
un plan de respuesta rápida en donde se incluya laborar todos los días de la
semana.
FASE POST-ANALÍTICA

El reporte de resultados deberá ser generado inmediatamente después que se
tenga el resultado correspondiente. En caso de estar dentro de la fase de control
de calidad para alguna de las metodologías, los resultados deberán ser
reportados únicamente cuando el InDRE emita el informe de prueba al LESP
correspondiente.
Con la única finalidad de conocer a nivel nacional toda la información generada
en cada laboratorio y que ésta pueda ser conocida y consultada por las
autoridades de este Instituto, para los fines que el Programa Nacional de
Vectores y la Dirección General Adjunta de Epidemiología requieran, es
obligatorio que se tenga y se aplique correctamente el sistema de información
que a continuación se menciona.
CAPTURA DE RESULTADOS
A partir de esta versión de los lineamientos y con el objetivo de obtener datos de
la eficiente aplicación y costos del algoritmo; en común acuerdo con la
Coordinación de Enfermedades Virales Zoonóticas y por Vector del InDRE y el
Departamento de Vigilancia Epidemiológica de Enfermedades Transmisibles
por Vector de la Dirección General de Epidemiología, se deben reportar en
plataforma todos los resultados obtenidos según sea el caso. Ejemplo: Para las
muestras en fase aguda con menos de tres días de evolución con resultado
negativo a NS1 e IgG, se deben reportar los dos resultados, o en caso de un
resultado negativo a NS1 y positivo a IgG también se deben reportar los dos, y
así según indicaciones del algoritmo vigente. Los resultados obtenidos deberán
ser reportados inmediatamente (dentro de las siguientes 24 horas de haber sido
obtenidos) en la plataforma única para Dengue, siguiendo las indicaciones del
manual de usuario en la plataforma para Dengue, ubicado en el menú principal.
La siguiente es la liga para ingresar al portal: www.rhove.gob.mx
Información relacionada con la Plataforma Única para Dengue
En el caso del reporte en plataforma única para Dengue el LESP, el laboratorio
local y el InDRE tienen acceso a este sistema mediante la solicitud de una clave
que fue proporcionada por Vigilancia Epidemiológica Estatal o Federal, para
reportar los resultados correspondientes. El apartado correspondiente al
laboratorio se describe a continuación.
Estudios de laboratorio
La posibilidad del análisis de laboratorio está en función de las técnicas
empleadas para el diagnóstico. Se deberá llenar el procedimiento de laboratorio
específico para cada caso, por lo que es necesario ingresar la fecha de toma de la
muestra y cada LESP tiene la atribución de ingresar el resultado obtenido, la
fecha de recepción de la muestra y la fecha en que se está reportando, así como
la obligación de revisar que tenga toda la información que se requiere para
poder realizar el diagnóstico de forma oportuna. Las fechas de toma y recepción
de muestra, y de resultado son obligatorias. El LESP recibirá el oficio de

solicitud para el diagnóstico junto con el listado de muestras enviadas (con
número de folio de identificación para la plataforma y nombre), no se deberán
recibir muestras que no tengan el folio de plataforma o algún dato de
laboratorio que se requiera para aplicar el algoritmo. Con estos datos el
laboratorio realizará la búsqueda en la opción de “seguimiento” al ingresar con
su clave en plataforma única, ya habiendo ingresado podrá reportar los
resultados obtenidos de cada muestra recibida, por cualquiera de las técnicas
siguientes: determinación de NS1, determinación de IgM, determinación de
IgG; con base en el algoritmo. También se podrá reportar aislamiento (para
aquellos laboratorios que lo realicen), RT-PCR Múltiplex tiempo real o prueba
rápida (previa autorización de su uso).La CEZV-InDRE está promoviendo la
actualización de la plataforma a partir del primer semestre del 2013 para
brindar una mejor calidad de la información.
La variable “muestra” se refiere al paciente que ya cuenta con muestra para
realizar el diagnóstico por laboratorio. Es importante mantener actualizado este
dato ya que la plataforma considera este rubro para estimar el porcentaje de
muestreo además del porcentaje de positividad.
ELISA para determinación de NS1
1. Anotar o seleccionar del menú la fecha de toma de muestra.
2. Anotar la fecha de recepción de muestra en el LESP una vez que el campo se
habilite en plataforma.
3. Anotar o seleccionar del menú la fecha de reporte del resultado.
4. Seleccionar el resultado:
- Si resulta positivo se selecciona (+) y NO se reportará nada más, a
excepción de que posteriormente se agregue el resultado con el serotipo
identificado si fuera el caso, cómo se mencionó previamente. Este
resultado se debe capturar inmediatamente.
- Si resulta negativo se reportará el resultado inmediatamente. El
laboratorio deberá realizar la siguiente prueba indicada en el algoritmo.
ELISA para determinación de IgM
- Si resulta positivo se selecciona (+) y NO se reportará nada más. Este
- Si resulta negativo se reportará el resultado inmediatamente. El
laboratorio deberá realizar la siguiente prueba indicada en el algoritmo.
ELISA para determinación de IgG

