Phân lập và định danh vùng gen its của nấm men nhiễm bệnh trên da chó nuôi tại tp. hồ chí minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VÙNG GEN ITS
CỦA NẤM MEN NHIỄM BỆNH TRÊN DA CHÓ NUÔI
TẠI TP. HỒ CHÍ MINH
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC- THỰC PHẨM- MÔI TRƯỜNG
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: Ts. Hoàng Quốc Khánh
Ngô Đức Duy
Sinh viên thực hiện: Huỳnh Long Thủ
MSSV: 1051110154 Lớp: 10DSH01
TP. Hồ Chí Minh, 2014

LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên Huỳnh Long Thủ, là sinh viên đại học chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học,
khóa 2010, tại trường Đại học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh. Tôi xin cam đoan:
✓ Công trình nghiên cứu này do chính tôi thực hiện.
✓ Các số liệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố ở các
nghiên cứu khác hay trên bất kỳ phương tiện truyền thông nào.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong Luận văn tốt
nghiệp của mình.
SINH VIÊN
Huỳnh Long Thủ

Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
MỤC LỤC ..........................................................................................................................i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................iv
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH....................................................................v
MỞ ĐẦU ...........................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................4
1.1. Tình hình nuôi chó..................................................................................................4
1.1.1. Thống kê về số lượng chó trên thế giới............................................................4
1.1.2. Tình hình nuôi chó ở Việt Nam ........................................................................5
1.2. Tổng quan về bệnh ngoài da...................................................................................6
1.2.1. Bệnh ngoài da trên chó ....................................................................................6
1.2.2. Bệnh ngoài da của người .................................................................................7
1.3. Các tác nhân gây bệnh ............................................................................................7
1.3.1. Vi khuẩn............................................................................................................7
1.3.1.1. Một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ngoài da thường gặp.............................7
1.3.1.2. Các biểu hiện do nhóm vi khuẩn gây ra....................................................7
1.3.1.3. Khả năng lây lan sang người.....................................................................8
1.3.2. Nấm men...........................................................................................................8
1.3.2.1. Các loài nấm men thường gây bệnh trên da chó ......................................8
1.3.2.2. Các biểu hiện bệnh do nhóm nấm men gây ra..........................................8
1.3.2.3. Khả năng lây lan sang người.....................................................................9
1.3.3. Nấm sợi.............................................................................................................9
1.3.3.1. Một số nhóm nấm mốc gây bệnh thường gặp. ..........................................9
1.3.3.2. Bệnh và các biểu hiện bệnh do các nhóm nấm mốc gây ra......................9
1.4. Tổng quan về nấm men.........................................................................................10
1.4.1. Hình thái của tế bào nấm men .......................................................................10
1.4.2. Dinh dưỡng và sinh trưởng của nấm men .....................................................10

ii
1.4.3. Sinh sản của nấm men....................................................................................11
1.4.4. Nấm men gây bệnh .........................................................................................12
1.5. Những nghiên cứu trên thế giới về nấm men gây bệnh .......................................12
1.6. Định danh nấm men..............................................................................................13
1.6.1. Định danh nấm men bằng phương pháp truyền thống..................................14
1.6.1.1. Quan sát các đặc điểm hình thái .............................................................14
1.6.1.2. Khảo sát các đặc tính sinh lí, sinh thái ...................................................14
1.6.2. Định danh nấm men bằng sinh học phân tử..................................................15
1.6.2.1 Đoạn gen rDNA ........................................................................................15
1.6.2.2. Nhân gen và Kỹ thuật giải trình tự trong định danh loài ......................17
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................................19
2.1. Vật liệu và thiết bị.................................................................................................19
2.1.1. Dụng cụ...........................................................................................................19
2.1.2. Thiết bị............................................................................................................19
2.1.3. Vật liệu............................................................................................................19
2.1.3.1. Nguồn phân lập........................................................................................19
2.1.3.2. Hóa chất...................................................................................................20
2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................21
2.2.1. Phân lập nấm men gây bệnh..........................................................................21
2.2.2. Quan sát hình thái nấm men ..........................................................................22
2.2.2.1. Quan sát tế bào nấm men ........................................................................22
2.2.2.2. Quan sát khuẩn ty thật khuẩn ty giả........................................................23
2.2.3. Sử dụng sinh học phân tử định danh nấm men..............................................24
2.2.3.1. Tách chiết DNA........................................................................................24
2.2.3.2. Điện di......................................................................................................24
2.2.3.3. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) ........................................25
2.2.3.4. Giải trình tự và định danh mẫu nấm men ...............................................29

iii
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...................................................................33
3.1. Kết quả hình thái học nấm men............................................................................33
3.1.1 Kết quả khuẩn lạc............................................................................................33
3.1.2. Kết quả hình ảnh tế bào sinh dưỡng..............................................................34
3.1.3. Kết quả quan sát tế bào sinh sản ...................................................................35
3.1.4. Kết quả quan sát khuẩn ty..............................................................................35
3.2. Kết quả li trích, thu nhận và nhân bản đoạn gen ITS rDNA của nấm men.........36
3.2.1. Kết quả ly trích và thu nhận bộ gen của nấm men ........................................36
3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men......................36
3.3. Kết quả so sánh vùng gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men trên ngân hàng gen
NCBI và thiết lập cây phân loài...................................................................................37
3.3.1. Kết quả Giải trình tự vùng gen ITS rDNA của 4 mẫu nấm men ...................37
3.3.2. Kết quả so sánh trình tự ITS rDNA trên ngân hàng gen NCBI và xây dựng
cây phân loài.............................................................................................................39
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................43
4.1. Kết luận.................................................................................................................43
4.2. Đề nghị..................................................................................................................43
Tài liệu tham khảo...........................................................................................................45

iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Bp Base Pair
DNA Deoxyribonucleotide Acid
EDTA Ethylene- diamine-Tetraacetic-Acid
PCR Polymerase Chain Reatio
PDA Potato Dextrose Agar
TAE Tris-Acetic acid- Ethylenediamine- Tetraacetae
TE Tris- Ethylenediamine- Tetraacet

v
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH
Bảng
Bảng 1.1 Phát hiện về nấm men gây bệnh từ năm 1989 đến 1993…………..………..13
Bảng 1.2 Internal transcribed spacer region (ITS region, including the 5.8S gene)…..17
Bảng 3.1 Hình ảnh kết quả hình thái khuẩn lạc ………………………………………33
Bảng 3.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng…………………………………………………34
Bảng 3.3 Hình ảnh tế bào sinh sản của nấm men……………………………………...35
Bảng 3.4 Hình ảnh quan sát khuẩn ty …………………………...……………..……..35
Hình ảnh
Hình 1.1 Bảng đồ primer ITS……………………………………………..…………..17
Hình 3.1 Kết quả kiểm tra ly trích bộ gen của 4 mẫu nấm men………..……………..36
Hình 3.2 Kết quả sản phẩm PCR ……………………………………….…………….37
Hình 3.3 Kết quả sản phẩm PCR M23-2 ……………………………………..………37
Hình 3.4 Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự vùng gen ITS rDNA của các
chủng nấm men phân lập( M9-1, M9-5, M11-1, M23-2) và các loài nấm men trong
ngân hàng
gen……………………………………………………………………………………..39

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Chó là người bạn thân thiết của con người, con người tiếp xúc với chó gần như
là mọi lúc, dù là trực tiếp hay gián tiếp. Chính vì thế mà việc lây nhiễm những căn
bệnh nguy hiểm của chó sang người là một vấn đề đáng quan tâm. Hiện nay, khi nhu
cầu sở hữu một con chó làm thú cưng của con người ngày càng cao, về đa dạng, chủng
loài và số lượng ngày càng nhiều, cùng với điều kiện nuôi đa dạng cho nên có nhiều
hơn căn bệnh xuất hiện trên chó và có khả năng lây lan sang người.
Trong các căn bệnh dễ lây lan sang người thì các căn bệnh ngoài da trên chó là
những bệnh dễ tấn công sang người nhất. Vì chỉ cần thông qua tiếp xúc trực tiếp hay
gián tiếp, và trong một điều kiện thích hợp thì con người cũng bị lây nhiễm.
Có nhiều tác nhân gây bệnh ngoài da trên chó, trong đó nấm men cũng là một
tác nhân quan trọng có thể gây nên những hậu quả nghiêm trọng cho chó và cả con
người. Vì thế để xác định được các loài nấm men đó thì trong khóa luận này sẽ tiến
hành phân lập và bước đầu định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử trên vùng gen ITS
rDNA nhằm xác định một số chủng nấm men nhiễm bệnh da trên chó nuôi tại thành
phố Hồ Chí Minh.
2. Mục đích nghiên cứu
✓ Cung cấp những thông tin chính xác về một số chủng nấm men nhiễm bệnh da
trên chó cũng như khả năng lây lan của chúng sang con người, nhằm tăng khả
năng điều trị và phòng ngừa lây lan khi chó bị nhiễm những loại nấm men trên.

2
✓ Tạo nguồn giống nấm men thuần cho những nghiên cứu chuyên sâu về bệnh học
của các loài nấm men đã định danh được.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
✓ Phân lập được một số nấm men nhiễm bệnh da trên chó nuôi tại thành phố Hồ
Chí Minh.
✓ Định danh nấm men bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên việc giải trình
tự đoạn gen ITS rDNA của nấm men.
✓ Bước đầu xác định khả năng gây bệnh của các loài nấm men đã định danh dựa
trên các nghiên cứu trên thế giới.
4. Phương pháp nghiên cứu
✓ Sử dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gen bảo tồn ITS rDNA
của nấm men để định danh nấm men.
✓ Các tài liệu phục vụ nghiên cứu được tham khảo từ các nghiên cứu, các bài báo
khoa học, các luận văn khoa học được sưu tầm trên internet.
✓ Đề tài có sử dụng các phần mềm: BioEdit 7.2.5.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4
4.32.0.0
✓ Ngân hàng gen http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
5. Các kết quả đạt được
Sau quá trình nghiên cứu đề tài đã phân lập và định danh được 4 loài nấm men, dựa
trên các nghiên cứu trên thế giới thì bước đầu nhận định cả 4 loài nấm men này đều có
khả năng gây bệnh nguy hiểm trên chó và cả con người.
6. Kết cấu đề tài
Đề tài gồm 4 chương

3
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trình bày những thông tin liên quan đến chó, nấm men và các thông tin về phương
pháp sinh học phân tử đã được sử dụng trong định danh nấm men.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Trình bày toàn bộ những nguyên vật liệu, địa điểm, máy móc thiết bị phục vụ nghiên
cứu và toàn bộ các quy trình, thao tác thực hiện các phương pháp nghiên cứu.
Chương 3: Kết quả và biện luận
Trình bày những kết quả chi tiết của toàn bộ quá trình thực hiện nhiên cứu.
Chương 4: Kết luận và đề nghị
Tổng kết lại những kết quả nghiên cứu đã đạt được và đưa ra những đề nghị liên quan
nhằm hoàn thiện đề tài.

