1. Patologie da
difetti dell’imprinting
Patologie da
difetti dell’imprinting

2. Per epigenetica si intende qualsiasi attività di regolazione
dei geni tramite processi chimici che non comportano
cambiamenti nella sequenza del DNA ma possono indurre
fenotipi diversi nell’individuo o nella progenie
Queste modificazioni fanno si che diminuisca il grado di
accessibilità del DNA per i fattori di trascrizione alterando
l’attività di tale gene.
EPIGENETICA

3.  Avviene durante lo sviluppo e la proliferazione
cellulare, senza alterare la sequenza genica
sulla quale interviene.
 Ruolo importante dimostrato in:
 Biologia del cancro;
 Infezioni virali;
 Tecnologie transgeniche;
 Imprinting
ALTERAZIONE STABILE DELLAALTERAZIONE STABILE DELLA
POTENZIALE ESPRESSIONE GENICAPOTENZIALE ESPRESSIONE GENICA
……………………………………………… quando avviene ?quando avviene ?

4. CONTROLLO EPIGENETICO
DELL’ESPRESSIONE GENETICA
MANTENIMENTO DELL’ESPRESSIONE
DIFFERENZIALE DI GENI NEI DIVERSI TESSUTI
METILAZIONE DEL DNAMETILAZIONE DEL DNA
ACETILAZIONE DEGLI ISTONIACETILAZIONE DEGLI ISTONI

5. METILAZIONE.
 È uno degli eventi epigenetici più frequenti nel
genoma dei mammiferi.
 Modificazione chimica covalente EREDITABILE
ma REVERSIBILE.
 Consiste nell’aggiunta di un gruppo metile (-CH3) al
carbonio in 5’ dell’anello di una CITOSINA.
 Nei vertebrati la metilazione interessa
esclusivamente la CITOSINA

6. METILAZIONE.
 Il genoma umano non è
metilato uniformemente;
contiene regioni non
metilate interposte ad
altre metilate.
 La maggior parte della
metilazione in C avviene
nel contesto della
sequenze 5’-CG-3’ dette
“CpG island”.

7. La metilazione del DNA è un processo biochimico mediante il qualeLa metilazione del DNA è un processo biochimico mediante il quale
l’enzima DNA-metiltransferasi (DNMT) aggiunge un gruppol’enzima DNA-metiltransferasi (DNMT) aggiunge un gruppo
metilico alle citosine, (se seguite da una guanina)metilico alle citosine, (se seguite da una guanina) trasformandolatrasformandola
in 5-metilcitosinain 5-metilcitosina
H3C
N
N
ON
DNMTDNMT
METILAZIONE1 2
3
4
5
6
N
N
N O
citosina
5-metilcitosina

8. Gli enzimi che effettuano la metilazione del DNA sono DNA
metiltransferasi (DNMTs) che catalizzano il trasferimento di
un gruppo metilico da una S-adenosil-L-metionina alla citosina.
Nei mammiferi, la famiglia della DNMT comprende cinque
proteine:
 DNMT1
 DNMT2
 DNMT3A
 DNMT3B
 DNMT3L (DNMT3-like)

9. Le proteine che riconoscono le metilcitosine sono MBDMBD
(metil-CpG binding domain):
nei mammiferi, si tratta di
 MeCP2
 MBD1
 MBD2
 MBD3
 MBD4
MeCP2 è stata la prima di queste proteine ad essereMeCP2 è stata la prima di queste proteine ad essere
caratterizzatacaratterizzata

10. Meccanismi epigenetici alterati sono coinvolti nello sviluppo diMeccanismi epigenetici alterati sono coinvolti nello sviluppo di
molte malattie, compreso il cancro.molte malattie, compreso il cancro.
Il disturbo neurologico più studiato per quanto riguarda i cambiamentiIl disturbo neurologico più studiato per quanto riguarda i cambiamenti
epigenetici èepigenetici è
la sindrome di Rettla sindrome di Rett
i pazienti con la sindrome di Rett hanno difetti dello sviluppoi pazienti con la sindrome di Rett hanno difetti dello sviluppo
neurologico associati a mutazioni in MeCP2, che codifica per laneurologico associati a mutazioni in MeCP2, che codifica per la
proteina 2 legante metil-CpG, che si lega quindi al DNA metilatoproteina 2 legante metil-CpG, che si lega quindi al DNA metilato