- Si resulta positivo se selecciona (+) y NO se reportará nada más. Este
- Si resulta negativo se selecciona (-) y se da por terminado el algoritmo,
por lo que se comprueba que todas las pruebas antes mencionadas ya se
realizaron y resultaron negativas; por lo tanto el caso se descarta por
laboratorio. Recordando que TODOS los resultados antes obtenidos
deben ser reportados.
Aislamiento viral y RT PCR en tiempo real
 En el caso que se requiera ingresar resultados en este rubro la fecha de toma
de muestra deberá ser la misma que la fecha que se anotó o seleccionó en el
rubro de NS1, ya que será la misma muestra para identificar serotipo.
 Anotar la fecha de recepción de muestra en el LESP una vez que el campo se
 Anotar o seleccionar del menú la fecha de reporte del resultado, que será
emitido por el InDRE o por el LESP que tenga implementadas las técnicas
para identificar serotipos.
 Seleccionar el o los serotipos identificados (1, 2, 3 o 4).
Prueba rápida: siempre y cuando esté aprobado el uso de la misma
según resultados de sensibilidad y selectividad
 Anotar o seleccionar del menú la fecha de toma de muestra.
 Anotar la fecha de recepción de muestra en el LESP una vez que el campo se
 Anotar o seleccionar del menú la fecha de reporte del resultado.
 Seleccionar el resultado (+ o -).
* Es responsabilidad del LESP revisar la información que está en la plataforma
semanalmente y checar que las muestras asignadas por epidemiología estatal se
encuentren en el laboratorio o de lo contrario indicar en el rubro
correspondiente que no se tomó la muestra, ya que aparecerán como no
realizadas. En su momento se modificará el modulo para verificar que las
muestras registradas en verdad son las que se tienen en el LESP.
**En el caso de los informes de serotipos identificados, estos serán avalados
semanalmente por el InDRE, mediante análisis de datos obtenidos en la
Plataforma Única de Dengue y al envío del informe semanal al Laboratorio de
Arbovirus y virus hemorrágicos; el corte se realizará los lunes a las 12:00 horas.
Esta información será manejada por el InDRE, la DGAE y el Programa de
Vectores, para homogenizar la información que se publicará en el Boletín
Semanal de Epidemiologia.

PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO
Dentro de los ensayos de aptitud se encuentran los PEED, herramienta que
utiliza el InDRE para la evaluación continua de la competencia técnica y la
identificación de necesidades de fortalecimiento de un individuo, de un grupo
de laboratorio o de las redes de diagnóstico específico mediante el envío a
intervalos regulares continuos de paneles de muestras caracterizadas.
El uso de los PEED como auxiliares en la evaluación del desempeño de los
laboratorios de la RNLSP requiere que operen correctamente y en armonía con
los requerimientos de desarrollo de las redes de diagnóstico.
La Coordinación de Enfermedades Virales Zoonóticas y por Vector del InDRE
ha promovido dentro de este lineamiento para Dengue, los paneles
independientes -serológicos y moleculares - los cuales a partir de julio del 2012
se enfocaran como PANELES INTELIGENTES O ALGORITMICOS y a partir del
2013 serán paneles algorítmicos únicos “SMART-ONLY-DEN” donde se
evaluará en un mismo panel TODO el algoritmo es decir, se analizarán muestras
para serología y biología molecular en el mismo envío del panel, siguiendo las
indicaciones e instrucciones para cada muestra y bajo indicaciones del
algoritmo de diagnóstico por laboratorio vigente.
Laboratorios que pertenecen a la red de Dengue (LESP de apoyo al
SINAVE)
El procedimiento para estos laboratorios se realizará de la siguiente forma:
 Envío de un primer panel de eficiencia (durante el primer semestre del año).
Conformado para la determinación de anticuerpos tipo IgM, IgG y antígeno
NS1 y tipificación viral según los resultados de muestras identificadas como
NS1 positivas, dependiendo de la regionalización del marco analítico en cada
LESP.
 Envío de un segundo panel de eficiencia (durante el segundo semestre del
año) Conformado para la determinación de IgM, IgG y de NS1 y tipificación
viral según los resultados de muestras identificadas como NS1 positivas,
dependiendo de la regionalización del marco analítico en cada LESP.
El formato del panel estará basado en el algoritmo de diagnóstico vigente, en la
determinación de los tres componentes serológicos y el molecular, en el cual se
pondrá a prueba el marco analítico de cada LESP (paneles inteligentes únicos),
lo que significa que a partir del segundo ciclo de la evaluación del desempeño en
2012, se enviaran paneles para evaluar del algoritmo vigente y no metodologías
por separado. Se enviaran muestras de suero codificadas, las cuales deberán ser
procesadas según el algoritmo, basándose en los días de evolución de la
enfermedad que indique el instructivo del laboratorio de Arbovirus y virus
hemorrágicos. Como se mencionó anteriormente a partir del primer ciclo de
paneles del 2013 se incorporará en este tipo de paneles los de NAT-DEN (RT-
PCR Multiplex en tiempo real), en los cuales se incluirá la tipificación de virus
dengue de aquellas muestras positivas a NS1, tal y como lo indica el algoritmo.
Este tipo de panel además evaluará en la metodología molecular, la capacidad
de los analistas para obtener datos de pendiente que identifican eficiencia de la
reacción y con esto identificar fallas en el pipeteo que puedan promover errores