4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nuôi chó
Ngay từ thời tiền sử, khi loài người còn phải sống bằng các phương thức săn bắt,
hái lượm, sống trong hang động. Khi tìm ra lửa, con người đã biết chế biến thức ăn đầu
tiên bằng phương pháp nướng thịt thú rừng và sản phẩm thừa là xương động vật, đó là
món khoái khẩu của chó rừng, một loài động vật có khứu giác rất phát triển. Đó chính
là nguyên nhân khiến loài người và loài chó "tiếp cận" với nhau và cùng chung sống.
Chó nhờ vào bản năng tự nhiên rất thính tai, thính mũi, có thể tìm ra được dấu vết cũng
như khả năng nhìn trong bóng đêm rõ hơn con người, rất tỉnh ngủ, có trí thông minh và
dễ huấn luyện.Vì thế con người đã sớm biết sử dụng chó để bảo vệ cho mình. Chó lại
là một giống vật có tình nghĩa nhất khi so sánh với các con vật khác đã sống gần gũi
với con người như trâu, bò, ngựa v.v…
1.1.1. Thống kê về số lượng chó trên thế giới
Số lượng chó được con người nuôi trên thế giới là một con số thống kê rất khó
để đạt độ chính xác cao, vì ở một số quốc gia đặc biệt các quốc gia ở châu Á và châu
Phi thì chó được nuôi một cách tự do, có nghĩa là không có bất cứ một hệ thống quản
lý nào nhằm quản lý và kiểm soát số lượng chó của người dân.
Tuy nhiên trong một nỗ lực nghiên cứu thị trường, nhằm đánh giá tiềm năng của
ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm vật nuôi của Mỹ, đã đưa ra được một số thống
kê sơ bộ về số lượng chó trên thế giới.
Theo đó Mỹ là quốc gia đứng đầu về số lượng chó mà người dân họ sở hữu, với
42,5 triệu hộ gia đình ở Mỹ nuôi một hoặc nhiều con chó và tổng số chó trong cả nước
là 73 triệu con. Canada có 6 triệu con chó. [1]
Các nước Tây Âu cũng sở hữu 43 triệu con trong đó: đứng đầu là Pháp 8,8 triệu
con chó, cả Ý và Balan có 7,5 triệu, Anh có 6,8 triệu. Ở Đông Âu, Nga hiện có 12 triệu

5
con chó trong khi Ukraina cũng có 5,1 triệu con chó. Ở Nam Mỹ thì Brazil với 30 triệu
con, Argentina 6,5 triệu con, Columbia 5 triệu con. [1]
Ở châu Á và châu Úc thì việc thống kê số lượng chó gặp nhiều khó khăn khi
việc đăng ký sở hữu chó là một điều không cần thiết ở nhiều quốc gia trên châu lục
này. Nhưng theo ước tính Trung Quốc có khoảng 110 triệu con chó, Ấn Độ có khoảng
32 triệu con, Úc khoảng 4 triệu con. Các con số trên là chưa tính tới số lượng chó sống
tự do và đi hoang. Tuy nhiên, Nhật Bản lại là quốc gia thuộc châu Á quản lý chặt chẽ
nhất số lượng chó nuôi của người dân theo ước tính là khoảng 9,5 triệu con. [1]
Ở châu Phi, theo những thống kê của tổ chức Y tế thế giới về số lượng chó
nhằm kiểm soát bệnh dại trên người đang gia tăng, thì có khoảng 78 triệu con chó trên
toàn châu lục và trong số đó có tới 70 triệu con là chó hoang vô chủ. [1]
1.1.2. Tình hình nuôi chó ở Việt Nam
Ở Việt Nam, việc nuôi chó mèo và chim cảnh trong gia đình đã có từ lâu đời. Hầu
như trong mỗi gia đình nào của người dân nước ta cũng đều nuôi chó và mèo, với chức năng
chính là bảo vệ, diệt chuột… Ngày nay, khi nền kinh tế đã tương đối phát triển, nghề nuôi
chim, thú cảnh trong nhà càng phát triển, nhất là ở các thành phố lớn.
Gần đây, ở nước ta việc sử dụng chó nghiệp vụ vào công tác an ninh quốc
phòng đã và đang phát triển theo nhu cầu bảo vệ các xí nghiệp, cơ quan, cơ sở nông
nghiệp, kho tàng và mục tiêu quân sự. Số người yêu thích chó nghiệp vụ và chó làm
cảnh ngày một tăng. Vì vậy số lượng chó béc giê và các giống chó cảnh châu Âu trong
các gia đình, nhất là ở thành phố lớn ngày càng tăng.
Việc chăn nuôi chó nghiệp vụ tập trung ở các trường huấn luyện nghiệp vụ và
chó cảnh trong các gia đình, trong những năm qua gặp rất nhiều khó khăn, khó khăn
nhất là dịch bệnh làm chó chết. Vì vậy số lượng chó nghiệp vụ và chó cảnh tăng lên rất
chậm.

6
Nước ta có 2 trung tâm chăn nuôi giống chó nghiệp vụ thuần là giống chó của
Nga và Đức. Bên cạnh đó, có một số địa phương chú ý phát triển giống chó nghiệp vụ
lai có chất lượng tốt.
Ngày 19-01-2009, Bộ Nội vụ đã ban hành quyết định số 71 QĐ/BNV về việc
thành lập Hiệp hội nuôi chó giống Việt Nam (Vietnam kennel Association-VKA).
Về việc quản lý số lượng chó thì ở Việt Nam gần đây cũng đã đưa ra một quyết
định, trong đó quy định chủ sở hữu chó phải đến UBND để đăng ký và được cấp số
(Quyết định số 2891/QĐ-BNN-TY ngày 14/11/2012 của Bộ Nông nghiệp và phát triển
nông thôn về phê duyệt kế hoạch khống chế và loại trừ bệnh dại năm 2012) [32]. Tuy
nhiên cũng như một số nước ở châu Á thì người dân vẫn có tâm lý rất thoải mái trong
việc nuôi và sở hữu chó và thường không quan tấm tới các điều lệ về việc nuôi và sở
hữu chó.
1.2. Tổng quan về bệnh ngoài da
1.2.1. Bệnh ngoài da trên chó
Chó là vật nuôi rất gần gũi với con người và được cho là trung thành nhất với
con người. Tuy nhiên nếu việc chăm sóc người bạn này không tốt thì chúng rất dễ mắc
bệnh. Cũng giống con người, chó rất dễ mắc một số bệnh về đường tiêu hóa dẫn đến
các triệu chứng như tiêu chảy, chán ăn, tụt cân. Chó cũng dễ mắc các bệnh về hô hấp
với các triệu chứng tương tự con người như sổ mũi, nghẹt mũi khó thở. Và chó cũng
thường xuyên mắc các căn bệnh nghiêm trọng liên quan đế nội tạng như gan, phổi, tim
hay các bệnh về xương khớp v.v….
Trong các căn bệnh thường gặp ở chó có thể nói căn bệnh đáng lo ngại nhất đối
với con người là các căn bệnh ngoài da ở chó. Vì con người thường xuyên gần gũi và
tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với chó nên việc một con chó bị bệnh ngoài da là một
điều đáng lo ngại vì tính chất lây lan của các căn bệnh đó.

7
Các bệnh ngoài da tuy ít ảnh hưởng đến tính mạng của chó nhưng chúng lại gây
ra những tổn thương nghiêm trọng trên cơ thể chó và có nguy cơ ảnh hưởng đến con
người.
Các triệu chứng thường thấy cục bộ ở các vùng da như: rụng lông, đỏ tấy có
chảy nước dịch hoặc dịch mủ màu vàng, da dầy hóa bì, loét sùi. Con vật khó chịu, ngứa
ngáy hay gãi, kêu rên, thần kinh không ổn định, lở loét ở vùng cổ, chân, kẻ móng, mũi,
mặt, tai. Có mùi hôi tanh khó chịu.
1.2.2. Bệnh ngoài da của người
Là những bệnh thường gặp do nhiều tác nhân gây ra, bệnh thường chỉ gây
thương tổn trên da và rất ít gây nguy hiểm đến tính mạng. Một số bệnh thường gặp là:
ghẻ, nấm cạn, nhiễm trùng da thông thường, mụn trứng cá, chàm, vẩy nến, luput đỏ,
bệnh lao da.
1.3. Các tác nhân gây bệnh
1.3.1. Vi khuẩn
1.3.1.1. Một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ngoài da thường gặp
Các tác nhân gây bệnh ngoài da trên chó thường thuộc các nhóm:
Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus , Escherichia, Pseudomonas, Proteus.
1.3.1.2. Các biểu hiện do nhóm vi khuẩn gây ra
Các nhóm vi khuẩn trên thường gây nên các triệu chứng về viêm bề mặt da của
chó. Trong điều kiện bình thường da chó luôn có cơ chế để vô hiệu hóa các vi khuẩn
cũng như các yêu tố vi sinh vật gây bệnh khác. Nhưng trong trường hợp da bị tổn
thương do va chạm cơ học tạo chỗ hở trên bề mặt da làm thay đổi điều kiện sinh lý trên

8
bề mặt da, lúc đó các vi sinh vật gây bệnh sẽ dễ dàng xâm nhập, gây bệnh trên da chó
và có một số biểu hiện của viêm da do vi khuẩn như sau:
Viêm da mủ bề mặt: là những dấu hiệu trên bề mặt đặc trưng bởi vết loét và xói mòn,
bao gồm viêm da ẩm cấp tính (viêm da chấn thương) và viêm da nếp gấp (hăm da).
[33]
Viêm da mủ cạn: bao gồm những phần trên bề mặt của nang lông và biểu bì kể cả
bệnh chốc lở (viêm da mủ trên chó con) và viêm nang lông do vi khuẩn bề mặt (mụn
mủ với phần lông lồi ra). [33]
Viêm da mủ sâu: bao gồm những phần dưới của nang lông và chân bì kể cả viêm nang
lông sâu, mụn nhọt và viêm mô tế bào, như viêm mủ mũi, mụn trên chó, viêm bì móng.
[33]
1.3.1.3. Khả năng lây lan sang người
Các loại vi khuẩn trên thường có khả năng lây lan từ chó sang người. Và một
điều đáng quan tâm là những tổn thương do chúng gây ra khi lây lan sang người còn
nguy hiểm hơn trên chó như staphylococcus aureus gây các bệnh mụn nhọt ngoài da,
viêm phổi, áp xe phổi, nhiễm khuẩn huyết. Bệnh rất nặng, rất dễ gây tử vong. Các vi
khuẩn như Proteus vulgaris có khả năng gây nên các bệnh trên đường tiểu như viêm
cầu thận, sỏi thận cấp, viêm bàng quang , v.v…
1.3.2. Nấm men
1.3.2.1. Các loài nấm men thường gây bệnh trên da chó
Các loài nấm men Melasezia vàCandida là 2 loài được xác định thường xuyên nhất
trong các trường hợp chó bị bệnh ngoài da. [2]
1.3.2.2. Các biểu hiện bệnh do nhóm nấm men gây ra

9
Bệnh biểu hiện đặc trưng bởi những vẩy trắng, hay màng giả trên niêm mạc
miệng hay lưỡi, đôi khi lan cả đến môi, bệnh tích thường nổi lên với sự sung huyết ở
xung quanh và bên ngoài còn ở dưới thì loét, những bệnh tích này có thể lan tràn đến
hầu hoặc thực quản.
1.3.2.3. Khả năng lây lan sang người
Loài nấm men Candida có thể lây lan sang người thông qua tiếp xúc gián tiếp
hay trực tiếp. Khi lây sang người chúng có khả năng gây ra các tổn hại giống như ở
chó. Ngoài ra chúng còn có khả năng gây tổn thương cho cơ quan sinh dục của người.
Đặc biệt khi gây bệnh trên cơ thể người bị suy giảm miễn dịch (người bị nhiễm
HIV, đang điều trị ung thư, cấy gép tủy) thì chúng trở thành nguyên nhân gây tử vong
hàng đầu bởi những thương tổn lan toàn thân mà chúng gây ra.
1.3.3. Nấm sợi
1.3.3.1. Một số nhóm nấm mốc gây bệnh thường gặp.
Các nhóm nấm mốc gây bệnh ngoài da thường được phân lập trên da và lông chó là:
Aspergillus, Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton.[3]
1.3.3.2. Bệnh và các biểu hiện bệnh do các nhóm nấm mốc gây ra
Chúng thường gây bệnh ở hốc mũi của chó. Chó bị nhiễm khi bị thương hoặc hít
phải dị vật. Khi bị nhiễm nấm này sẽ sinh trưởng và sinh ra độc tố phá hủy lớp niêm
mạc trong mũi, hình thành khối u sưng phòng, kèm theo các triệu chứng như viêm mũi,
viêm xoang. Nếu bệnh kéo dài sẽ dẫn đến tử vong do gây tổn thương lên não [4]. Các
nhóm nấm này gây rụng từng mảng lông, gãy sợi lông, nhất là vùng mặt, tai, ngứa ngáy

