Teste PCR pentru 9 boli infectioase intalnite la pasari

1. REZULTATELE INVESTIGATIILOR PCRREZULTATELE INVESTIGATIILOR PCR
IN PRECIZAREA DIAGNOSTICULUIIN PRECIZAREA DIAGNOSTICULUI
BOLILOR LA PASARIBOLILOR LA PASARI
IN PERIOADA IANUARIE - NOIEMBRIE 2012IN PERIOADA IANUARIE - NOIEMBRIE 2012
INTALNIREA TRIMESTRIALA AINTALNIREA TRIMESTRIALA A
SOCIETATII MEDICILOR VETERINARI IN PATOLOGIA AVIARASOCIETATII MEDICILOR VETERINARI IN PATOLOGIA AVIARA
SI A ANIMALELOR MICI DIN ROMANIASI A ANIMALELOR MICI DIN ROMANIA
ACADEMIA DE STIINTE AGRICOLE SI SILVICE ‘GHEORGHE IONESCU SISESTI”ACADEMIA DE STIINTE AGRICOLE SI SILVICE ‘GHEORGHE IONESCU SISESTI”
AULA MAGNAAULA MAGNA
BucurestiBucuresti 1212 decembrie 2012decembrie 2012
Dr. Virgilia PopaDr. Virgilia Popa11
, Dr. Eduard Caplan, Dr. Eduard Caplan11
, Dr. Marian Culcescu, Dr. Marian Culcescu11
,,
Dr. Jenica BucurDr. Jenica Bucur22
, Prof. univ. Dr. Nicolae Catana, Prof. univ. Dr. Nicolae Catana33
, Dr. Ionica Fodor, Dr. Ionica Fodor33
,,
Conf. Univ. Dr. Nicolae AlexandruConf. Univ. Dr. Nicolae Alexandru11
, Prof. univ. Dr. Valer Teusdea, Prof. univ. Dr. Valer Teusdea11
11
SN Institutul Pasteur SA,SN Institutul Pasteur SA, 22
SC Farmavet SA,SC Farmavet SA, 33
FMV Timisoara, Catedra de boli infectioaseFMV Timisoara, Catedra de boli infectioase

2. CENTRUL DE DIAGNOSTICCENTRUL DE DIAGNOSTIC
INSTITUTUL PASTEURINSTITUTUL PASTEUR
176 examene PCR176 examene PCR
((PCR clasic, multiplex PCR clasic, rPCRPCR clasic, multiplex PCR clasic, rPCR, RAPD), RAPD)
 colisepticemia / colibacilozele aviarecolisepticemia / colibacilozele aviare ((tipizareatipizarea E.coliE.coli specificspecific
patogenpatogenaa pentru pasari -pentru pasari - APECAPEC))
 micoplasmozele aviare cauzate demicoplasmozele aviare cauzate de Mycoplasma gallisepticumMycoplasma gallisepticum
((MGMG) si) si M. synoviaeM. synoviae ((MSMS),),
 ornitobacterioza (detectia agentului cauzalornitobacterioza (detectia agentului cauzal OrnithobacteriumOrnithobacterium
rhinotrachealerhinotracheale -- ORTORT),),
 bronsita infectioasa aviara (bronsita infectioasa aviara (IBVIBV, prin detectia si discriminarea, prin detectia si discriminarea
tulpinilor tiptulpinilor tip QxQx,, MassMass sisi It02It02),),
 laringotraheita infectioasa aviara (laringotraheita infectioasa aviara (ILTILT),),
 boala Marek (detectia agentului cauzal,boala Marek (detectia agentului cauzal, MDVMDV),),
 bursita infectioasa aviara (bursita infectioasa aviara (IBDVIBDV, cu detectia si discriminarea, cu detectia si discriminarea
patotipului foarte virulent,patotipului foarte virulent, vvvv, si a patotipului atenuat,, si a patotipului atenuat, attatt))
 rinotraheita infectioasa aviara (rinotraheita infectioasa aviara (AMPV / ART / TRTAMPV / ART / TRT, cu detectia si, cu detectia si
discriminarea tipurilor viralediscriminarea tipurilor virale A, B, CA, B, C sisi DD).).

