Amino acid determination gc mass

1. 1

2. 2
عنوان مقاله:
تعیین میزان آمینواسید مخمر غنی شده از سلنیوم
بعد از هیدرولیز با میکرویو GC-MS به روش
ارائه به:
آقای دکتر پرویز آبرومند
گردآورنده:
منیره رحمانی
دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم تحقیقات
دانشکده علوم
اردیبهشت 1393

3. 3
Determination of amino acids in
selenium-enriched yeast by
gas chromatography-mass spectrometry
after microwave assisted hydrolysis
Xu Zhang,Lu Yang, Zoltan Mester∗
National Research Council Canada, Ottawa, Ontario K1A 0R6, Canada
Analytica Chimica Acta 744 (2012) 54– 59

4. 4
دید کلی مقاله:
مخمر غنی از
سلنیوم
GC-MS هیدرولیز آمینواسید
معرفی دستگاه معرفی دستگاه
مواد اولیه مواد اولیه
آماده سازی نمونه
بهینه سازی
پارامترهای موثر
آماده سازی نمونه
نتایج
نحوه ی انتخاب روش

5. مخمر غنی از سلنیوم:
میکرو ارگانیسم تک سلولی 
 بیش از 1500 گونه
به صورت تجمعی در خاک و گیاهان و دریا و محیط آبی 
 کاربرد در گذشته : تهیه نان و مشروب
کاردبرد کنونی: صنایع غذایی ،آنزیم سازی و تهیه آبجو 
سرشار از : - ویتامین 
5
- پروتئین
- عناصر ضروروی کمیاب

6. برای رشد طبیعی بدن مورد نیاز است. ،B-Complex : ویتامین 
6
ویتامین
Vitamin B1 Thiamine
Vitamin B2 Riboflavin
Vitamin B3 Niacin
Vitamin B5
Pantothenic
acid
Vitamin B6 Pyridoxine
Vitamin B7 Biotin
Vitamin B9 Folic Acid
Vitamin B12 Cobalamin

7. 7
سلنیوم
سلنیوم : - محافظت از سلول ها در برابر رادیکالهای آزاد 
- موثر در عملکرد سیستم ایمنی و غده تیروئید ، جهت پیشگیری از انواع سرطان
 دارد. (Selenite) که سمیت کمتری نسبت به گونه های سلنیوم غیر آلی Selenomethionine حاوی
 % 19 جذب بالاتر در بدن
بنابراین مخمر غنی از سلنیوم مکمل محبوب و پرطرفداری است. 
Selenous acid (Selenite) Selenomethionine

8. 8
پروتئین
آمینواسیدها واحدهای تشکیل دهنده ی پروتئین هستند. 
تعیین میزان آمینواسیدها به دلیل نقش موثر در تغذیه، مهم است. 

9. نحوه ی انتخاب روش :
آمینو اسیدها واحد تشکیل دهنده ی پروتئین  ؟ چرا هیدرولیز 
معایب: 
HCl - تخریب برخی از آمینواسدها در مجاورت
9
 شکستن پروتئین و تبدیل به آمینواسیدها
 با استفاده از آنزیم  : انواع روش های هیدرولیز
با استفاده از ترکیبات قلیایی 
هیدرولیز اسیدی 
 هیدرولیز اسیدی متداول :
Δ =110 °C
t = 20 – 24 h
مخمر HCl , 6M
 هیدرولیز اسیدی مورد استفاده :
Δ =150 °C
مزیت: 
- عدم تخریب آمینواسیدها
مخمر MSA , 4M
استفاده از تابش امواج میکرویو جهت کاهش زمان فرایند هیدرولیز

10. نحوه ی انتخاب روش :
 ion exchange chromatography (IEC)
 انواع روش های متداول آنالیز آمینو اسیدها :
 capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS)
 high-performance liquid chromatography mass spectrometry (HPLC–MS)
 gas chromatography mass spectrometry (GC–MS)
 : GC-MS چرا
حساسیت بالا 
تفکیک پذیری بالا 
شناسایی همزمان تمام آمینواسیدها با یک بار آنالیز 
10

11. 11
جهت افزایش فراریت ،GC-MS آماده سازی نمونه برای
 روش متداول :
معایب: 
- نیاز به حرارت دادن و شرایط بدون آب
Hexamethldisilazane
or
AAs Trimethylsilyl
 روش مورد استفاده :
مزیت: 
- شرایط آسان:دمای اتاق و انجام فرایند طی 60 ثانیه
Δ = دمای اتاق
Methyl chloroform
AAs
t = 60 Sec
نحوه ی انتخاب روش :

12. معرفی دستگاه:
CEM Focused Microwave  TM
48 – position 
قابلیت مونیتورینگ دما و فشار و توان 
 2 گیگاهرتز / دارای مگنترون با تولید امواج میکرویو با فرکانس 45
 تولید امواج میکرویو : برهمکنش الکترون ها و میدان مغناطیس
12
اجزا مگنترون مقایسه حرارت دهی معمولی و میکرویو

13. معرفی دستگاه:
CEM Focused Microwave  TM
13
مکانیسم ایجاد میکرویو توسط مگنترون دستگاه میکرویو