11. Quali regioni sono bersaglio della metilazione?Quali regioni sono bersaglio della metilazione?
CpGCpG
islandsislands
••Piccole regioni IPERMETILATEPiccole regioni IPERMETILATE
del DNA di 0.5-5 kb ca.del DNA di 0.5-5 kb ca.
••Si ritrovano in media ogni 100 kb.Si ritrovano in media ogni 100 kb.
••Nell’uomo circa la metà dei geniNell’uomo circa la metà dei geni (geni house-keeping e geni con pattern
d’espressione tessuto-specifica) ha CpG islands.ha CpG islands.

12. Geni che vengono attivamente trascritti e tradotti
ad un livello relativamente elevato.
Generalmente, essi codificano per proteine ed
enzimi fondamentali per la vita della cellula,
e che pertanto devono essere sempre presenti.
Geni house-keepingGeni house-keeping

13. “CpG islands”
 L’aumento della
metilazione nella
regione promotore di
un gene porta ad una
ridotta espressione,
mentre la metilazione
nella regione
trascritta ha un
effetto variabile

14. Patterns di metilazione del DNA nella normalità e in patologia
Neuroni e glia normali
Alterazioni della metilaz DNA
in disordini neurologici
Ipermetilazione densa in
quelle regioni associate con
silenziamento trascrizionale
(A) FXN (coinvolto
nell’atassia di Friedreich)
(B) PADl2 (coinvolto
potentenzialmente nella
sclerosi multipla)
(C) S100A2 (coinvolto
potentenzialmente nella
malattia di Alzheimer)
(D) TNFα (coinvolto
potentenzialmente nella
malattia di Parkinson).

15. Molti disordini associati a ritardo mentale sono si associano
ad alterazioni di geni coinvolti nei meccanismi epigenetici:
- sindrome alfa talassemia/ritardo mentale X-linked (ATRX)
- sindrome di Rubinstein-Taybi
- sindrome di Coffin-Lowry
Alterazioni della metilazione del DNA e modificazioni dell’acetilazioneAlterazioni della metilazione del DNA e modificazioni dell’acetilazione
degli istoni, possono essere coinvolte nelle malattiedegli istoni, possono essere coinvolte nelle malattie
neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, morbo di Parkinsonneurodegenerative come il morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson
e la malattia di Huntington, e in altri disturbi neurologicie la malattia di Huntington, e in altri disturbi neurologici
come la sclerosi multipla, l'epilessia e la sclerosi laterale amiotrofica.come la sclerosi multipla, l'epilessia e la sclerosi laterale amiotrofica.

17. Cos’è l’imprinting?

18. IMPRINTING GENOMICOIMPRINTING GENOMICO
E’ un meccanismo epigenetico di regolazione trascrizionale attraverso
il quale alcuni geni vengono espressi o meno a seconda della loro originealcuni geni vengono espressi o meno a seconda della loro origine
parentaleparentale
L’esistenza dell’imprinting genomico suggerisce invece che
il genoma materno e quello paterno
non sono funzionalmente equivalentinon sono funzionalmente equivalenti,
ma hanno un ruolo supplementare e non sostituibile nel
determinare un corretto sviluppo embrionale

19. Modified by J Med Genet 29:853-857, 1992
In questo albero, la patologia è sempre trasmessa per via materna
e non in modo mendeliano
Imprinting paterno
Allele paterno silente

20. il carattere viene espresso quando ereditato dal padre
l’allele materno e’ silenteImprinting materno