3. Escherichia coliEscherichia coli
patogena pentru pasaripatogena pentru pasari -- APECAPEC
Extracţie ADN: lizat termic, din culturi pure obtinute in BHI (Himedia),Extracţie ADN: lizat termic, din culturi pure obtinute in BHI (Himedia),
la 37oC, timp de 18 ore (Germani 1995). Multiplex PCR pentru genelela 37oC, timp de 18 ore (Germani 1995). Multiplex PCR pentru genele
ompA, iss si fimH:ompA, iss si fimH: (Popa et al. 2004, Scientific Papers Veterinary(Popa et al. 2004, Scientific Papers Veterinary
Medicine Timisoara, 37: 522 – 528). Amestec de amplificare: IlustraMedicine Timisoara, 37: 522 – 528). Amestec de amplificare: Ilustra
PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare). Volum dePuReTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare). Volum de
reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate comercial (NAPS Unit, UBCreactie: 25 ul. Amorse, sintetizate comercial (NAPS Unit, UBC
Vancouver, Canada): ompA – 30 pmol fiecare, iss si fimH – 25 pmolVancouver, Canada): ompA – 30 pmol fiecare, iss si fimH – 25 pmol
fiecare. Amplificator PE GeneAmp PCR System 9600 (Appliedfiecare. Amplificator PE GeneAmp PCR System 9600 (Applied
Biosystems) sau iCyler (Biorad). Program de amplificare (81PE):Biosystems) sau iCyler (Biorad). Program de amplificare (81PE):
94oC, 10min – 1x; 94oC, 1 min + 55oC, 1,5 min + 72oC, 2,5 min –94oC, 10min – 1x; 94oC, 1 min + 55oC, 1,5 min + 72oC, 2,5 min –
30x; 72oC, 10 min – 1x; 4oC – for ever. Martor pozitiv intern: tulpina30x; 72oC, 10 min – 1x; 4oC – for ever. Martor pozitiv intern: tulpina
E.coli PIB4293 (origine aviară; 1996; CRb+; serr; iss+; ompA+;E.coli PIB4293 (origine aviară; 1996; CRb+; serr; iss+; ompA+;
fimH+). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW –fimH+). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW –
P119C).P119C).
Escherichia coli de origine aviara. Gel
electroforeza post-multiplex PCR
ompA+iss+fimH pentru tipizare moleculara
APEC. Linia 1 – standard ADN – 100bp DNA
Ladder (Promega); linia 2 – martor pozitiv
E.coli PIB 4293 (pozitiv ompA, iss, fimH);
linia 3 – E.coli 9987 (pozitiv ompA, iss,
fimH); linia 4 – E.coli 9988 (pozitiv ompA,
iss, fimH); linia 5 – E.coli 9989 (pozitiv
ompA, iss, fimH); linia 6 – martor negativ
(NFW).
1 2 3 4 5 6
670bp
737bp
1421bp

4. Cultivarea probelor deCultivarea probelor de
organ (amprente) prelevateorgan (amprente) prelevate
pe tampoane de sanitatiepe tampoane de sanitatie
pentru examenele prinpentru examenele prin
PCR pentru evidentiereaPCR pentru evidentierea
prezentei de materialprezentei de material
genetic apartinandgenetic apartinand
MycoplasmaMycoplasma spp., timp despp., timp de
1h la 371h la 37oo
C, in MycoplasmaC, in Mycoplasma
Synoviae Medium BaseSynoviae Medium Base
(M624, Himedia),(M624, Himedia),
suplimentat cu 10% ser desuplimentat cu 10% ser de
porc inactivat la 56oC,porc inactivat la 56oC,
100000 UI % penicilina G100000 UI % penicilina G
si 0.025% acetat de taliu.si 0.025% acetat de taliu.
Mycoplasma gallisepticumMycoplasma gallisepticum –– MGMG
Mycoplasma synoviaeMycoplasma synoviae -- MSMS
Probe prelevate de la tineret RG 25 – 28 zile (pool-uriProbe prelevate de la tineret RG 25 – 28 zile (pool-uri
narine - N, pulmon -P, trahee - T). Gel-electroforezanarine - N, pulmon -P, trahee - T). Gel-electroforeza
post multiplex PCR (pMGA1.9 + 23s rRNA – MS)post multiplex PCR (pMGA1.9 + 23s rRNA – MS)
pentru detectiapentru detectia Mycoplasma gallisepticumMycoplasma gallisepticum sisi M.M.
synoviaesynoviae. Linia 1: Martor negativ (NFW, Promega); linia. Linia 1: Martor negativ (NFW, Promega); linia
2: narine N (pozitiv MS, ampliocn 300 bp); linia 3: T12: narine N (pozitiv MS, ampliocn 300 bp); linia 3: T1
(negativ MG, negativ MS); linia 4: T2 (negativ MG,(negativ MG, negativ MS); linia 4: T2 (negativ MG,
negativ MS); linia 5: T3 (pozitiv MS, ampliocn 300 bp);negativ MS); linia 5: T3 (pozitiv MS, ampliocn 300 bp);
linia 6: P1 (pozitiv MS, ampliocn 300 bp; + ampliconilinia 6: P1 (pozitiv MS, ampliocn 300 bp; + ampliconi
nespecifici); linia 7: P2 (pozitiv MS, ampliocn 300 bp; +nespecifici); linia 7: P2 (pozitiv MS, ampliocn 300 bp; +
ampliconi nespecifici); linia 8: P3 (pozitiv MS, ampliocnampliconi nespecifici); linia 8: P3 (pozitiv MS, ampliocn
300 bp; + ampliconi nespecifici); linia 9: P4 (pozitiv MS,300 bp; + ampliconi nespecifici); linia 9: P4 (pozitiv MS,
ampliocn 300 bp; + ampliconi nespecifici); linia 10:ampliocn 300 bp; + ampliconi nespecifici); linia 10:
Martor pozitiv: mixMartor pozitiv: mix M. gallisepticumM. gallisepticum, amplicon 163 bp) si, amplicon 163 bp) si
M. synoviae, amplicon 300 bp); linia 11 - Standard ADNM. synoviae, amplicon 300 bp); linia 11 - Standard ADN
- 100bp DNA Ladder (Promega).- 100bp DNA Ladder (Promega).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
300 bp
163 bp
Extracţie ADN : lizat termic (Ramirez et al. 2006, Veterinary Microbiology 118: 76–82)..Extracţie ADN : lizat termic (Ramirez et al. 2006, Veterinary Microbiology 118: 76–82)..