10
khó chịu, hay dùng móng gãi tai. Bệnh diễn biến chậm, lâu ngày gây viêm da bội
nhiễm, viêm thận, nhiễm trùng máu và tử vong.
1.4. Tổng quan về nấm men
Nấm men là vi sinh vật nhân thực, là một phần trong giới nấm với hơn 1500 loài
đã được phát hiện. Tuy nhiên, theo ước tính thì con số đó chỉ chiếm 1% trong giới nấm
đang tồn tại trên trái đất[5]. Đa số nấm men là đơn bào và một số loài còn có khả năng
hình thành các chuỗi liên kết đa bào được gọi là khuẩn ty thật và khuẩn ty giả [6]. Nấm
men có kích lớn hơn rất nhiều so sới các cộng đồng vi sinh khác.
Nấm men có thể có lợi hoặc gây bệnh cho con người, chúng có mặt ở khắp mọi
nơi và hiện diện nhiều nhất ở những nơi giàu nguồn đường như trái cây, một số loài
còn được tìm thấy trong đất, trên cơ thể động vật, côn trùng. [7]
1.4.1. Hình thái của tế bào nấm men
Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật. Tế bào nấm men thường
lớn gấp 10 lần so với tế bào vi khuẩn. Kích thước khoảng từ 2.5µm-10µm, do đó có thể
quan sát rõ được dưới kính hiển vi quang học.
Tùy loài nấm men mà tế bào có hình cầu, hình tròn, hình ô van, hình elip, hình
thoi, hình chai, hình quả lê …
Tuy nhiên hình dạng nấm men hầu như không ổn định, phụ thuộc vào tuổi của
nấm men và điều kiện nuôi cấy. Saccharomyces cerevisiace có hình bầu dục khi nuôi ở
môi trường giàu dinh dưỡng, còn nuôi trong điều kiện yếm khí thì nó có hình tròn, và
ngược lại khi nuôi trong môi trường có oxy thì tế bào có hình thon dài.
1.4.2. Dinh dưỡng và sinh trưởng của nấm men
Nấm men là nhóm vi sinh vật hóa dị dưỡng hữu cơ. Chúng sử dụng các hợp chất
hữu cơ như là nguồn năng lượng duy nhất và không cần ánh sáng để phát triển. Những
loại đường mà nấm men dễ sử dụng nhất là các đường đơn như glucose, fructose, hoặc

11
các đường đôi như saccharose, maltose, một vài loài còn có khả năng sử dụng các
đường pentose, rượu và các hợp chất acid hữu cơ. [8]
Hô hấp nấm men là hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi. Không giống như vi
khuẩn nấm men không thể phát triển trong môi trường kỵ khí bắt buộc [8]. Nấm men
sinh trưởng tốt trong môi trường trung tính hoặc hơi chua. Một số chủng nấm men có
thể sinh trưởng ở độ cồn lên đến 10-11%.
Các loài nấm men khác nhau thì có phạm vi nhiệt độ sinh trưởng khác nhau, có
những loài có thể sống ở -2oC cũng có những loài có thể đạt ngưỡng 45oC.
Chủng Leucosporidium frigidum phát triển ở -2 đến 20°C, Saccharomyces telluris ở 5-
35°C, và Candida slooffi tại 28-45°C [9]. Các tế bào có thể tồn tại trong điều kiện đông
lạnh nhất định, với khả năng giảm theo thời gian.
Trong phòng thí nghiệm nấm men được nuôi cấy và phát triển tốt trên các môi
trường giàu nguồn đường như: Potato Dextrose Agar (PDA), Yeast Peptone Dextrose
Agar(YPD), Sabouraud Agar…
1.4.3. Sinh sản của nấm men
Nấm men giống như tất cả các loại nấm, có thể sinh sản vô tính và hữu tính.
Nhưng hình thức phổ biến nhất là sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi [10]. Nhân của
tế bào mẹ chia tách thành một nhân con (nhân hoàn chỉnh) và di chuyển đến tế bào
con. Chồi tiếp tục phát triển cho đến khi nó tách ra từ tế bào mẹ, tạo thành một tế bào
mới [11]. Các tế bào còn được tạo ra qua hình thức sinh sản này thường nhỏ hơn tế bào
mẹ. Cũng có một số loài nấm men sinh sản bằng hình thức phân bào và tạo ra hai tế
bào con gần bằng nhau về kích thước. [10]
Trong điều kiện môi trường nghèo dinh dưỡng các tế bào đơn bội sẽ chết, tuy
nhiên trong cùng điều kiện đó, các tế bào lưỡng bội có thể sống sót nhờ tiếp hợp với
nhau (sinh sản hữu tính) tạo thành hợp tử và các hợp tử phân chia thành các bào tử nằm

12
trong nang sau đó sẽ được phát tán ra ngoài khi nang chín. Nếu 2 tế bào nấm men có
hình thái kích thước giống nhau tiếp hợp với nhau thì được gọi là tiếp hợp đẳng giao.
Nếu 2 tế bào nấm men khác nhau thì gọi là tiếp hợp dị giao.
1.4.4. Nấm men gây bệnh
Một số loài nấm men là tác nhân gây bệnh cơ hội có thể gây nhiễm trùng ở
những người bị tổn thương hệ thống miễn dịch. Cryptococcus neoformans và
Cryptococcus gattii là tác nhân gây bệnh quan trọng của suy giảm miễn dịch người.
Chúng là nguyên nhân gây ra hơn 600.000 ca tử vong cho những người đang điều trị
HIV/AIDS [12]. Các tế bào được bao quanh bởi các nang khuẩn polysaccharide giúp
chúng tránh bị phát hiện và tấn công bởi các tế bào bạch cầu. [13]
Các nấm men thuộc chi Candida là một nhóm các tác nhân gây bệnh cơ hội
thường gây ra các tác động bệnh lý lên miệng hoặc cơ quan sinh dục. Candida được
tìm thấy như một vi sinh vật hội sinh sống trong các vùng nhầy và ẩm ướt trên cơ thể
người và động vật máu nóng. Khi xâm nhập vào niêm mạc các tế bào nấm men nảy
mầm gây kích ứng và biến đổi các mô gây nên các triệu chứng bệnh lý.
1.5. Những nghiên cứu trên thế giới về nấm men gây bệnh
Trong thế kỷ thứ năm trước Công nguyên, Hippocrates đã mô tả bệnh tưa miệng
[14] và chính vì vậy ông được coi là người đầu tiên mô tả một triệu chứng nhiễm trùng
nấm men.
Đến năm 1839 nhờ sự xuất hiện của kính hiển vi và những nghiên cứu của
Langenbeck và sau đó là Berg Gruby đã chứng minh Candida albicans là một tác nhân
nấm men gây bệnh và ảnh hưởng đến tính mạng. Chúng là nấm men điểm hình được
phân lập từ bệnh phẩm của những người bị bệnh. [15]
Đến những năm 1960 với sự ra đời của các phương pháp điều trị ung thư, các
biện pháp điều trị kháng sinh, đã vô tình làm bùng phát và tăng nguy cơ nhiễm trùng

13
nấm men nghiêm trọng. (Candida được chứng minh là ra các triệu chứng nhiểm trùng ở
những người suy giảm miễn dịch). [16]
Bảng 1.1 Phát hiện về nấm men gây bệnh từ năm 1989 đến 1993.
Năm Các chủng phát hiện
1989 Malassezia vàTrichosporon là nấm bệnh cơ hội ngày càng được phát hiện
nhiều hơn. [17]
1989 C. tropicalis, Malassezia spp, Hansenulaspp,T. beigelii. [18]
1989 Phổ của nấm men kết hợp với ung thư có nhiều sự thay đổi bao gồm
T. beigelii, Saccharomyces spp, Torulopsis pintolopesii,
Pichiafarinosa, và Rhodotorula spp. [19]
1992 Các báo cáo về Saccharomyce,Hansenula,
Rhodotorula và Malassezia spp. Và C. glabrata. [20]
1993 Kết quả theo dõi từ năm 1980-1990 số ca nhiễm nấm C. albicans tăng từ
(52%-60%), các loài khác giảm (21%-16%). [21]
1993 So sánh kết quả phân lập 15 tháng (1991-1992) với cùng kỳ (1987-1988)
C. glabrata tăng gấp đôi, C. krusei tăng nhẹ; Tỷ lệ C. guilliermondii, C.
lipolytica, và C. kefyrtăng. [22]
1.6. Định danh nấm men
Có hai phương pháp để định danh nấm men là phương pháp truyền thống và
phương pháp sinh học phân tử. Hiện nay, phương pháp được dùng nhiều nhất là sử
dụng sinh học phân tử vì những ưu điểm như nhanh chóng, chính xác và hiệu quả cao.

14
1.6.1. Định danh nấm men bằng phương pháp truyền thống
1.6.1.1. Quan sát các đặc điểm hình thái
Tuy nấm men có kích thước lớn hơn vi khuẩn rất nhiều nhưng vẫn rất nhỏ so
với khả năng quan sát của con người, việc quan sát nấm men phải được thực hiện bằng
kính hiển vi ở độ phóng đại từ vài trăm đến 1000 lần.
Các đặc điểm cần chú ý khi quan sát hình thái nấm men gồm: quan sát tế bào,
quan sát các dạng bào tử, quan sát khuẩn ty thật, khuẩn ty giả, quan sát nhân tế bào.
1.6.1.2. Khảo sát các đặc tính sinh lí, sinh thái
Để có thể định danh nấm men bằng phương pháp truyền thống người ta phải
tiến hành các thử nghiệm sinh hóa và sinh lý rất phức tạp và tốn thời gian:
- Lên men 13 loại đường.
- Đồng hóa 46 nguồn carbon. Có thể dùng bộ kít chẩn đoán nhanh ID 32C (Bio
Mérieux SA, Marchy-l’Étoile…)
- Tính chống chịu với 0,01% hoặc 0,1% cycloheximide (có thể bao gồm trong bộ kit
ID 32C).
- Đồng hoá 6 nguồn nitơ: nitrate, nitrite, ethylnamine hydrochloride, L-lyzine,
cadaverine dihydrochloride, creatine.
- Sinh trưởng khi thiếu hụt một số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenate, biotin,
thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, p-aminobenzoic
acid.
- Sinh trưởng tại các nhiệt độ khác nhau: 25oC, 30oC, 35oC, 37oC và 42oC.

