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1. CLONACIÓN
EUGENIA GRISOLIA

2. Clonación o Ingeniería genética
Hablar de Clonación en Ingeniería Genética significa, la
introducción de una molécula de ADN foráneo a un cultivo
con el objeto de obtener grandes cantidades de producto
deseado.

3. SISTEMA DE CLONACIÓN

4. El SISTEMA DE CLONACIÓN
consta de dos partes:
Es una molécula de ADN capaz Es una célula donde el vector
de incorporar un segmento de pueda expresarse
ADN foráneo y replicarse.
VECTOR DE
CLONACIÓN
HOSPEDANTE

5. Vectores
Vehículos para luego ser introducidos a una célula
Características :
 sitio ori (origen para la replicación que le permitirá
replicarse en forma independiente)
Un marcador genético que le permita ser identificado y
seleccionado, los más utilizados son los genes que
codifican mecanismos de resistencia a antibióticos.
Sitios de restricción, donde se insertará el fragmento de
ADN de interés.

6. Son moléculas de ADN circulares de doble cadena y relativamente
pequeños, éstos son los vectores más usados y sirven para clonar
fragmentos de máximo 10 Kb, más que éstos tienden a volverlo muy
inestable.
Plásmidos

7. Lambda (ʎ ), 48 Kb, de éstas la 15 Kb centrales al no ser esenciales para su ciclo lítico o de
replicación puede ser reemplazada por el ADN de interés.
Fagos

8. Son vectores híbridos del fago ʎ (sitios cohesivos) y un plásmido que aportan un
ori y genes que codifican resistencia a antibióticos.
Así se obtiene una molécula similar a un plásmido pero con la capacidad de
empaquetar entre 35 y 45 Kb.
Cósmidos

9. .
Surgieron en los años 80 para clonar grandes fragmentos
de ADN
YACs
Son derivados de cromosomas de
levadura. Tienen todas las
características (Ori, centrómeros y
telómeros).
 Se pueden clonar fragmentos de
hasta 1000 Kb
 inestables al poseer tantos insertos
híbridos y son difíciles de purificar.
Cromosomas artificiales

10. .BACs
Derivados del plásmido F de E.coli , son más estables que los Yacs y pueden
clonarse fragmentos de ADN de hasta 300 Kb.

11. Hospedantes
Células que recibe el material genético para expresar sus
productos
Dentro de los cuales los mas importantes se encuentran:

12. I. E.coli :
 Se conoce su mapa genético completamente
 es potencialmente patógena.
I. Bacillus subtilis:
 No es patógena, ni produce endotoxinas
 Es fácilmente transformable
 La mantención de plásmidos es inestable.
I. Levaduras:
 Son importantes en aspectos como estudios en regulación génica en
hospedantes.
 Genéticamente se conoce
 No se conocen sus mecanismos de expresión génica

13. PROCESO DE CLONACIÓN
 Obtención del ADN
 Corte y Ligamiento
 Transformación
 Detección y aislamiento de los
clones

14. Obtención del ADN
 Cromosomal
 Vector

15. 1.- CROMOSOMAL
El ADN que se quiere insertar en el vector debe ser
ubicado por diferentes técnicas:
PCR
Centrifugación en gradiente de densidad,
Cromatografía líquida de alta presión (HPLC),
mRNA en una célula especializada para el producto a
partir de la cual se obtendrá un cDNA por
retrotranscripción.

16. 2.- VECTOR
Como se explicó en secciones anteriores, los vectores
pueden ser, plásmidos, fagos, cósmidos o cromosomas
artificiales. Que se obtendrá con diferentes técnicas
dependiendo de su origen

17. Corte y ligamiento

18. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

19. ligamientoADN LIGASAS
Si dos fragmentos de ADN tienen extremos complementarios,
la ADN ligasa puede unirlos para formar una molécula sin
interrupciones.
Las ligasas también unen fragmentos romos sin embargo es
menos eficiente al no tener los extremos sobresalientes de
cadena sencilla que sostenga el ADN en su posición.

20. ADN LIGASAS
Tanto el vector como el gen que se va a insertar en el vector deben ser
cortados con la misma enzima de restricción para que generen los
mismos extremos complementarios y luego serán unidas por la ADN
ligasa

21. TRANSFORMACIÓN

22. ligamiento
TRANSFORMACIÓN (bacterias)
TRANSFECCIÓN (células eucariotas)
hacer competentes a las células consiste en tratarlas previamente para que sean
capaces de internalizar el ADN.
Las células se hacen competentes con CaCl2 que permeabiliza la membrana , y en el
caso de bacterias un shock térmico cambia la fluidez de la membrana y/o causa la
formación de poros lo que facilita el ingreso del ADN a la célula.

23. DETECCIÓN Y AISLAMIENTO DE
LOS CLONES

24. ligamiento
Marcador genético
Un marcador ampliamente utilizado, por la facilidad de su uso, es la resistencia a
antibióticos.
En este caso las bacterias son sembrada en medios selectivos que contengan el o
los antibióticos en cuestión, de tal manera que sólo sobrevivirán aquellas colonias
de bacterias donde la transformación de l vector recombinante haya sido exitosa.

25. ligamiento
A partir de estas colonias luego se hará un cultivo puro en cultivo
líquido para su producción y purificación del producto.