21. Alcuni geni sottoposti ad
imprinting
 Chr1 (p73);
 Chr5 (U2AFBPL);
 Chr6 (MAS1; M6P/IGF2R..);
 Chr7 (GAMMA2-COP..);
 Chr11 (H19;IGF2;INS..);
 Chr13 (HTR2A);
 Chr14 (MEG3/GTL2);
 Chr15 (GABRA5;GABRB3;NDN;PAR1;PAR5;SNRPN;UBE3A)
 Chr18 (IMPACT);
 Chr19 (PEG3);
 Chr20 (GNAS1;NEURONATIN)
 ChrX (XIST)

22. Non e’ un cambiamento permanente del DNA
Deve essere abolito prima di trasmettere il genoma
Deve essere ripristinato coerentemente al sesso
dell’individuo che trasmette
Su questa nuova “etichettatura” agiscono i
meccanismi di regolazione genica secondo i pattern
previsti per cellule, tessuti.....
Come e quando?

23. L’imprinting deve essere
cancellabile nella linea
germinale per consentire la
determinazione del pattern
di imprinting del sesso
opposto
L’imprinting deve essere
mantenuto durante la
divisione delle cellule
somatiche
Determinazione e propagazioneDeterminazione e propagazione
dell’imprintingdell’imprinting

24. Imprinting e patologiaImprinting e patologia
• Perdita dell’allele non soggetto ad
imprinting: assenza di proteina
• Perdita dell’imprinting (LOI, loss of
imprinting): livello di proteina
raddoppiato rispetto al normale

25. Alcuni geni sottoposti ad
imprinting
 Chr1 (p73);
 Chr5 (U2AFBPL);
 Chr6 (MAS1; M6P/IGF2R..);
 Chr7 (GAMMA2-COP..);
 Chr11 (H19;IGF2;INS..);
 Chr13 (HTR2A);
 Chr14 (MEG3/GTL2);
 Chr15 (GABRA5;GABRB3;NDN;PAR1;PAR5;SNRPN;UBE3A)
 Chr18 (IMPACT);
 Chr19 (PEG3);
 Chr20 (GNAS1;NEURONATIN)
 ChrX (XIST)

27. Sindrome di Prader-WilliSindrome di Prader-Willi
Incidenza: 1/12.000-1/15.000

28. Sindrome di Prader-Willi:
Criteri Diagnostici Maggiori
Ipotonia centrale infantile con
suzione scarsa, tendente a migliorare
nel tempo
Difficoltà di alimentazione e scarso
accrescimento
Aumento eccessivo di peso dopo 1 a. e
prima di 6 a.
Anomalie facciali:
 costrizione bitemporale
 occhi a mandorla
 bocca piccola con labbro superiore
sottile e angoli rivolti in basso
Ipogonadismo
Ritardo mentale medio-moderato
Iperfagia/ossessione per il cibo
Anomalia cromosomica o molecolare
della regione 15q11-q13

29. del 15(q11-q13)
MAT PAT
Visibile con FISH (o con esame citogenetico ad alta risoluzione)

30. Sindrome di AngelmanSindrome di Angelman
Incidenza: 1/15.000-1/30.000

31. Sindrome di Angelman:
Caratteristiche Cliniche Costanti
Grave ritardo di sviluppo
psicomotorio
Assenza, completa o pressoché
completa, del linguaggio
Andatura atassica e/o movimenti
tremuli
Anomalie comportamentali:
 riso non motivato<<
 carattere ipereccitabile, con
tendenza ad agitare le mani
 deficit di attenzione
 atteggiamento apparentemente
felice
 iperattività motoria

32. Sindrome di Angelman:
Caratteristiche Cliniche Frequenti
(>80%)
Microcefalia prima dei 2 anni
Convulsioni in genere <3 anni
Pattern EEG anormale, con ampie
onde lente, la cui comparsa è
facilitata dalla chiusura degli
occhi

33. PERDITA DELL’IMPRINTING
1) Alterazioni di metilazione :eccesso o
riduzione
2) Presenza di 2 copie dello stesso allele
(DISOMIA UNIPARENTERALE)