Amorse Popa V (date personale) gena pMGA1.9, M. gallisepticum, amplicon 163 bp siAmorse Popa V (date personale) gena pMGA1.9, M. gallisepticum, amplicon 163 bp si
Ramirez 2006, gena 23s ARN, M. synoviae, amplicon 300bp. Amestec de amplificare:Ramirez 2006, gena 23s ARN, M. synoviae, amplicon 300bp. Amestec de amplificare:
illustraTM PuReTaqTM Ready-To-GoTM PCR Beads (GE Healthcare 27-9557-01),illustraTM PuReTaqTM Ready-To-GoTM PCR Beads (GE Healthcare 27-9557-01),
suplimentat cu 0.5mM MgCl2. Amplificator PE GeneAmp PCR System 9600 (Appliedsuplimentat cu 0.5mM MgCl2. Amplificator PE GeneAmp PCR System 9600 (Applied
Biosystems) sau iCyler (Biorad).. Amorse, sintetizate comercial (Generi Biotech, Cehia): 30Biosystems) sau iCyler (Biorad).. Amorse, sintetizate comercial (Generi Biotech, Cehia): 30
pmol fiecare. Program de amplificare (127PE / MgallSyn,iCy): 80oC, 30min – 1x; 94oC, 15 secpmol fiecare. Program de amplificare (127PE / MgallSyn,iCy): 80oC, 30min – 1x; 94oC, 15 sec
+ 55oC, 30 sec + 72oC, 1 min – 5x; 94oC, 15 sec + 55oC, 30 sec + 72oC, 1 min – 30x, cu+ 55oC, 30 sec + 72oC, 1 min – 5x; 94oC, 15 sec + 55oC, 30 sec + 72oC, 1 min – 30x, cu
increment de 2 sec la fiecare ciclu; 72oC, 10 min – 1x; 4oC, 10 min (for ever) – 1x. Martoriincrement de 2 sec la fiecare ciclu; 72oC, 10 min – 1x; 4oC, 10 min (for ever) – 1x. Martori
pozitivi: Mycoplasma gallisepticum A5969 (Charles River Spafas – Affinitech), Mycoplasmapozitivi: Mycoplasma gallisepticum A5969 (Charles River Spafas – Affinitech), Mycoplasma
synoviae WVU1853 (Charles River Spafas – Affinitech). Martor negativ: apa ultrapura PCRsynoviae WVU1853 (Charles River Spafas – Affinitech). Martor negativ: apa ultrapura PCR
sterila (Promega, NFW – P119C).sterila (Promega, NFW – P119C).

5. Test rPCR Sybr Green pentru
tipul / serotipul Qx (CR/FR) al
VBI. Fereastra din programul
logic MxPro v4.01/2007, care
asista echipamentul de
amplificare spectrofotometrica
Mx3005P (Stratagene).
.Curba de disociere si calculul
Tm al ampliconilor obtinuti.
Probele din teren (amprente
pulmon si trahee prelevate pe
tampoane de sanitatie)
inregistreaza varfuri similare
intre ele dar cu Tm diferit de
cel al martorului pozitiv (IB88,
Merial), in marja de ± 4 Tm,
acceptata in literatura..
Coronavirusul aviarCoronavirusul aviar –– IBV / VBIIBV / VBI
Extracţie ARN: cu trusa QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen 52906). PCR IBV pentru gena S1: amorse Popa VExtracţie ARN: cu trusa QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen 52906). PCR IBV pentru gena S1: amorse Popa V
(date personale), designate pentru tipul Massachussetts, pentru tipul Qx si pentru tipul It02. Amestec de(date personale), designate pentru tipul Massachussetts, pentru tipul Qx si pentru tipul It02. Amestec de
amplificare 2x Brilliant II Sybr Green qRT-PCR Master Mix, 1 step (Agilent 600825-51). Volum de reactie: 25 ul.amplificare 2x Brilliant II Sybr Green qRT-PCR Master Mix, 1 step (Agilent 600825-51). Volum de reactie: 25 ul.