además de identificar la capacidad de interpretación de curvas de amplificación
en muestras con coinfección por dos serotipos. Esto permitirá a la CEZV-InDRE
clasificar a algunos LESP como de EXCELENCIA que tendrá el beneficio de
participar activamente en investigación epidemiológica aplicada para brindar
conocimiento de Dengue y otros Arbovirus al SINAVE.
Con base en los resultados de concordancia obtenidos en los paneles se
clasificará a los LESP como sigue: 1. LESP que hayan obtenido una calificación
entre 90.0 a <100% de concordancia, se clasifican como SOBRESALIENTES.
2. LESP que hayan obtenido una calificación entre 80.0 a <90% de
concordancia, se clasifican como SATISFACTORIOS.
3. LESP que hayan obtenido una calificación menor al 80% de concordancia, se
clasifican como NO ACEPTABLES. Para los laboratorios que obtengan
clasificación SOBRESALIENTE o, SATISFACTORIA se procederá de la
siguiente forma:
 Ya no enviarán muestras para Control de Calidad al InDRE de cualquier
técnica empleada en el LESP (determinación de IgM, IgG, NS1 o de PCR).
Esto se notificará al director del LESP, vía oficio emitido por la Dirección
de Diagnóstico y Referencia del InDRE.
 La evaluación del desempeño se realizará únicamente a través de PEED,
que se enviarán 2 veces por año.
Para los laboratorios que obtengan calificación No aceptable, se procederá de
la siguiente forma:
 Se solicitará la elaboración de un plan de mejora que deberán enviar al
InDRE en un tiempo no mayor a una semana después de la notificación de
esta calificación.
 El InDRE analizará el plan de mejora y de no cumplir con las expectativas
necesarias para solventar la contingencia, el InDRE realizará una auditoría
y/o asesoría técnica al laboratorio implicado para evaluar la competencia
técnica y detectar áreas de oportunidad.
 Se enviará un tercer panel, a petición y con costo para el LESP, que
nuevamente servirá para las acciones correctivas implementadas por el
laboratorio.
 Si se obtiene nuevamente un resultado No aceptable se solicitará el cambio
del analista para el diagnóstico de Dengue en el LESP y se suspenderá
inmediatamente el diagnóstico. El nuevo analista recibirá capacitación
inmediata en el InDRE durante una semana, durante la cual se incluirá un
examen teórico y práctico al inicio y al final.
 Una vez capacitado el analista, se reanudará el diagnóstico inmediatamente,
 Derivado de los puntos anteriores y únicamente mientras dure el proceso de
mejora (un mes) deberán enviar para control de calidad el 100% de positivos
y el 10% de negativos de todas las muestras de probables FD y FHD.
En el momento que el laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos lo
considere pertinente y como parte de la mejora continua del PEED, la
ponderación para la clasificación Sobresaliente, Satisfactorio y No
aceptable, se ajustará previo aviso a la RNLSP.