14. : GC-MS معرفی دستگاه
14
 Hewlett-Packard HP 6890 GC
 fitted with a HP 7683 Automatic Injector
- injector temperature was 280 ◦C
 Detection was achieved with an HP model 5973
 Enhanced Chemstation software (Version B.01.00)
 column used for separation was DB-5MS
 Helium carrier gas
- flow rate was 1.5 mL min−1 at a pressure of 17.6 psi
 oven
- temperature program :started at 120 ◦C with a hold of
2 min and was ramped at 15 ◦C min−1 to 290 ◦C
 MS ion source temperature was 250 ◦C
 transfer line temperature was 260 ◦C

15. : GC-MS معرفی دستگاه
15
GC-MS دستگاه
GC-MS ستون دستگاه Injector

16. کوپل شده؟؟؟؟ Mass با GC چرا
16
دتکتورهای مورد استفاده در کروماتوگرافی گازی

17. مواد اولیه جهت هیدرولیز:
 HCl 1% (v/v) 1) در mmol L− محلول استوک استاندارد حاوی آمینو اسیدها ( 1
(98% purity) ، methanesulfonic acid (MSA) 
DIW 
17
Methanesulfonic acid

18. :GC-MS مواد اولیه جهت
 در آب ،Dithiothreitol (DTT) (50 mmol L− محلول استاندارد ( 1
Environmental grade ammonium hydroxide 
Methyl chlorofomate (MCF) (99% purity) 
Methanol (99.9% purity) 
Pyridine (99.9% purity) 
Chloroform 
18

19. آماده سازی نمونه برای هیدرولیز:
19
چند میلی گرم مخمر
4.5 ml
DIW
1.5 ml
MSA
MSA
4M

20. :GC-MS آماده سازی نمونه برای
20
نمونه
هیدرولیز شده
جهت تنظیم
PH=3
ammonium
hydroxide
خنک کردن
سانتریفیوژ
12000RPM
5 min
DTT
عامل کاهش
جلوگیری از اکسید شدن
Cysteine
و ایجاد مشتقات دی سولفید

21. :DTT مکانیسم
21
Cystine ترکیب 2 آمینواسید DTT مکانیسم واکنش

22. :GC-MS آماده سازی نمونه برای
22
300μl
MCF
به آرامی
900μl
پیریدین / متانول
با نسبت حجمی 1:3
1 ml
CF
سانتریفیوژ
2000 RPM
10 min
200 μl
لایه کلروفرم
آماده برای
1 min 1 min GC-MS

23. 23
:GC-MS تکنیک

24. نتیجه:
24
Standard Addition Calibration

25. 25
نتیجه:
: standard addition calibration محاسه غلظت با استفاده از روش
1) VX CX = VS CS
2) S = m Vs + b S = 0 Vs = b/m
푪풙 =
풃 . 푪풔
풎 . 푽풙
آماده شد. GC-MS 3 نمونه از هر 5 محلول اسپایک و یک محلول شاهد ، برای

26. 26
نتیجه:
مشاهده نشد. Arg , Gln , Ser پیک 
- فراریت کم
- مقاموت حرارتی پایین
شنسایی شد. HPLC-MS با 
یکسان داشتند. Rt ، Pro & Asn وAla & Gly 

27. 27
نتیجه:

28. 28
بهینه سازی پارامترهای موثر بر هیدرولیز:
زمان حرارت دهی:
 10-180 min محدوده زمانی
توان : 300 وات 
150 ˚C : دما 
50 نمونه mg 

29. 29
بهینه سازی پارامترهای موثر بر هیدرولیز:
میزان حرارت:
 120-180 ˚C محدوده دمایی
توان : 200 وات 
30 min : زمان 
0.050 نمونه g 
6 ml , 4M MSA 

30. 30
بهینه سازی پارامترهای موثر بر هیدرولیز:
توان:
طبق مطالعات قبلی،تغییر توان تاثیر زیادی بر هیدرولیز پروتئین ندارد.
 150-300 W محدوده توان
150 ˚C : دما 
30 min : زمان 
50 نمونه mg 
200 انتخاب شد: W توان 
- سریع به دمای مورد نظر می رسد)حدود 3 دقیقه(
-جلوگیری از تخریب های احتمالی

31. 31
بهینه سازی پارامترهای موثر بر هیدرولیز:
:MSA غلظت
 1-10 M محدوده غلظت
توان : 200 وات 
30 min : زمان 
0.050 نمونه g 
 150 ˚C : دما

32. 32
تعیین آمینواسیدها در مخمر:
 Standard Addition Calibration استفاده از روش
هیدرولیز با میکرویو 
150 ˚C : - دما
30 min : - زمان
200 W : - توان
4 M :MSA - غلظت
 MCF مشتق سازی با

33. 33
تعیین آمینواسیدها در مخمر:

34. 34
نتیجه گیری :
شناسایی 17 آمینو اسید در مخمر غنی شده از سلنیوم 
هیدرولیز با میکرویو 
GC-MS استفاده از تکنیک 
روش مناسبی برای تعیین آمینواسیدها در مواد عذایی 

35. 35
پایان