1. ExtracciExtraccióón y purificacin y purificacióónn
de ADNde ADN
Bioq. Florencia LongoBioq. Florencia Longo
Laboratorio de DetecciLaboratorio de Deteccióón de OGMn de OGM
Instituto de BiotecnologInstituto de Biotecnologííaa –– INTAINTA
2. Pasos del AnPasos del Anáálisis delisis de OGMsOGMs
INFORMEINFORME
MuestraMuestra
ExtracciExtraccióónn
de ADNde ADN PCRPCR
3. PreparaciPreparacióón de la muestra para lan de la muestra para la
extracciextraccióón de ADNn de ADN
Cantidad de muestraCantidad de muestra
Grado de homogenizaciGrado de homogenizacióónn
TamaTamañño de parto de partíículacula
4. ExtracciExtraccióón de ADNn de ADN
ObjetivoObjetivo
CantidadCantidad
IntegridadIntegridad
PurezaPureza
Ausencia de contaminacionesAusencia de contaminaciones
PCRPCR
5. ExtracciExtraccióón de ADNn de ADN
Tipo de muestraTipo de muestra
TargetTarget a analizara analizar
Grado de procesamiento de la muestraGrado de procesamiento de la muestra
Tipo de anTipo de anáálisis requeridolisis requerido
Resultados deseadosResultados deseados
Tener en cuentaTener en cuenta
6. ExtracciExtraccióón de ADNn de ADN
Tipo de muestras a analizarTipo de muestras a analizar
AlimentosAlimentos
GranosGranos
SemillasSemillas
HarinasHarinas
HojasHojas
7. ExtracciExtraccióón de ADNn de ADN
PequePequeññososTamaTamaññoo frag.ADNfrag.ADNMedianosMedianos
Mediana aMediana a
altaalta
Presencia dePresencia de
inhibidoresinhibidores
BajaBaja
ComplejosComplejosProtocolosProtocolos
extracciextraccióónn
SencillosSencillos
AltaAltaHomogenizaciHomogenizacióónnBajaBaja
BajaBajaCantidadCantidadAltaAlta
BajaBajaCalidadCalidadAltaAlta
AlimentosAlimentosCaracterCaracteríísticassticasGranosGranos
8. ExtracciExtraccióón de ADN den de ADN de
AlimentosAlimentos
DistintosDistintos
tratamientostratamientos
FFíísicosico
QuQuíímicomico
EnzimEnzimááticotico
Distintos y mDistintos y múúltiplesltiples
ingredientesingredientes
CremasCremas
Salsas, especiasSalsas, especias
AzAzúúcarescares
Sales, etc.Sales, etc.
DisminuciDisminucióón en la calidad y cantidad de ADNn en la calidad y cantidad de ADN
Presencia de inhibidores de PCRPresencia de inhibidores de PCR
9. Pasos de los mPasos de los méétodos detodos de
ExtracciExtraccióón de ADNn de ADN
PrePre--tratamientotratamiento
NeutralizaciNeutralizacióón (muestrasn (muestras áácidas)cidas)
Tratamiento con solventes orgTratamiento con solventes orgáánicos (grasas)nicos (grasas)
Lisis celularLisis celular
DisrupciDisrupcióón mecn mecáánicanica
Agente quAgente quíímicosmicos
PurificaciPurificacióón de ADNn de ADN
PrecipitaciPrecipitacióónn
Matrices (Matrices (kitskits comerciales)comerciales)
11. ExtracciExtraccióón paran para remover contaminantesremover contaminantes
FenolFenol
CloroformoCloroformo
PrecipitaciPrecipitacióónn
SustanciasSustancias coco--precipitantes (CTAB, PVP)precipitantes (CTAB, PVP)
PrecipitaciPrecipitacióón final conn final con IsopropanolIsopropanol y/oy/o
etanoletanol
PurificaciPurificacióón de ADNn de ADN
MMéétodos tradicionalestodos tradicionales
12. PurificaciPurificacióón de ADNn de ADN
MMéétodos comercialestodos comerciales
MetodoMetodo basados enbasados en silicasilica