Se implementará un directorio de los responsables de realizar las metodologías
en cada LESP y de los suplentes, para realizar el seguimiento de los analistas,
con el objetivo de detectar situaciones que pudieran impactar en el sistema de
vigilancia epidemiológica por laboratorio. En caso de existir un cambio de
analista, el LESP se responsabilizará de la capacitación para dicho analista
previa notificación (vía correo electrónico) al laboratorio de Arbovirus. Si este
último lo considera pertinente la capacitación se realizará en las Instalaciones
del InDRE.
Los LESP que tienen una red de laboratorios locales en donde se
realizan las pruebas de diagnóstico para Dengue, deberán:
 Regular las actividades de diagnóstico.
 Supervisar la ejecución del algoritmo de diagnóstico.
 Implementar el Programa de Evaluación del Desempeño (a través de paneles
de eficiencia).
 Planificar supervisiones y capacitaciones en servicio.
Solicitar la clave de acceso al sistema de captura, plataforma única, módulo
dengue, para ingresar inmediatamente los resultados generados, cumpliendo de
esta forma con los tiempos establecidos para los indicadores en servicio de cada
prueba realizada.
Aunado al programa de evaluación PEED también se realizarán supervisiones a
los laboratorios con la aplicación de una cédula estandarizada para la evaluación
del proceso y así comprobar la competencia técnica, misma que deberá ser
mayor del 90%. Ver cronograma de actividades.
En el momento que el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica considere
pertinente realizar alguna modificación en cualquiera de los puntos de la
evaluación externa del desempeño, se informará a la RNLSP inmediatamente.
Todas las muestras enviadas en cada PEED cuentan con el respaldo
documentado de las características de reactividad para cada marcador. Las
muestras son embaladas en condiciones óptimas para el envío a los laboratorios
participantes, incluyendo instrucciones detalladas para el manejo del mismo.
Cada LESP es codificado para mantener la confidencialidad de los participantes
mediante una clave única.
Las muestras enviadas en cada PEED provienen del banco de sueros del
Laboratorio de Arbovirus, el cual es sustentado con el envío programado y
especificado durante sesiones vía webex llevadas a cabo en los meses de abril y
septiembre de 2012.
Los paneles planificados a partir de 2013, estarán constituidos por 12 muestras
de suero perfectamente caracterizados para cada marcador.
Los resultados de cada PEED obtenidos por cada LESP, deberán ser remitidos
una semana después de haber sido enviados a la cuenta del correo del
Laboratorio (laboratorioarbovirusindre@yahoo.com.mx). El formato de
resultados impreso y firmado en original, deberá ser enviado por oficio a la

Dirección General Adjunta del InDRE con atención a la Jefatura del Laboratorio
y Coordinación de Enfermedades Virales Zoonóticas y por Vector.
El laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos notificará los resultados
obtenidos a cada LESP (vía correo electrónico oficialmente a cada director del
LESP) una semana después de haber sido recibidos en el InDRE vía correo
electrónico. Los resultados serán emitidos vía oficio en las siguientes tres
semanas.
Seguimiento basado en proceso
Con la finalidad de evaluar la reproducibilidad y repetibilidad de cada método
empleado, a partir del 2013, cada seis meses el InDRE solicitará a cada LESP (a
través de correo electrónico) el envío continuo durante una semana, de los
registros de proceso realizados, además de las lecturas obtenidas para cada
determinación realizada. Los meses en que se realizará el seguimiento basado
en proceso, no serán precisados con antelación. De no recibir el InDRE la
información solicitada en tiempo y forma, el LESP recibirá un primer
extrañamiento, que lo obligará a brindar explicación oficial en los siguientes
cinco días, del motivo por el cual no envío información solicitada.
CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO
La liberación de la metodología para realizar el diagnóstico, se basará en el
cumplimiento de los siguientes criterios:
1. Obtener arriba del 99.0% de concordancia durante la fase de control de
calidad, en al menos los últimos dos meses del período de alta circulación
viral o de cuatro meses durante el periodo de baja endemicidad.
2. Demostrar con evidencia que se cuenta con los insumos necesarios para los
siguientes 12 meses.
3. Demostrar con evidencia que se tiene el recurso humano capacitado en el
área a fin y que cumpla con el perfil técnico para la realización de la
metodología.
4. Demostrar con evidencia que se cumple en tiempo y forma con las fases pre
analítica, analítica y post analítica.
Si es así se emitirá un informe a través de un oficio al LESP o Institución
correspondiente en donde se manifieste el resultado de concordancia obtenida
durante el proceso de control de calidad así como la notificación
correspondiente de la fecha de liberación de la metodología. Esta notificación
también se dará a conocer al CONAVE.
El InDRE tiene la atribución de suspender la realización del diagnóstico en los
LESP o en la Institución correspondiente, en cuanto detecte alguna desviación
en la realización del mismo que impacte de manera significativa en el SINAVE,
esto se informará a través de un oficio al LESP correspondiente y también se
notificará al CONAVE.

BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO
Con el objetivo de mantener el banco de material biológico, que servirá para
realizar los PEED, para obtener controles de referencia, o para estudios que
permitan implementación de nuevas técnicas de diagnóstico diferencial para
otras Arbovirosis; cada LESP seleccionados semestralmente (información que
se brindará en sesión webex en el mes de agosto) enviaran muestras en los
siguientes periodos: 25 de marzo, 25 de agosto siguiendo las siguientes
especificaciones.
 El 20% de muestras positivas y 20% de las muestras negativas para IgM e
IgG, NS1.
 LESP que realizan identificación de serotipos mediante RT-PCR y que
cuentan con la liberación del diagnóstico, deberán enviar el 25% de muestras
positivas (que incluya todos los serotipos identificados en su estado). a esta
técnica y 30% de muestras negativas a RT-qPCR de muestras positivas a
NS1.
 LESP que realizan identificación de serotipos mediante RT-PCR y que NO
cuentan aún con la liberación del diagnóstico, deberán enviar el 25% de
muestras positivas a esta técnica y 50% de muestras negativas para NS1.
Para el envío de estas muestras, se deberán usar viales de polipropileno tipo
eppendorff o criotubos que deberán rotularse con el número de folio del LESP,
la tapa externa deberá sellarse con papel Parafilm™, y no deberán estar
contaminadas, ni lipémicas, ni hemolizadas. El volumen mínimo será de 750
microlitros (µL). Es necesario indicar en el oficio de envío que se trata de
material biológico para el Banco de Sueros de Dengue y otras Arbovirosis y se
deberá anexar el formato correspondiente (ver anexo) con los datos solicitados y
debidamente requisitados.
Por otra parte la base electrónica deberá ser enviada también al correo
electrónico del Laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos
(laboratorioarbovirusindre@yahoo.com.mx).
INDICACIONES ESPECIALES PARA LOS LABORATORIOS
ESTATALES QUE AÚN NO REALICEN RT-PCR MULTIPLEX EN
TIEMPO REAL PARA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE
SEROTIPOS DE VIRUS DENGUE
El InDRE y los estados que cuenten con el aval, según lo indicado en puntos
anteriores, realizarán la detección e identificación de serotipos circulantes de
virus dengue usando métodos de biología molecular como la RT-PCR Múltiplex
en Tiempo Real, o en su defecto, aislamiento viral, como pruebas de oro. El
InDRE contará con otras metodologías que le permitan actuar como un
verdadero Instituto de REFERENCIA.
La importancia de identificar los serotipos circulantes radica en tener la
información para poder predecir posibles brotes por serotipos relacionados con

cuadros clínicos graves, identificar localidades de riesgo, comprender la
dinámica de transmisión, que permitan fortalecer la vigilancia virológica en el
país.
*Si el InDRE implementa nuevas metodologías de biología molecular para la
detección viral, que permitan mejorar la vigilancia virológica de Dengue en
México, se promoverá un curso de actualización inmediatamente, dirigido a los
LESP que el InDRE considere pertinentes. El formato del curso quedara sujeto a
las necesidades que promuevan una mejor difusión. La Coordinación de
Enfermedades Virales y Zoonóticas y por Vector del InDRE seleccionará los
LESP para dichos cursos, basado en el marco analítico dado de alta y en la
experiencia de los responsables del Diagnóstico serológico y molecular. Esto
último con la finalidad de implementar INMEDIATAMENTE las nuevas
metodologías en cada LESP seleccionado.
Los LESP deberán enviar al InDRE, semanalmente (para una oportuna
vigilancia virológica) y de manera obligatoria, el 10% de las muestras positivas a
NS1 para FD y el 100% de las muestras positivas a NS1 para FDH, que serán
procesadas para la detección y serotipificación de virus dengue por RT-PCR
Múltiplex en tiempo real.
Con el objetivo de aumentar el porcentaje de tipificaciones de las muestras
analizadas para este fin; las muestras positivas a NS1, que deben tener entre 0-5
días de evolución, según datos reportados a nivel internacional y obtenidos por
la CEZV-InDRE el mayor éxito en la tipificación viral esta entre 0-3 días. Motivo
por el cual el LESP debe promover enviar las muestras que estén en este rango
de días de evolución.
La solicitud del porcentaje y características de las muestras, puede variar según
las necesidades que el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica considere
pertinentes.
Estas muestras deberán venir acompañadas con el Formato Único de Envío o
cualquiera de los otros formatos previamente mencionados, debidamente
requisados y un listado con los resultados obtenidos para el ensayo de antígeno
NS1 en el LESP (densidad óptica de la muestra, valor de corte e interpretación
de resultado y marca de reactivo usado).
El InDRE emitirá el informe de prueba y lo enviará para que cada LESP capture
inmediatamente dentro de las siguientes 24 horas el resultado en la Plataforma
Única, módulo Dengue.
LABORATORIOS ESTATALES QUE YA REALICEN RT-PCR
MULTIPLEX EN TIEMPO REAL PARA DETECCIÓN E
IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DE VIRUS DENGUE
Control de calidad. Los LESP que se estén incorporando al programa de
control de calidad supervisado por InDRE, deberán coordinarse perfectamente
entre sus áreas de serología o virología y biología molecular para trabajar
conjuntamente de la siguiente manera:

1. De acuerdo con el algoritmo, procesar localmente las muestras para
determinación de antígeno NS1, (no enviar al InDRE) y según el resultado
obtenido, procesar el 10% de las muestras positivas de FD y el 100% de las
muestras positivas de FHD mediante RT-PCR en tiempo real. Con el objetivo
de aumentar el porcentaje de tipificación, las muestras analizadas por RT-
PCR preferentemente deberán tener entre 0-3 días de evolución. Este último
punto puede variar según localidad y deberá ser aplicada según resultados
analizados por el InDRE y el LESP.
2. Las muestras que se envían al InDRE para control de calidad deberán tener
un Cq menor a 32, ya que debido a la inestabilidad del ARN al cambio de
temperatura puede promover perdida y tener resultados discordantes.
3. El LESP enviará al InDRE, las muestras de suero , junto con un listado con
todos los resultados obtenidos para NS1 (densidad óptica de la muestra,
valor de corte e interpretación de resultado) así como el formato de control
de calidad en electrónico, el cual incluirá el resultado de RT-PCR
especificando el serotipo, valor de Cq (ciclo al threshold) y resultados
(gráficos de amplificación) de los ensayos realizados, del 100% de las
muestras positivas y el 10% de las negativas durante seis meses. Este proceso
se realizará hasta obtener una concordancia del 100% y esta deberá
mantenerse durante los últimos cuatro meses consecutivos, para ser
considerada la liberación de la metodología. El formato utilizado para enviar
los gráficos de amplificación al InDRE fue explicado y distribuido en sesión
webex en 2012.
4. En caso de no cumplir con el porcentaje de concordancia requerida para
liberación de la metodología, será necesario realizar una supervisión y
asesoría técnica vía webex o presencial a las instalaciones y personal técnico
responsable de realizar la Vigilancia Virológica de Dengue en el LESP.
*Todos aquellos LESP (NO IMPORTANDO SI TIENE LIBERADA LA
METODOLOGÍA) que identifiquen algún serotipo que en el transcurso de un
año no ha sido identificado en su estado, (circulación sostenida durante 2 años)
DEBERÁ SER INMEDIATAMENTE INFORMADO A LOS SITEMAS DE SALUD
ESTATAL Y FEDERAL y la muestra de suero y/o ARN (ácido ribonucleico)
deberá ser enviada inmediatamente al InDRE para corroborar el resultado del
LESP antes de subir el resultado a plataforma.
*Cualquier otra metodología diferente a la indicada y validada por el InDRE
para la tipificación viral, NO será considerada válida y los resultados obtenidos
NO serán avalados. , hasta no ser enviadas al InDRE las muestras de interés.
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Este cronograma aplica para 2013. El cronograma de los años subsecuentes será
enviado oportunamente vía la Coordinación de la RNLSP.

ACTIVIDAD
ENE
FEB
MAR
ABR
MAY
JUN
JUL
AGO
SEP
OCT
NOV
DIC
Envío del primer
panel Inteligente
Algorítmico único a
la RNLSP
25
Recepción de
resultados en el
InDRE primer panel
Inteligente
la RNLSP
2
Envío de resultados
primer panel
Inteligente
la RNLSP (e-mail
oficial / físico).
9/23
Envío del segundo
panel primer panel
Inteligente
la RNLSP
05
Recepción de
resultados en el
InDRE primer panel
Inteligente
la RNLSP
12
Envío de resultados
a la RNLSP primer
panel Inteligente
la RNLSP (e-mail
oficial / físico).
19/26
Recepción de
muestras para
identificación de
serotipos
X X X X X X X X X X X X
Supervisión a la
RNLSP
Envío de muestras
para Banco de
Sueros
X X
Envío de informe
semanal de
existencia de
reactivos
Curso de
actualización Vía
Webex
X
X
X
Curso de
actualización en
Arbovirus
*Nota: Si alguna fecha coincide con día no laborable, la actividad se cambia al
siguiente día hábil inmediato.

Para brindar un mejor servicio, el envío y recepción de información, resultados,
dudas, comentarios, asesorías técnicas, etc. será únicamente a través de correo
electrónico: laboratorioarbovirusindre@yahoo.com.mx
Finalmente todos los LESP deberán enviar de manera semanal el informe de la
existencia de reactivos para realizar diagnóstico y vigilancia virológica, al
laboratorio de Arbovirus del InDRE (por correo electrónico).
BIBLIOGRAFÍA
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2. Dussart P., Labeau B., Lagathu G., et al Evaluation of an Enzyme
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16. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of
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17. Chosewood C & Wilson DE. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories – 5th ed. CDC-NIH; 2009.
18. European Committee for Standardization. CWA 15793:2011 Laboratory
biorisk management standard. Brussels: CEN; 2011.
19. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual – 3rd ed. Geneva:
WHO Press; 2004.
20.Reglamento Interior de la Secretaría de Salud, publicado en el Diario Oficial
de la Federación el 19 de enero de 2004, última reforma publicada DOF 10
de enero de 2011