Amorse, sintetizate comercial (Generi Biotech, Cehia): 12.5 pmol fiecare. Amplificator spectrofotometricAmorse, sintetizate comercial (Generi Biotech, Cehia): 12.5 pmol fiecare. Amplificator spectrofotometric
Mx3005P (Stratagene). Program de amplificare (25Mx): 42oC, 30 min + 95oC, 15 min – 1x; 94oC, 45 sec +Mx3005P (Stratagene). Program de amplificare (25Mx): 42oC, 30 min + 95oC, 15 min – 1x; 94oC, 45 sec +
50oC, 45 sec + 72oC, 1 min – 40x; 72oC, 10 min – 1x; 25oC, 1 min – 1x; anterior demararii curbei de disociere,50oC, 45 sec + 72oC, 1 min – 40x; 72oC, 10 min – 1x; 25oC, 1 min – 1x; anterior demararii curbei de disociere,
din probele amplificate se fac controale prin gel-electroforeza pentru confirmarea reactiilor; apoi, curba dedin probele amplificate se fac controale prin gel-electroforeza pentru confirmarea reactiilor; apoi, curba de
disociere implicita a programului MxPro v01/2007 (95oC, 1 min, 55oC, 30 sec. Si rampa la 95oC, cu datedisociere implicita a programului MxPro v01/2007 (95oC, 1 min, 55oC, 30 sec. Si rampa la 95oC, cu date
colectate in toate punctele acesteia). Martori pozitivi: tulpina vaccinala IB88 (Merial, amplicon 190 bp, pentrucolectate in toate punctele acesteia). Martori pozitivi: tulpina vaccinala IB88 (Merial, amplicon 190 bp, pentru
grupul de tulpini Qx, inclusiv CR / FR / 4/91) si tulpina vaccinala Ma5 (Intervet, amplicon 212 bp, pentru grupul degrupul de tulpini Qx, inclusiv CR / FR / 4/91) si tulpina vaccinala Ma5 (Intervet, amplicon 212 bp, pentru grupul de
tulpini tip Massachussetts, inclusiv H120, H52 – tulpini vaccinale clasice). Martor negativ: apa ultrapura PCRtulpini tip Massachussetts, inclusiv H120, H52 – tulpini vaccinale clasice). Martor negativ: apa ultrapura PCR
sterila (Promega NFW – P119C).sterila (Promega NFW – P119C).
Confirmarea prin gel-electroforeza a testelor
rPCR Sybr Green pentru tipul / serotipul Qx
(CR/FR, 4/91), A, liniile 1 – 7, pentru tipul /
serotipul Mass (H120 / H52 / Ma5), B, liniile 1
– 7, si pentru tipul / serotipul It02, B, liniile 9 -
14., ale coronavirusului bronsitic aviar (VBI).
Liniile 1, 9: martor negativ apa ultrapura
(NFW, Promega); liniile 2, 10: martor negativ
LS79 (NDV, Pasteur). Liniile 8: Standard ADN:
100 bp DNA Ladder (Promega). A: liniile 3 - 6:
pool-uri de pulmon broiler 33 zile (pozitive
Qx);; linia 7: Martor pozitiv IB88, Merial pentru
Qx (amplicon 190 bp). B: liniile 3 - 6: pool-uri
de pulmon broiler 33 zile (negative Mass); linia
7: Martor pozitiv Ma5, Intervet pentru Mass
(amplicon 212 bp). B: linia liniile 11 - 14: pool-
uri de pulmon broiler 33 zile (negative It02,
ampliconi nespecifici).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
190 bp Qx
212 bp Mass
A
B

6. Test rPCR Sybr Green pentru VLTI. Curba de amplificare si
calculul valorilor Ct realizat prin programul logic MxPro
v4.01/2007, care asista echipamentul de amplificare
spectrofotometrica Mx3005P (Stratagene).
Herpesvirusul aviar de tip 1Herpesvirusul aviar de tip 1 ––
ILTV / VLTIILTV / VLTI
Extracţie ADN: cu trusa QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen 51304). PCR LTI pentru gena UL15a : amorse publicate deExtracţie ADN: cu trusa QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen 51304). PCR LTI pentru gena UL15a : amorse publicate de
Mahmoudian et al. 2011 (Avian Pathology 40(3): 237-242). Amestec de amplificare 2x Brilliant II Sybr GreenMahmoudian et al. 2011 (Avian Pathology 40(3): 237-242). Amestec de amplificare 2x Brilliant II Sybr Green
qPCR Master Mix (Agilent 600828-51). Amorse, sintetizate comercial (Generi Biotech, Cehia): 15 pmol fiecare.qPCR Master Mix (Agilent 600828-51). Amorse, sintetizate comercial (Generi Biotech, Cehia): 15 pmol fiecare.