15
- Tạo thành tinh bột.
- Sản sinh acid từ glucose.
- Thủy phân Urê.
- Phân giải Arbutin.
- Phân giải lipid.
- Năng lực sản sinh sắc tố.
- Sinh trưởng trên môi trường chứa 50% và 60% glucoza.
- Hóa lỏng gelatin.
-Phản ứng với Diazonium Blue B.
- Phát triển trên môi trường chứa acid acetic 1%.
1.6.2. Định danh nấm men bằng sinh học phân tử
Định danh nấm men bằng sinh học phân tử chủ yếu dựa trên sự phát triển của
những kỹ thuật gen hiện đại và có độ chính xác cao. Đó là những kỹ thuật hiện đại có
sự kết hợp của nhiều ngành khoa học như sinh học, hóa học, tin học và cơ khí tự động.
Để định danh một loài nào đó thì người ta phải tiến hành các phản ứng như PCR và kỹ
thuật giải trình tự, sau đó xử lý số liệu với ngân hàng gen.
1.6.2.1 Đoạn gen rDNA
Gen rDNA là nhóm gen mã hóa RNA của ribosome, đóng vai trò quan trọng
trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là

16
một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của
gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa,
ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân
tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác
biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những
oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại
các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được
thiết kế dựa trên các vùng trình tự không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi
sinh vật. [23]
Gen rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen, khuếch
đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt phương
pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên
cứu liên quan đến rDNA . [24]
Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân loại nấm trên cơ sở rDNA được phát triển
những năm đầu của thập niên 90 đã tìm được quan hệ di truyền của nhiều loài nấm
sợi.[25]
❖ Primer
Các primer vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18S, 5.8S và
28S. ITS1 là trình tự bổ sung của NS8. Primer ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng lọc
dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8 S của N. crassa, Szchiosaccharomyces prombe và S.
cerevisiae, Viciafaba và chuột. Vùng bảo tồn trên rDNA 28S của S. prombe, S.
cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4. Primer ITS5 có trình tự
giống với rDNA 18 S của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách primer ITS1 25bp. [24]

17
Bảng 1.2 Internal transcribed spacer region (ITS region, including the 5.8S gene)
ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT GCG
G
1773-1791
(18S)
White et al. 1990
ITS1-F CTT GGT CAT TTA GAG GAA
GTA A
1735-1756
(18S)
Gardes & Bruns
1993
ITS2 GCT GCG TTC TTC ATC GAT
GC
53-34 White et al. 1990
ITS3 GCA TCG ATG AAG AAC GCA
GC
34-53 White et al. 1990
ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT
GC
57-38 (25S) White et al. 1990
ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG
TCC AG
194-172 (25S) Gardes & Bruns
1993
ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC
AAG G
1749-1770
(18S)
White et al. 1990
5.8S CGC TGC GTT CTT CAT CG 54-38 Vilgalys lab
5.8SR TCG ATG AAG AAC GCA GCG 37-54 Vilgalys lab
Hình 1.1 Bảng đồ primer ITS
Chỉ định dùng cho PCR: ITS1 hoặc ITS5, ITS1-F và ITS4 hoặc LR15, ITS4-B
1.6.2.2. Nhân gen và Kỹ thuật giải trình tự trong định danh loài
❖ Nhân gen (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật lai DNA đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ của
nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn DNA đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi tiến
hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy không thể thực hiện

18
được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời gian
dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ DNA cho các kỹ thuật lai hay định typ. Khó khăn này
được khắc phục bằng cách làm tăng nguồn DNA đích một cách nhanh chóng bằng kỹ
thuật nhân gene PCR. [30]
Việc nhân DNA cho phép làm tăng số lượng gấp hàng triệu hoặc nhiều hơn nữa đối
với đoạn DNA hay ARN nghiên cứu. Có nhiều phương pháp khác nhau để phân tích
nguồn DNA khuyếch đại theo cách này. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng điện di
để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng PCR. Có thể xác định độ nhạy và tính
đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặc hiệu đã được đánh dấu.
Phương pháp đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định được trình tự DNA và RNA của
sản phẩm PCR. Việc xác định được sai khác của chuỗi DNA sẽ cho phép xác định và
định typ chính xác nhất các đối tượng vi sinh vật nghiên cứu. Kết quả xác định trình tự
DNA còn cho phép xác định mối liên hệ tiến hoá và dịch tễ học của các chủng vi sinh
vật. [30]
❖ Kỹ thuật giải trình tự
Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ vi
sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi DNA của một vùng quy định trên nhiễm
sắc thể. Phương pháp giải trình tự DNA phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự
tương đồng của trình tự gen nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo
sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối
tượng nghiên cứu. Các gen bảo tồn được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của
sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ
sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau. [30]

19
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu và thiết bị
Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm trường đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh,
Viện Sinh Học Nhiệt Đới
2.1.1. Dụng cụ
Ống nghiệm
Đĩa petri
Becher
Pipet, Pipetman, Đầu tip
Erlen
Lame, Lamelle
Que cấy
Cân phân tích
Máy chụp hình
Ống đong
Tăm bông dài
Eppendorf
2.1.2. Thiết bị
Kính hiển vi Nikon eclipse 80i
Tủ lạnh, Tủ lạnh -20oc
Máy vortex
Máy li tâm lạnh MIKRO 220R
Nồi hấp khử trùng
Bộ nguồn điện di EC105
Bể điện di IBI QS- 710
Hộp đèn soi UV Uvintec, BioRad UV
CCD Camera
Lò viba
Máy PCR sprint thermo Cycler
2.1.3. Vật liệu
2.1.3.1. Nguồn phân lập

20
Các chủng nấm men được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm thu nhận từ các
phòng khám thú y trên địa bàn thành phố: Quận 9, Quận 2, Quận Bình Thạnh, Quận
Thủ Đức…
2.1.3.2. Hóa chất
Môi trường nuôi cấy : PDA (Potato Dextrose Agar)
Dịch chiết khoai tây 20%
Dextrose 2%
Agar 2%
pH 5.6
H2O 1000ml
Dầu soi kính
❖ Các hóa chất định danh:
Lysis (100mM tris-pH 8.0, 30mM EDTA-pH 8.0, 0.5%SDS)
Potassium acetate pH 7.5
CHCl3_Isoamyl alchol (24:1)
Isopropanol
Etanol 70%, Etanol 99%
6X LB Double dye
TAE 1X
Agarose

21
Ethidium bromide
❖ Các hóa chất PCR
Nước khử ion
Master Mix : 2x My taq Mix
Mồi xuôi ITS1 :TCCGTAGGTGAACCTGCGG
Mồi ngược ITS4 :TCCTCCGCTTATTGATATGC
Thang DNA 1kb
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập nấm men gây bệnh
Vì yêu cầu phải phân lập nấm men gây bệnh ngoài da trên chó nên các mẫu nấm
men sẽ được thu thập và phân lập từ các mẫu bệnh phẩm trên da chó. Có nhiều phương
pháp phân lập nấm men trong đó người ta có thể dùng các chất chống mốc cũng như
kháng khuẩn để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm mốc và chỉ thu nhận nấm
men. Tuy nhiên, khi sử dụng các chất này cần lưu ý đến liều lượng vì nó có khả năng
ức chế cả nấm men phát triển. Khi thực hiện đề tài này vì đảm bảo tính liên tục và các
hướng khác của đề tài nên những mẫu vi khuẩn và nấm sợi cũng sẽ được lưu trữ để
phục vụ công tác nghiên cứu sau này nên không sử dụng các chất ức chế trên.
Môi trường được sử dụng để phân lập là PDA.
Các bước phân lập nấm men
❖ Chuẩn bị dụng cụ môi trường
✓ Chuẩn bị môi trường
✓ Chuẩn bị tăm bông trong ống nghiệm chứa nước muối sinh lý

22
✓ Chuẩn bị đĩa petri và ống nghiệm thạch nghiên
✓ Chuẩn bị kéo, kẹp vô trùng
 Các dụng cụ trên được hấp khử trùng trong nồi áp suất ở 121oC, 1 atm trong 20
phút.
❖ Phân lập
Mẫu sau khi thu về sẽ được cấy trải đều bằng tăm bông lên bề mặt đĩa thạch đã
chuẩn bị trước, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng 2 ngày.
❖ Làm thuần
✓ Sau 2 ngày ủ dùng que cấy, thao tác vô trùng chấm nhẹ vào khuẩn lạc
riêng lẻ có đặc trưng khác với các khuẩn lạc còn lại ria trên đĩa petri
khác, và đem ủ để tạo khuẩn lạc đơn dòng.
✓ Lặp lại việc tách dòng nhiều lần để có được giống thuần.
✓ Kiểm tra tính thuần và giữ giống trong môi trường PDA thạch nghiên
trong ngăn mát tủ lạnh.
2.2.2. Quan sát hình thái nấm men
Vì trong khóa luận này sử dụng phương pháp sinh học phân tử để định danh
nấm men, nên việc quan sát hình thái nấm men đóng vai trò phân loại nấm men với vi
khuẩn và nấm sợi.
2.2.2.1. Quan sát tế bào nấm men
Tế bào nấm men có rất nhiều hình dạng giống như vi khuẩn song kích thước lại
lớn hơn rất nhiều so với vi khuẩn, nên ta dễ dàng phân loại được nấm men và vi khuẩn
qua kính hiển vi.
Cách tiến hành

23
✓ Nuôi tế bào nấm men trong môi trường khoai tây lỏng ở nhiệt độ phòng từ 1-2
ngày.
✓ Làm tiêu bản sống và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X.
✓ Ta cũng có thể làm tiêu bản nhuộm đơn bằng Fuchsin để quan sát tế bào nấm
men rõ hơn.
✓ Thu nhận những mẫu tế bào có kích thước lớn, to tròn, hoặc thon dài.
2.2.2.2. Quan sát khuẩn ty thật khuẩn ty giả
Ở một số loài nấm men, chồi trưởng thành không tách ra khỏi tế bào mẹ mà tạo
thành một chuỗi tế bào được gọi là khuẩn ty giả. Cấu tạo của khuẩn ty giả rất đơn giản,
bao gồm các tế bào có kích thước và hình dạng tương tự nhau hay chúng chỉ khác nhau
do sự kéo dài của tế bào. Tế bào cuối cùng luôn ngắn hơn tế bào kế nó.
Khuẩn ty thật thì có thể thấy rõ các vách ngăn giữa các tế bào, còn khuẩn ty giả
thì không.
Sự hình thành khuẩn ty giả ở nấm men là do tác động của điều kiện môi trường
nghèo dinh dưỡng. Vì vậy ta sử dụng phương pháp phòng ẩm để nuôi tế bào nấm men.
Cách tiến hành:
✓ Trước hết ta chuẩn bị lame, lamelle, đĩa petri có giấy lọc ở dưới và hai thanh
đũa xếp hình chử “v” bên trên. Đem hấp khử trùng cùng với một ống môi
trường PDA và một bình nước cất.
✓ Dùng pipetman hút môi trường và nhỏ vào lame sao cho môi trường trang mỏng
khoảng 2/3 lame để môi trường đông tự nhiên.
✓ Dùng que cấy vòng ria tế bào nấm men theo dấu “#” rồi đậy lamelle lại.
✓ Nhỏ nước cất vô trùng cho thấm điều giấy thấm.
✓ Đậy nắm đĩa lại và gói đĩa cẩn thận và ủ ở nhiệt độ phòng trong một tuần.