ANEXO I. TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS Y PREPARACIÓN DE
REACTIVOS
SEROLOGÍA
1. Determinación del antígeno viral NS1 del virus dengue por ELISA
ELISA PLATELIA NS1
El estuche comercial (Platelia NS1), es un método inmunoenzimático en una
etapa, tipo sándwich, en formato de microplaca de 96 pozos, útil en la detección
cualitativa o semi-cuantitativa del antígeno NS1 del virus del Dengue en suero o
en plasma humano. La prueba utiliza anticuerpos monoclonales de ratón
(AcMo) para su captura y revelación.
Las muestras de pacientes y los controles son incubados directa y
simultáneamente con el conjugado diluido durante 90 minutos a 37° C. El
antígeno NS1 presente en la muestra, formará complejos inmunes: AcMo - NS1 -
AcMo - Peroxidasa. Después de los lavados practicados al final de cada
incubación, la presencia del complejo inmune es revelada mediante la solución
de revelado enzimática, la cual induce el desarrollo de una reacción coloreada
(azul). A los 30 min de incubación a temperatura ambiente, la reacción
enzimática es interrumpida mediante la adición de una solución ácida (solución
de paro). La densidad óptica obtenida a 450/620 nm es proporcional a la
cantidad de antígeno NS1 presente en la muestra. La presencia del antígeno en
una muestra individual se establece mediante la comparación de la densidad
óptica leída en esta muestra con la obtenida en el suero del valor umbral.
Equipo
 Gabinete de bioseguridad tipo II
 Baño de agua o Incubadora a 37° C
 Micropipeta, 50 a 200 µL
 Micropipeta multicanal de 20 a 200 µL
 Espectrofotómetro
 Sistema de lavado manual o automático (si se cuenta con él, en caso
contrario se pueden hacer los lavados manuales utilizando una pizeta).
Materiales
 Puntas adecuadas para los volúmenes de cada una de las micropipetas
 Gasas
 Cristalería general para laboratorio
 Agua bidestilada o desionizada estéril
 Probeta graduada de 1000 mL
 Guantes desechables
 Contenedor de residuos contaminantes
 Toallas de papel
Reactivos

Los siguientes reactivos vienen incluidos en el estuche comercial Platelia NS1
Dengue, el volumen utilizado de cada uno de ellos dependerá de la cantidad de
sueros que se procesen. Están etiquetados con un símbolo (letra y número) para
su fácil identificación.
 Microplaca (R1) (listo para su uso): 12 tiras de 8 pozos cada una
sensibilizada por AcMo anti-NS1, en bolsas herméticas al vacío.
 Solución de lavado concentrado 10x (R2): Solución amortiguadora
Tris-NaCl (pH 7.4) y 1% de Tween 20.
 Control negativo (R3): Suero humano negativo para el antígeno NS1
Dengue.
 Control valor de corte (R4): Suero con antígeno NS1 Dengue que
contiene solución reguladora TRIS-NaCl (pH 8.0), suero albúmina bovina y
glicerol.
 Control positivo (R5): Suero con antígeno NS1 Dengue que contiene
solución reguladora TRIS-NaCl (pH 8,0), suero albúmina bovina y glicerol.
 Conjugado 50x (R6): AcMo anti-NS1 conjugado con peroxidasa.
 Diluyente (R7): Solución reguladora que contiene Tween 20 y suero fetal
de ternera.
 TMB (R8): Solución de ácido cítrico y de acetato sódico que contiene
0.015% de H2O2 y 4% de dimetilsulfóxido (DMSO).
 Cromógeno concentrado 11x (R9): Solución que contiene 0.25% de 3,3’,
5,5’ Tetrametilbenzidina.
 Solución de paro (R10) (listo para su uso): Ácido sulfúrico 1N
 Películas adhesivas
Condiciones para tomar en cuenta
a. La calidad de los resultados depende de la aplicación de las buenas prácticas
de laboratorio.
b. Diluir cuidadosamente los reactivos evitando su contaminación.
c. No dejar secar la placa al final de los lavados y entre la distribución de los
reactivos.
d. No mezclar ni combinar de una misma serie de reactivos procedentes de
cajas con números de lotes distintos, solo se puede utilizar la solución de
lavado, el tampón de sustrato, cromógeno y de solución de parada.
e. El lavado de cada pozo es una etapa fundamental de manipulación por lo
cual, se debe respetar el número de ciclos de lavado, un lavado inadecuado
puede modificar los resultados finales.
Procedimiento analítico
1. Antes de realizar la detección del NS1, deberá establecerse un plan de
distribución e identificación de muestras y controles, así como de los
sueros problema.
2. Para poder validar del ensayo se utiliza un control negativo, dos
valores umbrales o calibradores y un control positivo (no deberá
excluirse ninguno).
3. Sacar el soporte y las tiras del empaque protector.