Volum de reactie: 20 ul. Amplificator spectrofotometric Mx3005P (Stratagene). Program de amplificare (34Mx):Volum de reactie: 20 ul. Amplificator spectrofotometric Mx3005P (Stratagene). Program de amplificare (34Mx):
50oC, 2 min – 1x; 95oC, 10 min – 1x; 95oC, 15 sec + 60oC, 1 min – 40x; 60oC, 5 min – 1x; 25oC, 1 min – 1x50oC, 2 min – 1x; 95oC, 10 min – 1x; 95oC, 15 sec + 60oC, 1 min – 40x; 60oC, 5 min – 1x; 25oC, 1 min – 1x
Martor pozitiv: tulpina Cover (Charles River Spafas – Affinitech). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterilaMartor pozitiv: tulpina Cover (Charles River Spafas – Affinitech). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila
(Promega NFW – P119C).(Promega NFW – P119C).
Confirmarea prin gel-electroforeza a testului rPCR Sybr Green
pentru VLTI. Linia 1: Martor negativ, NFW (Promega); linia 2: proba
organ pozitiva pentru herpesvirusul Marek (control specificitate
amorse LTI); liniile 3 – 8: probe comasate (2 probe / tampon)
prelevate de la broileri de 17 zile (negative LTI); linia 9: martor
pozitiv LTI tulpina Cover, dilutia 10-6
(pozitiv, amplicon 113 bp); linia
10: martor pozitiv LTI tulpina Cover, dilutia 10-2
(pozitiv, amplicon
113 bp); linia 11: Standard ADN - 100bp DNA Ladder (Promega).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
113 bp

7. Herpesvirusul aviar de tipHerpesvirusul aviar de tip 22 ––
MDVMDV // VBMVBM
Extracţie ADN: Cu trusa QIAamp DNA Mini kit (Qiagen- 51304). PCR MDV-B: amorse publicate de Cho etExtracţie ADN: Cu trusa QIAamp DNA Mini kit (Qiagen- 51304). PCR MDV-B: amorse publicate de Cho et
al. 1999, Avian Pathology 28: 47-53, amplicon 669 bp. Amestec de amplificare: Ilustra PuReTaq Ready-To-al. 1999, Avian Pathology 28: 47-53, amplicon 669 bp. Amestec de amplificare: Ilustra PuReTaq Ready-To-
Go PCR Beads (GE Healthcare 27-9557-01). Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate comercialGo PCR Beads (GE Healthcare 27-9557-01). Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate comercial
(Chroma BG): 50 pmol. Amplificator PE GeneAmp PCR System 9600 (Applied Biosystems) sau iCyler(Chroma BG): 50 pmol. Amplificator PE GeneAmp PCR System 9600 (Applied Biosystems) sau iCyler
(Biorad). Program de amplificare: 94oC, 10min – 1x; 94oC, 1 min + 55oC, 1,5 min + 72oC, 2,5 min – 30x;(Biorad). Program de amplificare: 94oC, 10min – 1x; 94oC, 1 min + 55oC, 1,5 min + 72oC, 2,5 min – 30x;
72oC, 10 min – 1x; 4oC – for ever.Martor pozitiv intern - ADN proba teren 2004. Martor negativ: apa72oC, 10 min – 1x; 4oC – for ever.Martor pozitiv intern - ADN proba teren 2004. Martor negativ: apa
ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).
1 2 3 4 5 6
669 bp
Gel-electroforeza post PCR MDV-B pentru detectia virusuluiGel-electroforeza post PCR MDV-B pentru detectia virusului
Marek (GaHV2)Marek (GaHV2).. Linia 1: martor negativ (NFW, negativ); liniaLinia 1: martor negativ (NFW, negativ); linia
2: proba 1401, splina, (negativ v.Marek, + ampliconi2: proba 1401, splina, (negativ v.Marek, + ampliconi
nespecifici); linia 3: proba 1402, splina, (pozitiv v.Marek,nespecifici); linia 3: proba 1402, splina, (pozitiv v.Marek,
amplicon specific 669 bp, + ampliconi nespecifici); linia 4:amplicon specific 669 bp, + ampliconi nespecifici); linia 4:
proba 1403, splina, (pozitiv v.Marek, amplicon specific 669proba 1403, splina, (pozitiv v.Marek, amplicon specific 669
bp + ampliconi nespecifici); linia 5: martor intern pozitivbp + ampliconi nespecifici); linia 5: martor intern pozitiv
Marek - ADN proba teren 2004 (amplicon 669bp); linia 6:Marek - ADN proba teren 2004 (amplicon 669bp); linia 6:
Standard ADN - 100bp DNA Ladder (Promega).Standard ADN - 100bp DNA Ladder (Promega).