24
✓ Quan sát dưới kính hiển vi vật kính 100X.
2.2.3. Sử dụng sinh học phân tử định danh nấm men
2.2.3.1. Tách chiết DNA
Trước khi PCR ta phải tiến hành giải phóng và tinh sạch DNA nấm men khỏi tế bào để
có mẫu DNA trần và hàm lượng cao.
Các bước tiến hành
✓ Lấy một ít sinh khối nấm men từ khuẩn lạc nấm men nuôi cấy trên đĩa petri hòa
vào 200µl dung dịch lysis buffer chứa trong eppendorf 1.5ml, sau đó vortex nhẹ.
✓ Đun trên nước sôi 15 phút.
✓ Thêm vào 200µl dung dịch potassium acetate 2.5 M, pH7.5, sau đó cho vào
ngăn đá tủ lạnh trong 1 giờ.
✓ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút tại 4oC, sau đó thu dịch nổi.
✓ Thêm một thể tích CHCl3-isoamylalcohol (24:1) tương đương với thể tích phần
dịch nổi thu được sau đó đem ly tâm như trên và thu dịch nổi bên trên màng
phân cắt.
✓ Có thể lặp lại bước trên để tăng độ tinh sạch.
✓ Thêm vào một thể tích isopropanol lạnh tương đương thể tích dịch nổi thu được
ở bước trên và để vào tủ lạnh -20oC trong 20 phút, sau đó ly tâm 13000
vòng/phút trong 15 phút 4oC, và thu hồi tủa.
✓ Rửa tủa DNA với 100µl etanol 70%và 200µl etanol 99% lắc nhẹ rồi đem ly tâm
13000 vòng /phút trong 5 phút, 4oC.
✓ Bỏ phần dịch và để khô tủa tự nhiên.
✓ Hòa tan tủa trong 35-50µl nước cất tinh khiết hoặc TE buffer bảo quản -20oC.
2.2.3.2. Điện di

25
Điện di là một bước quan trọng nhằm kiểm tra kết quả ly trích DNA dựa trên sự
di chuyển của các phân tử DNA trong điện trường trong nền agarose.
Cách tiến hành
✓ Chuẩn bị bảng gel agarose 1% (pha 1mg agarose và định mức 100ml TAE X1
buffer, đun tan).
✓ Chuẩn bị bể điện di chứa đây đệm TAE X1 sao cho bảng gel chìm hẳn trong
đệm.
✓ Hút 5µl dịch DNA trộn vào 3µl Double dye.
✓ Nạp mẫu vào các giếng và mở nguồn chạy với hiệu điện thế 110V trong 45
phút.
✓ Cho bảng gel vào dung dịch Ethidium Bromide nhuộm trong 20 phút.
Quan sát bằng buồn uv.
2.2.3.3. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR do Karl Mullis và công sự phát minh vào năm 1985, là một
cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học
phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép
của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông
dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát
hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo
dòng gen. [31]
Tất cả các DNA polymerase cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch
DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là
trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho nấm men. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả
năng bắt cặp bổ sung cho một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA
polymerase, đoạn mồi này được nhận biết và kéo dài để hình thành mạch mới. Phương

26
pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện
diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong
phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA
nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn các bản sao đến mức có thể
thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và điện di trên gel agarose.
❖ Các thành phần của phản ứng PCR.
✓ DNA mẫu: chứa vùng DNA cần được khuếch đại.
✓ Mồi: là những đoạn oligonucleotide, bổ sung cho vùng DNA tại đầu 5’
và 3’ của vùng DNA cần được khuếch đại.
✓ DNA polymerase: (Taq DNA polymerase hay một polymerase khác mà
có khả năng hoạt động tốt ở nhiệt độ khoảng 70OC) dùng để tổng hợp
đoạn DNA của vùng cần khuếch đại.
✓ Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs): là vật liệu để polymerase tổng
hợp DNA.
✓ Dung dịch Buffer: cung cấp môi trường thích hợp cho hoạt tính cao và
bến vững của polymerase.
✓ Cation hóa trị 2 (Mg2+ hay Mn2+): thông thường Mg2+ được sử dụng,
nhưng Mn2+ có thể được dùng cho phản ứng PCR tức thời. Tuy nhiên,
nồng độ Mn2+ cao gia tăng tỉ lệ bắt cặp sai trong quá trình tổng hợp DNA.
✓ Cation hóa trị 1: K+.[34]
Một trong những DNA polymerase bền nhiệt đầu tiên được thu nhận từ Thermus
acquaticus và thường được gọi là Taq polymerase [35]. Taq polymerase hiện nay được
sử dụng rộng rãi trong các phản ứng PCR. Một trong những nhược điểm của Taq
polymerase là thỉnh thoảng chúng tổng hợp sai khi tổng hợp đoạn DNA dẫn đến những
đột biến trong đoạn DNA, bởi vì chúng thiếu hoạt tính sửa sai exonuclease 3’-5’. Một
số polymerase khác như: Pwo và Pfu được thu nhận từ Archaea có cơ chế đọc và sửa

27
sai (cơ chế kiểm tra lại sự sai) mà có thể giảm phần lớn những đột biến xảy ra trong
quá trình tổng hợp DNA. Tuy nhiên những enzyme này có hoạt tính tổng hợp DNA
thấp hơn Taq. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu polymerase cung cấp cả hoạt tính
tổng hợp DNA cao và sự chính xác trong sự tổng hợp DNA.
❖ Chu trình phản ứng
Thông thường, PCR kéo dài 20- 35 chu kì, hầu hết các phản ứng PCR bao gồm 3
bước:
✓ Bước 1 (biến tính DNA): Đầu tiên, phản ứng PCR thường được gia nhiệt đến
nhiệt độ 94-96oC, nhiệt độ này được giữ 1-9 phút nhằm đảm bảo tất cả DNA
mục tiêu và mồi bị biến tính [36] , DNA được làm tách mạch bởi sự phá vỡ liên
kết hydrogen giữa các base bổ sung của chuỗi DNA, tạo thành các chuỗi DNA
mạch đơn. Sau đó, chu trình bắt đầu với một bước có nhiệt độ 94-980C khoảng
20-30 giây.
✓ Bước 2 (bước lai): Nhiệt độ phản ứng được làm thấp để mồi có thể bắt cặp với
mạch khuôn DNA đơn. Liên kết hydrogen giữa mạch khuôn và mồi bắt đầu
được hình thành. Liên kết này chỉ được bền vững khi mồi bắt cặp chính xác với
mạch khuôn và đoạn ngắn DNA mạch đôi này là nơi DNA polymerase gắn vào
và bắt đầu tổng hợp DNA. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng
chảy của mồi và thông thường khoảng 50-64oC trong thời gian 20-40 giây.
✓ Bước 3 (bước kéo dài): DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới bổ sung đối
với DNA mạch khuôn. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ hoạt động
tối ưu của DNA polymerase. Taq DNA polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu
70-74oC, trong hầu hết trường hợp nhiệt độ thường được dùng là 72oC. Nối
hydrogen giữa đoạn mồi và DNA khuôn phải đủ bền để chịu đựng được nhiệt độ
cao. Mồi đã lai với vùng DNA có nhiều base sai sẽ bị tách ra từ khuôn mẫu và
không được kéo dài. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase được sử

28
dụng và chiều dài đoạn DNA mục tiêu cần được khuếch đại. Bước kéo dài cuối
cùng kéo dài khoảng 5-15 phút (phụ thuộc vào chiều dài mỗi đoạn DNA mẫu),
chu kì cuối cùng này được dùng để chắc chắn phần còn lại của chuỗi DNA có
thể được kéo dài hoàn toàn.
Để kiểm tra có hay không phản ứng PCR tạo ra đoạn DNA cần khuếch đại, điện di
trên gel agarose có thể được sử dụng cho sự phân tách các sản phẩm PCR. Kích thước
của sản phẩm PCR được xác định bởi thang DNA, chứa đựng những đoạn DNA có
kích thước đã được biết chạy dọc trên gel cùng với sản phẩm PCR. Các DNA được
nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy dưới tia UV (bước sóng 312nm).
Phương pháp PCR có độ nhạy rất cao, thao tác lại đơn giản nhưng mức độ ngoại
nhiễm cao, sự kém trung thực trong quá trình tổng hợp của Taq polymerase… Vì vậy,
cần cẩn trọng khi tiến hành thí nghiệm cũng như phân tích kết quả.
❖ Trong khóa luận này PCR dùng để khuếch đại đoạn gen ITS rDNA của nấm
men.
Thành phần phản ứng
Mater mix 6.5µl
ITS1-F 0.1µl
ITS4-R 0.1µl
DNA 1µl
H2O 17.3µl
Tổng 25 µl
❖ Chu trình phản ứng PCR
Bước 1: Biến tính DNA, 94oC trong 5 phút
Bước 2: 35 chu kỳ
94oC trong 1 phút
55oC trong 1 phút

29
72oC trong 2 phút
Bước 3: Kết thúc, 72oC trong 10 phút
Bước 4: Bảo quản 4oC
❖ Kiểm tra kết quả PCR
Ta sử dụng phương pháp điện di để kiểm tra mẫu PCR, các bước thực hiện giống
bước 2.2.3.2 trên nhưng bổ sung thêm một giếng nạp mẫu thang đối chứng có kích
thước từ 500bp- 10000bp.
2.2.3.4. Giải trình tự và định danh mẫu nấm men
Giải trình tự gen là sự xác định rõ trình tự của các base trong DNA. Tuy nhiên
không phải tất cả những chuỗi DNA đều là gen (vùng mã hóa), điều này phụ thuộc vào
sinh vật lấy mẫu và nguồn DNA mẫu như: trình tự khởi đầu, các trình tự lặp lại, các
intron. Hai phương pháp cơ bản để giải trình tự DNA. [30]
✓ Phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert (phương pháp thủy phân hóa học
dùng đoạn DNA mạch đôi): sử dụng các loại hóa chất để cắt DNA tại các vị trí
xác định tạo ra một bộ các đoạn chỉ khác nhau bởi một nucleotide.
✓ Phương pháp giải trình tự Sanger-Coulson (phương pháp này dùng đoạn DNA
mạch đơn): dùng enzyme để tổng hợp các đoạn DNA có một đầu mang một
nucleotide biến đổi.
Việc phân tích các đoạn này được tiến hành giống nhau trong cả hai phương pháp,
gồm điện di trên gel và đọc kết quả trên bản phóng xạ tự ghi. Ngày nay, phương pháp
giải trình tự Sanger-Coulson là phương pháp được sử dụng rộng rãi hơn. Một vài sự
thay đổi đã được phát triển và nó đã được tự động hóa cho sự giải trình tự nhiều đoạn
gen có kích thước lớn.
❖ Phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert (phương pháp hóa học)

30
Phương pháp tự phân hóa học dùng mẫu DNA mạch đôi vì thế không yêu cầu tạo
dòng DNA trong Phage M13 để tạo ra mạch DNA đơn như là trong phương pháp giải
trình tự Sanger-Coulson. Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử
DNA cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học.
Trước hết các phân tử DNA được đánh dấu bằng 32P ở một đầu. Sau đó chúng được
chia thành năm phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lí hóa học chuyên biệt có khả
năng làm biến đổi đặc trưng một loại nucleotide và sau đó cắt phân tử DNA ngay tại
nucleotide. Năm nhóm nucleotide bị tác động là G, A, C, G+A, T+C. Kết quả của các
xử lí hóa học là hình thành năm tập hợp oligonucleotide, các oligonucleotide trong một
tập hợp có kích thước khác nhau nhưng đều chấm dứt cùng một loạinucleotide. Cuối
cùng năm phân đoạn trên được đem phân tích trên gel polyacrylamide. Vị trí các
oligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và được phát hiện bằng
đầu có đánh dấu phóng xạ. Kết quả được đọc trên bản phóng xạ ghi.
❖ Phương pháp giải trình tự Sanger-Coulson (phương pháp enzyme) [30]
Phương pháp này được dựa trên sự làm gián đoạn tổng hợp enzyme polymerase do
các nucleotide tương đồng của đoạn DNA bổ sung với mạch khuôn. Một hỗn hợp các
đoạn DNA có chiều dài khác nhau được tạo ra phụ thuộc vào nơi mà chúng bị cắt. Đặc
trưng của phương pháp này là ngoài bốn loại nucleotide trong đó nhóm 3’OH được
thay bằng H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành
các nối phosphodiester và do đó làm ngưng quá trình tổng hợp.
Trình tự DNA cần xác định phải được tạo dòng trong một vector mạch đơn (phage
M13). DNA polymerase sử dụng có thể là đoạn Klenow của DNA polymerase I, Taq
polymerase. Sự tổng hợp mạch mới bắt đầu từ một mồi bắt cặp với một trình tự chuyên
biệt trên phage M13, với sự hiện diện của bốn loại nucleotide trong đó một loại được
đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ (32P). Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn

31
phân đoạn riêng. Người ta cho vào lần lượt bốn phân đoạn một trong bốn loại
dideoxynucleotide với hàm lượng rất nhỏ. Do hàm lượng thấp nên thỉnh thoảng mới có
một dideoxynucleotide được sử dụng vào phản ứng tổng hợp oligonucleotide đó ngừng
lại. Tính xác xuất thì trong mỗi phân đoạn sẽ có mặt tất cả các đoạn oligonucleotide có
chiều dài khác nhau tương ứng với tất cả các nucleotide cùng loại hiện diện trên trình
tự DNA. Sau đó, bốn phản ứng tổng hợp sẽ được phân tích trên gel Polyacrylamide và
kết quả được đọc trên bản phóng xạ điện di.
❖ Giải trình tự những đoạn DNA lớn [30]
Cả hai phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert và Sanger-Coulson chỉ có thể giải
trình tự cho đoạn trình tự khoảng 400 base một lần. Tuy nhiên, hầu hết những đoạn gen
đều có kích thước lớn hơn. Để giải trình tự những đoạn DNA lớn này, nó được cắt
(dùng hai hay nhiều enzyme cắt giới hạn) thành những đoạn khác nhau và mỗi đoạn
được giải trình tự một cách riêng rẽ bao gồm những trình tự gối đầu lên nhau (mà
thường được xác định bởi máy tính). Trình tự đầy đủ của đoạn gen sau đó sẽ được xác
định.
❖ Các phương pháp cải biên từ phương phápSanger-Coulson [30]
Trong thực nghiệm, việc sử dụng các phương pháp chính thống nêu trên đòi hỏi
thao tác phức tạp vì phải tạo dòng lại đoạn DNA cần xác định trình tự vào vector mạch
đơn (phage M13). Do đó để đơn giản hóa, ngay từ đầu người ta tạo dòng các vector là
các plasmid thế hệ thứ ba. Ở hai bên đoạn DNA được tạo dòng các plasmid riêng biệt,
mỗi trình tự nằm trên một mạch. Khi cần xác định trình tự của mạch nào, trước hết
người ta tách rời hai mạch (biến tính bằng NaOH) rồi sử dụng mồi bắt cặp với trình tự
chuyên biệt nằm trên mạch đó. Phản ứng tổng hợp xảy ra theo nguyên tắc đã nêu ở
phần trên.

32
Vì điều kiện trang thiết bị không cho phép nên các sản phẩm PCR sẽ được gửi đi giải
trình tự DNA tại công ty Nam Khoa.
Địa chỉ: 793/58 Trần Xuân Soạn - Phường Tân Hưng Quận 7 - Thành phố HCM - Việt
Nam.
Sau khi giải trình tự thì kết quả sẽ được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm
chuyên dụng để định danh loài và xây dựng cây phân loài.
BioEdit 7.2.5.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 và Ngân hàng gen
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kết quả hình thái học nấm men
3.1.1 Kết quả khuẩn lạc
Bảng 3.1 Hình ảnh kết quả hình thái khuẩn lạc
Mẫu Giống chó Vị trí nhiễm Khuẩn lạc
M9-1
M9-5
M11-1
M23-2

34
✓ Mẫu nấm men M9-1 và M9-5 được phân lập từ mẫu bệnh phẩm thứ 9 thu được
tại phòng khám thú y ở quận Thủ Đức. Giống chó bị nhiễm là giống Rock được
nuôi trong nhà. Vị trí bị nhiễm là vùng đầu với triệu chứng lâm sàng là rụng
lông, da sần. Kết quả quan sát khuẩn lạc cho thấy mẫu nấm men M9-1 có màu
đỏ đặc trưng, khuẩn lạc tròn, bề mặt trơn bóng. Còn mẫu nấm men M9-5 cùng
được phân lập từ mẫu bệnh phẩm trên nhưng có khuẩn lạc màu trắng, hình tròn,
bề mặt nhăn nheo, có rìa sợi tơ xung quanh.
✓ Mẫu nấm men M11-1 được phân lập từ mẫu bệnh phẩm thứ 11 thu nhận được
tại phòng khám ở quận Thủ Đức. Giống chó bị nhiễm là giống chó xù Bắc Hà
được nuôi thả tự do. Vị trí bị nhiễm là hai chân với các triệu chứng lâm sàng
nghiêm trọng là rụng lông, loét, ửng đỏ. Kết quả quan sát khuẩn lạc của mẫu
nấm men M11-1 có màu trắng kem, hình tròn, bề mặt trơn bóng.
✓ Mẫu nấm men M23-2 được phân lập từ mẫu bệnh phẩm thứ 23 thu nhận được
tại phòng khám ở quận Bình Thạnh. Giống chó bị nhiễm là giống Pug được nuôi
trong nhà. Vị trí bị nhiễm là chân với các triệu chứng lâm sàng là rụng lông,
chai sần. Kết quả quan sát khuẩn lạc của mẫu nấm men M23-2 có màu trắng,
tròn, bề mặt trơn.
3.1.2. Kết quả hình ảnh tế bào sinh dưỡng
Bảng 3.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng
M9-1 M9-5 M11-1 M23-2

35
Kết quả quan sát tế bào sinh dưỡng của nấm men bằng phương pháp nhuộm
sống cho kết quả như sau.
Mẫu nấm men M9-1 có tế bào hình tròn, mẫu M9-5 cũng có tế bào hình tròn,
mẫu M11-1 có tế bào hình elip mẫu M23-2 có tế bào hình elip thon dài.
3.1.3. Kết quả quan sát tế bào sinh sản
Bảng 3.3 Hình ảnh tế bào sinh sản của nấm men.
M9-1 M9-5 M11-1 M23-2
Dựa trên hình ảnh quan sát thì các mẫu nấm men M9-1, M9-5, M11-1, M23-2
đều có khả năng sinh sản bằng hình thức nảy chồi.
3.1.4. Kết quả quan sát khuẩn ty
Bảng 3.4 Hình ảnh quan sát khuẩn ty
M9-1 M9-5 M11-1 M23-2

36
Kết quả quan sát sự hình thành khuẩn ty cho thấy cả 4 mẫu nấm men phân lập
được từ các mẫu bệnh phẩm gồm M9-1, M9-5, M11-1, và M23-2 điều có thể quan sát
rõ sự hình thành khuẩn ty.
3.2. Kết quả li trích, thu nhận và nhân bản đoạn gen ITS rDNA của nấm men
3.2.1. Kết quả ly trích và thu nhận bộ gen của nấm men
Kết quả ly trích bộ gen của nấm men cho thấy cả 4 mẫu nấm men điều cho kết
quả tốt để dùng cho phản ứng PCR.
3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men
Trước khi giải trình tự đoạn gen ITS rDNA của các mẫu nấm men phân lập
được thì sản phẩm ly trích bộ gen của các mẫu nấm men trên được sẽ được chạy phản
ứng PCR với cặp mồi ITS1-F và ITS4-R nhằm nhân bản đoạn gen ITS rDNA. Đoạn
gen ITS rDNA có kích thước từ 500-600 bp. Sau khi PCR thì sản phẩm thu được được
thể hiện trên 2 bảng gel ở hình 3.2 và 3.3
M23-2 M11-1 M9-5 M9-1
Hình 3.1 Kết quả kiểm tra ly trích bộ gen của 4 mẫu nấm men

37
M9-5 M23-2 M9-1 M11-1 Thang Mẫu M23-2 ở các thể tích khác nhau
Hình 3.2 Kết quả sản phẩm PCR Hình 3.3 Kết quả sản phẩm PCR M23-2
Hình 3.2 cho thấy các giếng M9-5, M9-1, M11-1 đều có các vạch nằm tương
đương ở vị trí khoảng 500-600 bp. Riêng mẫu M23-2 không có vạch xuất hiện và được
chạy PCR lại với các thể tích tham gia phản ứng khác nhau và cũng cho kết quả tốt để
giải trình tự. Sản phẩm PCR sẽ được gửi đi công ty Nam Khoa để giải trình tự.
3.3. Kết quả so sánh vùng gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men trên ngân hàng
gen NCBI và thiết lập cây phân loài
3.3.1. Kết quả Giải trình tự vùng gen ITS rDNA của 4 mẫu nấm men
Mẫu M9-1:
TCTTGGTCAATTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAAAACGGATTTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGA
ATATAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGTCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACT
CTCGCAAGAGAGCGAACTCCTATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAAAATAA
AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTG
CAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGA
GTGTCATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTCTTAATGATTGAAGAGGTGTTTGGTTTCTGAGCGCTGCTGGCCTTT
ACGGTCTAGCTCGTTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCG
CTGAGGAATTCTAGTCTTCGGACTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCAGAATGTCTACATTTTA
AGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA

38
Mẫu M9-5:
CTTGGTCAATTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACATTCGTTTTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAT
TGCCTTTATAGGCTTATAACTATATCCACTTACACCTGTGAACTGTTCTACTACTTGACGCAAGTCGAGTATTTT
TACAAACAATGTGTAATGAACGTCGTTTTATTATAACAAAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCG
CATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA
ACGCAGCTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTCAGTGTCATGAAATCTCAACCACTAGGGTTTC
CTAATGGATTGGATTTGGGCGTCTGCGATTTCTGATCGCTCGCCTTAAAAGAGTTAGCAAGTTTGACATTAATGT
CTGGTGTAATAAGTTTCACTGGGTCCATTGTGTTGAAGCGTGCTTCTAATCGTCCGCAAGGACAATTACTTTGAC
TCTGGCCTAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGTCGGAGGAAA
Mẫu M11-1:
AAATTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACAGTATTCTTTT
GCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGC
CTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAACTTTTGAATTA
ATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAAT
ATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGC
CTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTG
CTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTT
GAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCA
GGTAGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCCGGAGGAA
Mẫu M23-2:
TCTTCATCCACCTCGTGCTCATGGTCATCTAGAGAAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACAAGG
GGAAGGATCATTACAGAAGTTTTTAGCCAGCCATTAACTGCGCGGCGAAAAACCCCGACTTCACTGAGTCGTAA
TGACCATTCCTCTTGCTTTGGTACGGCCTAGAGATAGGTTGGCCCACAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATT
TTTACAGAAATAAAATGAACAACTTTCTTCAAGATATCAACAACTGGATCCAAGGGTTCTGCTCCGAGAAGAAA
GCAGGGAAAACGCAAATAAAATTTGCCCCGCAGATTTTACGAATCATGGAAGATTCATCGTAGCCGGCGCCCT
CTGGTATTCCGGCGGGCATTCCCCTTTGAGCGTCATTTCCCCATCAAACCCCCGGGTTTGGTAATGAGGGATAGT
CTTAGTCGGACTAGTCGTTTGCCGAAAAGTATCGGCGACGTTAGTTTTGGATAGGAAGGTCGATCTGTAAATGT
ATTAGGTTTATCCAATTCGGGTATGGCATGACGTGGAAGTGATGGTAACGATGAGTTCGTCGATTCATCATCAT
TCACATTAAGACCTCAACTTGAGCATCAGATTCCTTTTTCACTTAATCTTAACATTACACTGAGGAAATGAATGA
ATAGTGCTCTTTTTGCTTCCATGAACTTGCACTTGAGCTGAAGTT

39
3.3.2. Kết quả so sánh trình tự ITS rDNA trên ngân hàng gen NCBI và xây dựng
cây phân loài
Hình 3.4 Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự vùng gen ITS rDNA của các
chủng nấm men phân lập (M9-1, M9-5, M11-1, M23-2) và các loài nấm men trong
ngân hàng gen
Dựa trên kết quả so sánh trình tự DNA với ngân hàng gen (các kết quả so sánh
được thể hiện trong phụ lục) và các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc và tế bào ta được
các kết quả sau:

40
Mẫu M9-1 có mối quan hệ gần nhất với loài Rhodotorula mucilaginosa
JX174412.1 với mức độ gen tương đồng là 100%.
✓ Các nghiên cứu về nấm men Rhodotorula mucilaginosa
Nấm men Rhodotorula mucilaginosa (tên cũ Rhodotorula rubra).
❖ Một số đặc điểm khuẩn lạc, tế bào
Là một nấm men mà khuẩn lạc có màu đỏ, hồng hoặc cam. Màu sắc đặc biệt này là
do các sắc tố của nấm men tạo ra nhằm ngăn cản một vài bước sóng nhất định có khả
năng gây tổn hại cho tế bào. Hình thái dưới kính hiển vi là hình cầu nảy chồi. Kích
thước tế bào 2,5 µ-6,5 µ x 6,5 µ-14,0 µ. [26]
❖ Khả năng gây bệnh
Nhiễm trùng huyết, viêm nội nhãn, nhiễm trùng ống thông, viêm phúc mạc, viêm
màng não chủ yếu ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch. Sản xuất một số chất gây dị
ứng và có khả năng liên quan đến bệnh dị ứng. [26]
Dựa trên kết quả so sánh trình tự gen và so sánh đặc điểm hình thái thì mẫu M9-1
chính là loài Rhodotorula mucilaginosa. Và dựa trên các nghiên cứu lâm sàng về khả
năng gây bệnh của chủng trên thì Rhodotorula mucilaginosa là loài nấm men nguy
hiểm có thể gây nên các bệnh nghiêm trọng khi bị nhiễm sang người.
Mẫu M9-5 có mối quan hệ gần nhất với loài Trichosporon asahii AB369919.1
với mức độ gen tương đồng là 99%, hay Malassezia globosa JQ088275.1 với mức độ
gen tương đồng là 99%.
✓ Các nghiên cứu về nấm men Trichosporon asahii
Nấm men Trichosporon asahii (tên củ là Trichosporon beigelii).
❖ Một số đặc điểm về khuẩn lạc, tế bào

41
Nấm men Trichosporon asahii có khuẩn lạc màu trắng hơi vàng, bề mặt nhăn, có
rìa sợi nấm bao quanh. Tế bào hình bầu dục nảy chồi kích thước 3,5µm-7µm x
3,5µm14µm. [28]
Nấm men Trichosporon beigelii là một phần nhỏ của hệ vi sinh vật da bình thường,
và được phân phối rộng rãi trong tự nhiên. T.beigelii thường xuyên tham gia trong một
loạt các nhiễm trùng cơ hội ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch.
Nhiễm trùng phổ biến thường xuyên nhất liên quan đến bệnh bạch cầu, cấy ghép
nội tạng, đa u tủy, thiếu máu bất sản, ung thư và AIDS. Sự nhiễm trùng thường được
lan ra và phổ biến rộng rãi, với các tổn thương xảy ra trong gan, lá lách, phổi và đường
tiêu hóa. [29]
Mẫu M11-1 có mối quan hệ gần nhất với loài Meyerozyma guilliermondii
KC119207.1 với mức độ gen tương đồng là 99%. Và mẫu M23-2 có mối quan hệ gần
nhất với Pichia guilliermondii DQ249193.1 với mức tương đồng 79%.
✓ Các nghiên cứu về Meyerozyma guilliermondii
Nấm men Meyerozyma guilliermondii còn có tên gọi khác Candida guilliermondii
hay Pichia guilliermondii.
❖ Một số đặc điểm về khuẩn lạc, tế bào
Khuẩn lạc Pichia guilliermondii có màu trắng đến vàng kem, mịn, hình tròn, bề mặt
trơn nhẵn. Tế bào hình cầu, nảy chồi và có khả năng hình thành khuẩn ty. Kích thước
tế bào 2,0µm -4,0 µm x 3,0 µm -6,5 µm.
Candida guilliermondii đã được phân lập từ nhiều ca nhiễm bệnh, chủ yếu là
da. Nhưng rất hiếm khi được phát hiện trên các ca viêm da toàn thân. Tuy nhiên, các

42
nghiên cứu phát hiện rằng Candida guilliermondii có khả năng kháng lại các thuốc
kháng nấm. [30]
Dựa trên các kết quả phân lập, quan sát hình thái, định danh và những thông tin về
các loài nấm men có mối quan hệ gần nhất với các mẫu nấm men M9-1, M9-5, M11-1,
M23-2 có thể đưa ra nhận định là cả 4 mẫu nấm men phân lập được từ các mẫu bệnh
phẩm bệnh ngoài da trên chó đều có mối quan hệ tương đồng và gần gũi với những loài
nấm men có khả năng gây bệnh trên da động vật và con người.

43
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
Sau khi tiến hành phân lập và định danh vùng gen ITS của 4 mẫu nấm men
nhiễm bệnh da trên chó nuôi ở thành phố Hồ Chí Minh đã cho một số kết luận sau.
Mẫu M9-1 được phân lập từ giống chó Rock nuôi tại quận Thủ Đức có khả năng là loài
Rhodotorula mucilaginosa với mức tương đồng của vùng gen ITS rDNA là 100%.
Mẫu M9-5 được phân lập từ giống chó Rock nuôi tại quận Thủ Đức có khả năng là loài
Trichosporon asahii với mức tương đồng của vùng gen ITS rDNA là 99%.
Mẫu M11-1 được phân lập từ giống chó xù Bắc Hà nuôi tại quận Thủ Đức có khả năng
là loài Meyerozyma guilliermondii với mức tương đồng của vùng gen ITS rDNA là
99%.
Mẫu M23-2 được phân lập từ giống chó Pug nuôi tại quận Thủ Đức có khả năng là loài
Pichia guilliermondii với mức tương đồng của vùng gen ITS rDNA là 79%.
Dựa trên các thông tin từ các nghiên cứu trên thế giới thì cả 4 chủng nấm men
trên điều có khả năng gây bệnh cho người và chó với mức độ khác nhau, đặc biệt là với
những người bị suy giảm miễn dịch. Trong đó, loài Meyerozyma guilliermondii tuy rất
hiếm khi được phát hiện trong các ca viêm da toàn thân nhưng lại có khả năng kháng
thuốc kháng nấm. Các chủng còn lại điều được phát hiện là tác nhân gây nên những
thương tổn nặng nề không chỉ trên da mà còn ở các cơ quan nội tạng khác.
4.2. Đề nghị
Qua quá trình nghiên cứu và tìm hiểu các thông tin từ các nghiên cứu trên thế giới
về các loài nấm men đã định danh được thì các nấm men gây bệnh trên chó có thể lây
lan sang người. Đặc biệt là với những người suy giảm miễn dịch. Vì vậy đối với những
người đang điều trị ung thư, bị nhiễm HIV hoặc những căn bệnh có liên quan đến hệ

44
miễn dịch làm suy giảm miễn dịch thì không nên tiếp xúc với chó hay các vật nuôi
khác.
Do thời gian và điều kiện thực hiện bài luận văn có hạn nên có nhiều phần không
thể thực hiện nên chúng tôi có một số đề nghị:
✓ Khảo sát khả năng gây bệnh của các chủng nấm men phân lập được.
✓ Khảo sát sự nhạy cảm của các chủng đối với các thuốc kháng nấm.

45
Tài liệu tham khảo
❖ Tài liệu tiếng Việt
[3] Lý Thị Liên Khai và Huỳnh Trần Phúc Hậu. Khảo sát sự lưu hành của một số nấm
gây bệnh trên da, lông chó tại tỉnh Sóc Trăng và thử nghiệm thuốc điều trị. Trường Đại
học Cần Thơ. Tạp chí Khoa học 2012:22c 47-56.
[6] Nguyễn Lân Dũng, Đào Thị Lương. Nấm Men 11/07/2006.
❖ Tài liệu tiếng Anh
[1] The world wide population of dogs is astonishingly large.Published on September
19, 2012 by Stanley Coren, Ph.D., F.R.S.C. in Canine Corner.
[2] Ernest E. Ward, Jr., DVM. 2014. What causes “seborrhea” (dog dandruff and cat
dandruff)?.
[4] Walker K, Skelton H, Smith K. (2002). "Cutaneous lesions showing giant yeast
forms of Blastomyces dermatitidis". Journal of Cutaneous Pathology (10): 616–618.
[5] Kurtzman CP, Fell JW. (2006). "Yeast Systematics and Phylogeny—Implications
of Molecular Identification Methods for Studies in Ecology". Biodiversity and
Ecophysiology of Yeasts, The Yeast Handbook.
[7] Suh SO, McHugh JV, Pollock DD, Blackwell M. (2005)."The beetle gut: a
hyperdiverse source of novel yeasts". Mycological Research 109 (3): 261–265.
[8] Barnett JA. (1975). "The entry of D-ribose into some yeasts of the
genus Pichia". Journal of General Microbiology 90 (1): 1–12.
[9] Arthur H, Watson K. (1976). "Thermal adaptation in yeast: growth temperatures,
membrane lipid, and cytochrome composition of psychrophilic, mesophilic, and
thermophilic yeasts". Journal of Bacteriology 128: 56–68.

46
[10] Balasubramanian MK, Bi E, Glotzer M. (2004). "Comparative analysis of
cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells". Current Biology 14:
R806–818.
[11] Yeong FM. (2005). "Severing all ties between mother and daughter: cell
separation in budding yeast". Molecular Microbiology 55 (5): 1325–1331.
[12] Cogliati M. (2013). "Global molecular epidemiology ofCryptococcus
neoformans and Cryptococcus gattii: An atlas of the molecular
types". Scientifica 2013: 675213.
[13] O' Meara TR, Alspaugh JA. (2012). "The Cryptococcus neoformans capsule: A
sword and a shield". Clinical Microbiology Reviews 25 (3): 387–408.
[14] Ainsworth, G. C. 1986. History of medical and veterinary mycology, p.43–47.
Cambridge University Press, Cambridge.
[15] G. C. Ainsworth, History of medical and veterinary mycology, p. 1986. 43–47.
Cambridge University Press, Cambridge.
[16] M.G. Rinaldi,BiologyandpathogenicityofCandidaspecies,p.1–20. In G. P. Bodey
(ed.), Candidiasis: pathogenesis, diagnosis and treatment. Raven Press, New
York.1993.
[17] Rinaldi,M.G.1993.Biology and pathogeni city of Candida species, p.1–20.In G. P.
Bodey (ed.), Candidiasis: pathogenesis, diagnosis and treatment. Raven Press, New
York.
[18] Anaissie, E., and G. P. Bodey. 1989. Nosocomial fungal infections: old problems
and new challenges. Infect. Dis. Clin. North Am. 3:867–882.

47
[19] Anaissie, E., G. P. Bodey, H. Kantarjian, J. Ro, S. E. Vartivarian, R. Hopfer,
J.Hoy, and K.Rolston. 1989. New spectrum of fungal infections in patients with cancer.
Rev. Infect. Dis. 11:369–378.
[20] Samonis,G.,andD.Bafaloukos.1992.Fungal infections in cancer patients: an
escalating problem. In Vivo 6:183–194.
[21] Beck-Sague´, C. M., W. R. Jarvis, and the National Nosocomial Infections
Surveillance System. 1993. Secular trends in the epidemiology of nosoco-mial fungal
infections in the United States, 1980–1990. J. Infect. Dis. 167: 1247–1251.
[22] Borg von-Zepelin, M., H. Eiffert, M. Kann, and R. Ru¨chel. 1993. Changes in the
spectrum of fungal isolates: results from clinical specimens gathered in 1987/1988
compared with those in 1991/1992 in the University Hospital, Go¨ttingen, Germany.
Mycoses 36:247–253.
[23] Y Van de Peer, J Jansen, P De Rijk, and R De Wachter. 1996. Database on the
structure of small ribosomal subunit RNA. Nucleic Acids Res. Jan 1, 1997; 25(1): 111–
116.
[24] White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J., 1989 Amplification and direct sequencing of
fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis M, Gelfand DH, Sninsky JJ,
White TJ, eds. PCR protocols: a guide to methods and applications. San Diego,
California: Academic Press Inc. p 315–322.
[25] Bruns TD, Szaro TM., 1992 Rate and mode differences between nuclear and
mitochondrial small-subunit rRNA genes in mushrooms. Mol Biol Evol 9: 836 -855.
[26] David Ellis ,The University of Adelaide,“Rhodotorula rubra”, Mycology Online,
2014.