Columnas deColumnas de silicasilica
AgentesAgentes caotrcaotróópicospicos
ElusiElusióón conn con isopropanolisopropanol/etanol/etanol
ADNADN
ADNADN
purificadopurificado
13. ElecciEleccióón del mn del méétodo detodo de
extracciextraccióónn
Tipo de muestraTipo de muestra
TargetTarget a detectara detectar
Grado de pureza requeridaGrado de pureza requerida
Cantidad de ADNCantidad de ADN
RendimientoRendimiento
Integridad requeridaIntegridad requerida
Presencia de inhibidoresPresencia de inhibidores
14. ElecciEleccióón del mn del méétodo detodo de
extracciextraccióónn
Capacidades del laboratorioCapacidades del laboratorio
Cantidad de muestras a analizarCantidad de muestras a analizar
Facilidades de usoFacilidades de uso
RepetibilidadRepetibilidad
AplicacionesAplicaciones
Tiempo de anTiempo de anáálisislisis
CostosCostos
15. Resultados de la extracciResultados de la extraccióónn
Incluir siempreIncluir siempre
CONTROLESCONTROLES
PositivosPositivos
Muestras positivasMuestras positivas
NegativosNegativos
Blanco de reactivosBlanco de reactivos
Blanco de muestrasBlanco de muestras
Chequeo de ausenciaChequeo de ausencia
de inhibicide inhibicióónn
Muestras positivasMuestras positivas
16. Resultados de la extracciResultados de la extraccióónn
ResultadoResultado
esperadoesperado
Falsos positivosFalsos positivos
ContaminacionesContaminaciones
Falsos negativosFalsos negativos
ADN degradado resultadoADN degradado resultado
del procesamientodel procesamiento
ADN degradado resultadoADN degradado resultado
de la extraccide la extraccióónn
Presencia de inhibidoresPresencia de inhibidores
óó
17. Inhibidores de PCRInhibidores de PCR
En los alimentosEn los alimentos
ProteProteíínasnas
PolisacPolisacááridosridos
GrasasGrasas
SalesSales
ÁÁcidoscidos
MMéétodo de extraccitodo de extraccióónn
DetergentesDetergentes
FenolFenol
Residuos orgResiduos orgáánicosnicos
EDTAEDTA
EtanolEtanol
IsopropanolIsopropanol
SalesSales
18. EvaluaciEvaluacióón del ADN extran del ADN extraíídodo
EspectrofotometrEspectrofotometríía (260/280a (260/280 nmnm))
EvalEvalúúo cantidad de ADNo cantidad de ADN
No evalNo evalúúo calidado calidad
Electroforesis/ Bromuro deElectroforesis/ Bromuro de etidioetidio
EvalEvalúúo cantidad de ADNo cantidad de ADN
EvalEvalúúo calidad (degradacio calidad (degradacióón, presencia den, presencia de
RNA)RNA)
19. EvaluaciEvaluacióón del ADN extran del ADN extraíídodo
FluorometrFluorometrííaa
EvalEvalúúo cantidado cantidad
No evalNo evalúúo calidado calidad
PCR de genes endPCR de genes endóógenosgenos
EvalEvalúúo cantidad de ADNo cantidad de ADN
EvalEvalúúo calidado calidad
Matrices con poco DNAMatrices con poco DNA
21. InformaciInformacióón de contacton de contacto
Laboratorio de DetecciLaboratorio de Deteccióón den de OGMsOGMs
Instituto de BiotecnologInstituto de Biotecnologííaa –– INTAINTA
Contactos:Contactos:
Dr. EstebanDr. Esteban HoppHopp
Bioq. Florencia LongoBioq. Florencia Longo
TelTelééfono: (54fono: (54--11) 462111) 4621--1278/14471278/1447
EE--mail:mail: ehopp@cicv.inta.gov.arehopp@cicv.inta.gov.ar
flongo@cicv.inta.gov.arflongo@cicv.inta.gov.ar