8. Extracţie ARN: cu trusa QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen 52906). PCR IBDV: amorse Thiveyrat Celine (date personale), designate pentru patotipul veryExtracţie ARN: cu trusa QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen 52906). PCR IBDV: amorse Thiveyrat Celine (date personale), designate pentru patotipul very
virulent (vv, amplicon 141 bp) si pentru patotipul atenuat (att, amplicon 102 – 106 bp). Anterior amplificarii: denaturare ARN, 10 min la 100oC, cu racirevirulent (vv, amplicon 141 bp) si pentru patotipul atenuat (att, amplicon 102 – 106 bp). Anterior amplificarii: denaturare ARN, 10 min la 100oC, cu racire
brusca pe gheata. Amestec de amplificare 2x Brilliant II Sybr Green qRT-PCR Master Mix, 1 step (Agilent 600825-51). Volum de reactie: 25 ul. Amorse,brusca pe gheata. Amestec de amplificare 2x Brilliant II Sybr Green qRT-PCR Master Mix, 1 step (Agilent 600825-51). Volum de reactie: 25 ul. Amorse,
sintetizate comercial (Dexter, Romania): 625 fmol fiecare. Amplificator spectrofotometric Mx3005P (Stratagene). Program de amplificare: 42oC, 30 min +sintetizate comercial (Dexter, Romania): 625 fmol fiecare. Amplificator spectrofotometric Mx3005P (Stratagene). Program de amplificare: 42oC, 30 min +
95oC, 15 min – 1x; 94oC, 45 sec + 50oC, 45 sec + 72oC, 1 min – 45x; 72oC, 10 min – 1x; 25oC, 1 min – 1x; anterior demararii curbei de disociere, din95oC, 15 min – 1x; 94oC, 45 sec + 50oC, 45 sec + 72oC, 1 min – 45x; 72oC, 10 min – 1x; 25oC, 1 min – 1x; anterior demararii curbei de disociere, din
probele amplificate se fac controale prin gel-electroforeza pentru confirmarea reactiilor; apoi, curba de disociere implicita a programului MxPro v01/2007probele amplificate se fac controale prin gel-electroforeza pentru confirmarea reactiilor; apoi, curba de disociere implicita a programului MxPro v01/2007
(95oC, 1 min, 55oC, 30 sec. si rampa la 95oC, cu date colectate in toate punctele acesteia). Martori pozitivi: tulpinile vaccinale IPi si IPi+ (Pasteur, ampliconi(95oC, 1 min, 55oC, 30 sec. si rampa la 95oC, cu date colectate in toate punctele acesteia). Martori pozitivi: tulpinile vaccinale IPi si IPi+ (Pasteur, ampliconi
141 bp si 106 bp). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).141 bp si 106 bp). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).
rPCR Sybr Green pentru virusul
bursitei infectioase aviare (IBDV/BIA),
patotip foarte virulent (vv) si patotip
atenuat (vaccinal). Curba de disociere.
Program logic MxPro (Stratagene /
Agilent). Martorii pozitivi au inregistrat
valori Tm 82.35 (vv), respectiv 81.80
(atenuat). Probele au inregistrat Tm
80.15 (3/5), 83.85 (1/5) si 84.4 (1/5),
incadrandu-se in intervalul de ± 4Tm
fata de martorul vv, si valori Tm de
75.85 (2/5), 77.45 (3/5), neincadrnadu-
se in intervalul ± 4Tm fata de martorul
atenuat.
AvibirnavirusAvibirnavirus –– IBDVIBDV // VBIAVBIA
Confirmarea prin gel-electroforeza a
testelor rPCR Sybr Green pentru VBIA
(IBDV). Randul A (sus): rPCR Sybr
Green pentru detectia patotipului foarte
virulent de virus bursitic aviar (IBVD /
BIA). Randul B (jos): rPCR Sybr Green
pentru detectia patotipului atenuat de
VBIA (IBDV). Liniile 1: NFW; liniile 2:
martor negativ specificitate; liniile 3: BF1
(pozitiv very virulent, negativ atenuat);
liniile 4: BF2 (pozitiv very virulent,
negativ atenuat); liniile 5: BF3 (pozitiv
very virulent, negativ atenuat); liniile 6:
BF4 (pozitiv very virulent, negativ
atenuat); liniile 7: BF5 (pozitiv very
virulent, negativ atenuat); liniile 8: IPi+
(martor pozitiv, pozitiv vv, pozitiv
atenuat); liniile 9: IPi+ (martor pozitiv,
pozitiv vv, pozitiv atenuat); liniile 10: IPi
(martor pozitiv, pozitiv vv, pozitiv
atenuat); liniile 11: 100 bp DNA ladder
(Promega)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11A
B
106 bp
141 bp

9. Extracţie ADN: Cu trusa QIAamp DNA Mini kit (Qiagen- 51304). PCR Ort-16s: amorse Popa V. (dateExtracţie ADN: Cu trusa QIAamp DNA Mini kit (Qiagen- 51304). PCR Ort-16s: amorse Popa V. (date
nepublicate), designate pe gena 16s ARNr, amplicon 197 bp. Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizatenepublicate), designate pe gena 16s ARNr, amplicon 197 bp. Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate
comercial (Generi Biotech, Cehia): 30 pmol.Amestec de amplificare: illustra PuReTaq Ready-To-Go PCRcomercial (Generi Biotech, Cehia): 30 pmol.Amestec de amplificare: illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR
Beads (GE Healthcare 27-9557-01). Amplificator iCycler (Biorad). Program de amplificare: 95oC, 10min –Beads (GE Healthcare 27-9557-01). Amplificator iCycler (Biorad). Program de amplificare: 95oC, 10min –
1x; 95oC, 45 sec + 50oC, 45 sec + 72oC, 1,5 min – 45x; 72oC, 10 min – 1x; 4oC – 10 min. Martor pozitiv:1x; 95oC, 45 sec + 50oC, 45 sec + 72oC, 1,5 min – 45x; 72oC, 10 min – 1x; 4oC – 10 min. Martor pozitiv:
Ornithobacterium rhinotracheale (ADN, dilutie 10-2), DSMZ 15997. Martor negativ: apa ultrapura PCROrnithobacterium rhinotracheale (ADN, dilutie 10-2), DSMZ 15997. Martor negativ: apa ultrapura PCR
sterila (Promega, NFW).sterila (Promega, NFW).