4. Se realiza la siguiente secuencia de colocación de los reactivos en cada uno de
los pozos:
 Agregar 50 μL de diluyente (R7) en cada pozo (color naranja).
 Agregar 50 μL de muestras (controles y muestras problema).
 Agregar 100 μL de conjugado diluido 1:50 a cada pozo (color verde) + 20 µL
de R6 + 1.0 mL de R7 representan un volumen suficiente para 8 pozos.
*Es importante que la solución de conjugado se prepare antes de comenzar a
diluir los sueros
 Tapar la superficie con la película adhesiva.
 Incubar la microplaca durante 90±5 minutos a 37±1° C.
 Diluir la solución de lavado concentrada 10x en agua bidestilada (900 mL
de agua bidestilada + 100 mL de solución de lavado 10x).
 Al finalizar la incubación, retirar la película adhesiva y verter el contenido
de todos los pozos en un contenedor de residuos contaminantes que
contenga hipoclorito de sodio. Lavar los pozos 6 veces (lavado manual). Si el
lavado es de manera automatizada, procurar verificar el equipo antes y
después de su uso siguiendo las indicaciones del proveedor, terminado el
último aspirado se deberá eliminar el exceso de solución de lavado sobre
papel absorbente.
 Agregar 160 µL de la solución de revelado, diluyendo 1:11 el cromógeno (R9)
en solución de peróxido de hidrógeno (R8), 150 µL de R9 + 1.5 mL de R8
(volumen suficiente para 8 pozos). Dejar que la reacción se desarrolle
incubando a temperatura ambiente, durante 30 ±5 minutos y protegida de
la luz. Los pozos con el testigo positivo, los calibradores y en aquellos donde
la muestra presente antígeno NS1 Dengue, desarrollaran un color azul.
Es importante que la solución de revelado no presente coloración antes de
adicionarla.
 Agregar 100 µL de solución de paro (R10) en cada pozo. En los pozos con el
control positivo, los calibradores y muestras problema que presente
antígeno NS1 Dengue, el color azul cambiará a amarillo.
Cálculo de resultados
Cálculo de valor de corte:
El valor umbral (CO), corresponde a la media de las densidades ópticas de los
duplicados del Control Valor de corte (R4).
Cálculo de cada una de las muestras:
Los resultados se obtienen con la relación siguiente:
S (Densidad óptica obtenida de la muestra)
CO (Valor de corte)
Resultado de las muestras problema = S/CO
Validación del ensayo

Para validar el ensayo, se deberá cumplir los siguientes criterios:
Valor de densidad óptica del valor de corte:
CO = >0.2
Relación del control negativo (R3) y control positivo (R5).
Relación R3 = <0.4 (Relación R3 = DOR3/CO)
Relación R5 = >1.5 (Relación R5 = DO R5/CO)
*Si no se cumple con las especificaciones anteriores, se deberá repetir el ensayo.
Interpretación de los resultados
Para seguir los criterios es necesario que los resultados estén dentro de la
siguiente relación:
NEGATIVO. Muestra con una relación menor a 0.5, es considerada no reactiva
(negativa) para el antígeno NS1 del virus dengue.
DUDOSO. Muestra con una relación entre 0.5 y 1.0, se considerada dudosa
para el antígeno NS1 del virus dengue, por lo que la muestra debe de analizarse
nuevamente.
POSITIVO. Muestra con una relación mayor a 1.0, se considera reactiva
(positiva) para el antígeno NS1 del virus dengue.
NOTA: Las densidades ópticas obtenidas en las muestras altamente reactivas
pueden alcanzar la densidad óptica máxima y presentarse como SOBRE.
Reporte de resultados
 Indicar el valor obtenido de la muestra.
 Indicar el valor para la interpretación de los resultados.
 Indicar la interpretación de resultados (positivo o negativo)
 Indicar la marca del reactivo usado.
Early ELISA NS1
El estuche comercial Early ELISA NS1, es un método inmunoenzimático tipo
sándwich en formato de microplaca de 96 pozos, que se desarrolla en una etapa,
útil en la detección del antígeno NS1 del virus del Dengue en suero.
El antígeno NS1, si está presente en el suero, se une al anticuerpo anti-NS1 que
está fijado a los pozos de poliestireno. El exceso de suero se elimina por lavado y
después se agrega un segundo anticuerpo anti NS1 marcado con peroxidasa.
Después de la incubación y un lavado para eliminar el exceso de reactivos, se
adiciona el sistema sustrato-cromógeno (TMB-peróxido de hidrógeno). La

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