48
[27] McPartland JM, Goff JP. (1991). "Neotypification of Trichosporon beigelii:
morphological, pathological and taxonomic considerations".Mycotaxon 41: 173–178.
[28] David Ellis. 2005. Trichosporon beigelii. The University of Adelaide Australia.
[29] Cuenca-Estrella, M., L. Rodero, G. Garcia-Effron, and J. L. Rodriguez
Tudela. 2002. Antifungal susceptibilities of Candida spp. isolated from blood in Spain
and Argentina, 1996-1999. J. Antimicrob. Chemother.
[34] Pavlov, A. R.; Pavlova, N. V.; Kozyavkin, S. A.; Slesarev, A. I. (2004). "Recent
developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient
applications☆". Trends in Biotechnology 22 (5): 253–260.
[35] Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976). "Deoxyribonucleic acid polymerase from
the extreme thermophile Thermus aquaticus". J. Bacteriol 127 (3): 1550–1557.
[36] Sharkey, D. J.; Scalice, E. R.; Christy, K. G.; Atwood, S. M.; Daiss, J. L. (1994).
"Antibodies as Thermolabile Switches: High Temperature Triggering for the
Polymerase Chain Reaction". Bio/Technology 12 (5): 506–509.
❖ Tài liệu mạng
[30]http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaivisinhbangsinhhocphan
tu.htm
[31] http://www.vsmmb.com/data/upload_file/File/PCR%20book%201/PCR_basic.pdf
[32]http://danluat.thuvienphapluat.vn/nuoi-cho-phai-dang-ky-va-duoc-cap-so-ban-co-
tin-khong-82093.aspx
[33] http://www.virbac.vnn.vn/thong-tin-ki-thuat/890/benh-viem-da-co-mu

i
Phụ lục
A. Hình ảnh các trang thiết bị phục vụ nghiên cứu.......................................................1
B. Kết quả so sánh trình tự ITS rDNA của 4 mẫu nấm men với ngân hàng gen NCBI
........................................................................................................................................2
Kết quả so sánh M9-1 với Rhodotorula mucilaginosa KDLYL10 trên trình tự đoạn
gen ITS 5.8S rDNA .....................................................................................................2
Kết quả so sánh M9-5 với Trichosporon asahii trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S
rDNA...........................................................................................................................3
Kết quả so sánh M11-1 với Meyerozyma guilliermondii KAML05 trên trình tự
đoạn gen ITS 5.8S rDNA. ..........................................................................................4
Kết quả so sánh M23-2 với Pichia guilliermondii WM 02.91trên trình tự đoạn gen
ITS 5.8S rDNA...........................................................................................................6

1
PHỤ LỤC
A. Hình ảnh các trang thiết bị phục vụ nghiên cứu
Máy li tâm lạnh MIKRO 220R Hộp đèn soi UV Uvintec
Nguồn EC105 và Bể điện di IBI QS- 710 Máy PCR sprint thermo Cycler
Kính hiển vi Nikon eclipse 80i BioRad UV CCD Camera

2
B. Kết quả so sánh trình tự ITS rDNA của 4 mẫu nấm men với ngân hàng gen
NCBI
Kết quả so sánh M9-1 với Rhodotorula mucilaginosa KDLYL10 trên trình tự
đoạn gen ITS 5.8S rDNA.
Score Expect Identities Gaps Strand
1114 bits(603) 0.0 603/603(100%) 0/603(0%) Plus/Plus
Query 1 CGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGT 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 5 CGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGT 64
Query 61 CCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACTCTCGCAAGAGAGC 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 65 CCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACTCTCGCAAGAGAGC 124
Query 121 GAACTCCTATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAAAATA 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 125 GAACTCCTATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAAAATA 184
Query 181 AAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 185 AAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT 244
Query 241 AAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCC 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 245 AAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCC 304
Query 301 ATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTCT 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 305 ATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTCT 364
Query 361 TAATGATTGAAGAGGTGTTTGGTTTCTGAGCGCTGCTGGCCTTTACGGTCTAGCTCGTTC 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 365 TAATGATTGAAGAGGTGTTTGGTTTCTGAGCGCTGCTGGCCTTTACGGTCTAGCTCGTTC 424

3
Query 421 GTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCT 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 425 GTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCT 484
Query 481 GAGGAATTCTAGTCTTCGGACTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCAGAAT 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 485 GAGGAATTCTAGTCTTCGGACTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCAGAAT 544
Query 541 GTCTACATTTTAAGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATAT 600
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 545 GTCTACATTTTAAGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATAT 604
Query 601 CAA 603
|||
Sbjct 605 CAA 607
Kết quả so sánh M9-5 với Trichosporon asahii trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S
rDNA.
1005 bits(544) 0.0 560/567(99%) 4/567(0%) Plus/Plus
Query 15 GGAAGTAAAAGTCGTAACATTCGTTTTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAT 74
||||||||||||||||||| |||| |||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1 GGAAGTAAAAGTCGTAACA-AGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAT 59
Query 75 TGCCTTTATAGGCTTATAACTATATCCACTTACACCTGTGAACTGTTCTACTACTTGACG 134
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 60 TGCCTTTATAGGCTTATAACTATATCCACTTACACCTGTGAACTGTTCTACTACTTGACG 119
Query 135 CAAGTCGAGTATTTTTACAAACAATGTGTAATGAACGTCGTTTTATTATAACAAAATAAA 194
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 120 CAAGTCGAGTATTTTTACAAACAATGTGTAATGAACGTCGTTTTATTATAACAAAATAAA 179
Query 195 ACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAA 254
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 180 ACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAA 239

4
Query 255 GTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAGCTTGCGCTCTCT 314
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 240 GTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAGCTTGCGCTCTCT 299
Query 315 GGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTCAGTGTCATGAAATCTCAACCACTAGGGTTTCCTA 374
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 300 GGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTCAGTGTCATGAAATCTCAACCACTAGGGTTTCCTA 359
Query 375 ATGGATTGGATTTGGGCGTCTGCGATTTCTGATCGCTCGCCTTAAAAGAGTTAGCAAGTT 434
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 360 ATGGATTGGATTTGGGCGTCTGCGATTTCTGATCGCTCGCCTTAAAAGAGTTAGCAAGTT 419
Query 435 TGACATTAATGTCTGGTGTAATAAGTTTCACTGGGTCCATTGTGTTGAAGCGTGCTTCTA 494
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 420 TGACATTAATGTCTGGTGTAATAAGTTTCACTGGGTCCATTGTGTTGAAGCGTGCTTCTA 479
Query 495 ATCGTCCGCAAGGACAATTACTTTGACTCTGGCCT-AAATCAGGTAGGACTACCCGCTGA 553
||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||
Sbjct 480 ATCGTCCGCAAGGACAATTACTTTGACTCTGGCCTGAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGA 539
Query 554 ACTTAAGCATATCAA-AAGTCGGAGGA 579
||||||||||||||| ||| |||||||
Sbjct 540 ACTTAAGCATATCAATAAG-CGGAGGA 565
Kết quả so sánh M11-1 với Meyerozyma guilliermondii KAML05 trên trình tự
đoạn gen ITS 5.8S rDNA.
1149 bits(622) 0.0 633/638(99%) 2/638(0%) Plus/Plus
Query 4 TTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAC 63
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 47 TTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAC 106
Query 64 AGTATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTG 123
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

5
Sbjct 107 AGTATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTG 166
Query 124 ATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAAC 183
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 167 ATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAAC 226
Query 184 ACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAACTTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAA 243
||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 227 ACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAA 286
Query 244 CGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAAT 303
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 287 CGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAAT 346
Query 304 TGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGA 363
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 347 TGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGA 406
Query 364 GGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATA 423
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 407 GGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATA 466
Query 424 CTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGC 483
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 467 CTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGC 526
Query 484 TGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTC 543
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 527 TGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTC 586
Query 544 TGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTA-GAA 602
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||
Sbjct 587 TGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAA 646
Query 603 TACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCCGGAGGAA 640
||||||||||||||||||||||||| | || |||||||
Sbjct 647 TACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGC-GGAGGAA 683

6
Kết quả so sánh M23-2 với Pichia guilliermondii WM 02.91trên trình tự đoạn gen
ITS 5.8S rDNA.
342 bits(185) 3e-90 416/527(79%) 17/527(3%) Plus/Plus
Query 24 GTCATCTAGAGAAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTT-CCGTAGGTGAACAAGGGGAAGGAT 82
||||| ||||| ||||||||||||||||||||||| |||||||||||| | ||||||||
Sbjct 15 GTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGAT 74
Query 83 CATTACAGAAGTTTTTAGCCAGCCATTAACTGCGCGGCGAAAAACCCCGACTTCACTGAG 142
|||||||| | | ||| |||||| ||||||||||||||||||||| || ||| | |
Sbjct 75 CATTACAGTATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACC-TTAC-ACACAGTG 132
Query 143 TCGTAATGA-CCATTCCTCTTGCTTTGGTACGGCCTAGAGATAGGTTGGCCCACAGGTTT 201
|| | ||| || ||||||||||||| |||||||||||||||||| ||| ||||||
Sbjct 133 TCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTT 192
Query 202 AACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGAAA-TAAAATGAACAACTT-TCTTCAAGA-T 258
||||||||||||||||||||||||||||| | | |||| || | ||||||| | |
Sbjct 193 AACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACT 252
Query 259 ATCAACAACTGGATCCAAGGGTTCT-GCTCCGA-GAAGAAAGCAGGGAAAACGCAAATAA 316
|||||||| ||||| |||||| || ||| |||||| |||| |||| || | |||
Sbjct 253 TTCAACAAC-GGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT-GCGA-TAA 309
Query 317 --AATTTGCCCCGCAGATTTTAC-GAATCATGGAAGATTC-ATCGTAGCCGGCGCCCTCT 372
||| || ||||||||| ||||||| ||| || | || | |||||||||
Sbjct 310 GTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCT 369
Query 373 GGTATTCCGGCGGGCATTCCCCTTTGAGCGTCATTTCCCCATCAAACCCCCGGGTTTGGT 432
|||||||| | |||||| || ||||||||||||||| | |||||||||||||||||||
Sbjct 370 GGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGT 429
Query 433 AATGAGGGATAGTCTTAGTCGGACTAGTCGTTTGCC-GAAAAGTATCGGCGACGTTAGTT 491
| |||| |||| ||||||||||||||| ||||||| ||||||||| ||| | ||||

7
Sbjct 430 ATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTA 489
Query 492 TTGGATAGGAAGGTCGATCTGTAAATGTATTAGGTTTATCCAATTCG 538
| ||||| ||||| || | |||||||||||||||||||| |||
Sbjct 490 CTAGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCG 536

Phân lập và định danh vùng gen its của nấm men nhiễm bệnh trên da chó nuôi tại tp. hồ chí minh

Recommandé

Recommandé

Contenu connexe

Tendances

Tendances (20)

Similaire à Phân lập và định danh vùng gen its của nấm men nhiễm bệnh trên da chó nuôi tại tp. hồ chí minh

Similaire à Phân lập và định danh vùng gen its của nấm men nhiễm bệnh trên da chó nuôi tại tp. hồ chí minh (20)

Plus de https://www.facebook.com/garmentspace

Plus de https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Dernier

Dernier (20)

Phân lập và định danh vùng gen its của nấm men nhiễm bệnh trên da chó nuôi tại tp. hồ chí minh