Ornithobacterium rhinotrachealeOrnithobacterium rhinotracheale ––
ORTORT
Gel-electroforeza post - PCR 16S rRNA Ornithobacterium
rhinotracheale. Probele 8859, 8864, 8871 – liniile 3, 4. si 8 –
pozitive ORT (prezenta amplicon 197 bp).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
13
197 bp

10. rPCR pentru AMPV A, B, C, D. Curba
de amplificare si valorile Ct.
Programul logic MxPro care asista
ampificatorul spectrofotometric
Mx3005 (Stratagene).
Extracţie ARN: cu trusa QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen 52906). PCR APMV pentru gena G (AMPV-A, B, D) si gena SH (AMPV-C): amorse Guionie et al.Extracţie ARN: cu trusa QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen 52906). PCR APMV pentru gena G (AMPV-A, B, D) si gena SH (AMPV-C): amorse Guionie et al.
2007, Journal of Virological Methods 139: 150–158. Amplicon A – 116 bp, B – 135 bp, C – 82 bp, D – 63 bp. Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate2007, Journal of Virological Methods 139: 150–158. Amplicon A – 116 bp, B – 135 bp, C – 82 bp, D – 63 bp. Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate
comercial (Generi Biotech, Cehia): 12.5 pmol. Amestec de amplificare Brilliant Sybr Green qRT-PCR Master Mix with low Rox, 1 step, Agilent 600837.comercial (Generi Biotech, Cehia): 12.5 pmol. Amestec de amplificare Brilliant Sybr Green qRT-PCR Master Mix with low Rox, 1 step, Agilent 600837.
Amplificator spectrofotometric Mx3005P, Stratagene. Program de amplificare: 42oC, 30 min + 95oC, 10 min – 1x; 95oC, 15 sec + 60oC, 1 min – 45x; 60oC, 10Amplificator spectrofotometric Mx3005P, Stratagene. Program de amplificare: 42oC, 30 min + 95oC, 10 min – 1x; 95oC, 15 sec + 60oC, 1 min – 45x; 60oC, 10
min – 1x; 25oC, 1 min – 1x; anterior demararii curbei de disociere, din probele amplificate se fac controale prin gel-electroforeza pentru confirmarea reactiilor;min – 1x; 25oC, 1 min – 1x; anterior demararii curbei de disociere, din probele amplificate se fac controale prin gel-electroforeza pentru confirmarea reactiilor;
apoi, curba de disociere implicita a programului MxPro v01/2007 (95oC, 1 min, 55oC, 30 sec. si rampa la 95oC, cu date colectate in toate punctele acesteia).apoi, curba de disociere implicita a programului MxPro v01/2007 (95oC, 1 min, 55oC, 30 sec. si rampa la 95oC, cu date colectate in toate punctele acesteia).
Martor pozitiv: EPC APV A/B/C, dilutie 10-2, TaqVet AMPV kit (LSI, France). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).Martor pozitiv: EPC APV A/B/C, dilutie 10-2, TaqVet AMPV kit (LSI, France). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).
Metapneumovirusul aviarMetapneumovirusul aviar ––
ARTV / TRTV / SHSV / AMPVARTV / TRTV / SHSV / AMPV
Confirmarea prin gel-
electroforeza a rPCR
pentru detectia /
discriminarea AMPV A, B

11. Extractie ADN – Cu trusa QIAamp DNA Mini kit (Qiagen- 51304).Amorse: P1 (32280 – 257UT) si P2 (32282-207UT) – Ready to Go RAPD Analysis kit (GEExtractie ADN – Cu trusa QIAamp DNA Mini kit (Qiagen- 51304).Amorse: P1 (32280 – 257UT) si P2 (32282-207UT) – Ready to Go RAPD Analysis kit (GE
Healthcare 27-9502-01). Amestec de amplificare Ready to Go RAPD Analysis kit (GE Healthcare 27-9502-01).Volum reactie de amplificare: 25 ul. AmplificatorHealthcare 27-9502-01). Amestec de amplificare Ready to Go RAPD Analysis kit (GE Healthcare 27-9502-01).Volum reactie de amplificare: 25 ul. Amplificator
iCycler (BioRad). Program de amplificare: 94oC, 5min – 1x; 94oC, 44 sec + 35oC, 1 min + 72oC, 2 min – 44x, cu rampa de 50 sec de la 94oC la 35oC si rampaiCycler (BioRad). Program de amplificare: 94oC, 5min – 1x; 94oC, 44 sec + 35oC, 1 min + 72oC, 2 min – 44x, cu rampa de 50 sec de la 94oC la 35oC si rampa
de 130 sec de la 35oC la 72oC; 72oC, 10 min – 1x; 4oC – 10 min. Gel-electroforeza TBE1.5x. Achizitie si digitalizare imagine: Easy RH, Herolab GmbH; programde 130 sec de la 35oC la 72oC; 72oC, 10 min – 1x; 4oC – 10 min. Gel-electroforeza TBE1.5x. Achizitie si digitalizare imagine: Easy RH, Herolab GmbH; program
logic Image Win2PC. Prelucrare informatica imagine: UnScanIt (Silk Sci.Co). Prelucrare statistica: Bio1 v098 si Treecon v1.3b (coeficient Nei si Li cu analiza delogic Image Win2PC. Prelucrare informatica imagine: UnScanIt (Silk Sci.Co). Prelucrare statistica: Bio1 v098 si Treecon v1.3b (coeficient Nei si Li cu analiza de
cluster prin UPMGA, pentru estimarea distantei genetice dintre tulpini si a ierahizarii acestora). Martor pozitiv: E.coli C1a (GE Healthcare 32294). Martor negativ:cluster prin UPMGA, pentru estimarea distantei genetice dintre tulpini si a ierahizarii acestora). Martor pozitiv: E.coli C1a (GE Healthcare 32294). Martor negativ:
apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).
 subtipizarea moleculara a
organismelor vii, in conditii
bine definite
 diferentierea tulpinilor
apartinand aceluiasi serotip,
sau intre tulpini patogene si
vaccinale sau intre tulpini
apartinand aceluiasi tip fagic
 existenta unei clone
epidemice, in cazul unor
izolate cu origini diferite dar
cu amprente genetice
identice, stabilindu-se astfel
o relatie directa intre focarele
de boala asociate acestor
izolate microbiene
Escherichia coli de origine aviara -
patotip APEC. Gel-electroforeza post
RAPD cu amorsa P1.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Amprenta genetica “Random amplifiedAmprenta genetica “Random amplified
polymorphic DNApolymorphic DNA ““–– RAPDRAPD
E.coli 8657
E.coli 8654
E.coli 8656
E.coli 8655
E.coli 8658
0.10.20.3
Dendrograma E.coli de origine aviara (APEC).
RAPD – amorsa P1 (GE Healthcare). Teecon (Nei &
Li. Clustering. UPGMA).

12. RRezultatele testelor PCRezultatele testelor PCR
efectuate in perioadaefectuate in perioada
iianuarie – noiembrie 2012anuarie – noiembrie 2012
Qx
Mass
It02
Vv
Att
A B C D
1
+
+
3
+
6 +
10 +
17 + - - - - +
19 +
20 +
21 + + - + -
24 + -
27 + + + - - + + + + - -
33 + + - -
34 -
14 + +
25–29 - +
196 +
329 +
11 - 16 - + - + -
15 - + - + +
31 + + - - +
32 - - - - +
40 - 47 - + - - -
Adulte RRG
Curci
TRT
ORT
Pui carne
Tineret RRG
Categoria
zootehnica
Varsta
(zile)
Teste PCR
APEC
IBV
ILT
MG
MS
MDV
IBDV

13. ConcluzieConcluzie
Testele PCR s-au dovedit fiabile si adecvate in diagnosticul
bolilor la pasari, semnaland prezenta
 tulpinilor de virus bursitic, patotip foarte virulent,
 a tulpinilor de Mycoplasma synoviae si M.gallisepticum,
 a celor de virus Marek,
 a tulpinilor de metapneumovirus aviar, tipurile A, B si C,
 a celor de Ornithobacterium rhinotracheale si
 a unor clone epidemice de E.coli APEC
in efective de pasari crescute si exploatate industrial in
Romania in perioada ianuarie – noiembrie 2012

14. Multumiri colaboratorilor medici veterinari
si fermierilor care au contribuit la aceste
rezultate, atat material cat si financiar