34. Delezione 15q11-q13: 70%
Soggetto normale
AS PWS

35. La FISH con una sonda specifica del centromero del 15 ed una della
regione PWS/AS identifica una delezione eterozigote
(paterna in PWS e materna in AS)alla regione critica nel 70% dei casi
Nei rimanenti casi il cariotipo è, in genere, normale

36. PERDITA DELL’IMPRINTING
1) Alterazioni di metilazione :eccesso o
riduzione
2) Presenza di 2 copie dello stesso allele
(DISOMIA UNIPARENTERALE)

37. Delezione 15q11-q13: 70%
Pat UPD:2% Mat UPD:25%
Soggetto normale
AS PWS

39. 46 cromos
24 cromos22 cromos
22 cromat 22 cromat
24 cromat 24 cromat
Non disgiunz. alla MI

40. Uovo con nullisomia per il cromosoma 15
45 cromosomi:
monosomia 15
duplicaz. selettiva 15:
46 cromosomi con
UPD 15 paterno

41. Le sindromi di Angelmann e di Prader-WilliLe sindromi di Angelmann e di Prader-Willi
sono esempi di patologie dovute all’imprinting genomicosono esempi di patologie dovute all’imprinting genomico

42. 15 der(15) 22 der(22)
15 der(22) 22 22
AS
PWS PWS
The Lancet, 338:638 (1991)

43. La stessa traslocazione sbilanciata t(15;22)(q12;q11)
è associata a due fenotipi diversi
(sindrome di Angelman o sindrome di Prader-Willi)
a seconda che sia ereditata dalla madre anziché dal padre

44. IMPRINTING GENOMICO:
MECCANISMO MOLECOLARE
Metilazione genica, a livello delle sequenze CpG
→ blocco della trascrizione
I geni delle regioni soggette ad imprinting sono
particolarmente ricchi di isole CpG
cg cg cg cg cg ccggcgcg cg cg cg cg ccggcg
regione PWS nel cromosoma 15 paternoregione PWS nel cromosoma 15 paterno
cg cg cg cg cg ccggcg
CH3 CH3 CH3 CH3CH3CH3CH3
regione PWS nel cromosoma 15 maternoregione PWS nel cromosoma 15 materno

45. Struttura della regione
15q11
Cromosoma 15

46. crom. 15 paterno X
crom. 15 materno
1. Microdelezione regione PWS cromosoma 15 paterno: 70%
Evento sporadico, rischio di ricorrenza trascurabile
crom. 15 materno
crom. 15 materno
2. Disomia uniparentale materna o riarrangiamenti cromosoma 15: 25%
Correlata con età materna
Evento sporadico, rischio di ricorrenza trascurabile
Rischio di ricorrenza 50% se padre portatore di microdelezione IC
crom. 15 paterno
crom. 15 materno
3. Difetti del Centro dell’Imprinting cromosoma paterno: <5%

47. Alcuni casi di sindrome di Angelman sono
familiari!
Mutazioni puntiformi inattivanti (“loss of function”) del
gene UBE3A
UBE3A è contenuto nella regione AS ed è soggetto ad
imprinting paterno
Prodotto proteico: ubiquitin-ligasi → enzima che lega
proteine destinate alla degradazione all’ubiquitina
Forma autosomica dominante, con espressione dipendente
dal sesso del genitore trasmettitore
madre trasmettitrice → s. di Angelman se trasmesso allele
mutato
padre trasmettitore → nessuna conseguenza

48. wt pat. inatt.
mut. mat. inatt.
wt mat. att.
mut. pat. inatt.
wt mat. att.
wt pat. inatt.
wt mat. att.
mut. pat. inatt.
wt mat. att.
mut. pat. inatt.
wt mat. att.
mut. pat. inatt.
wt mat. att.
wt pat. inatt.
wt pat. inatt.
mut. mat. inatt.
wt mat. att.
mut. pat. inatt.
wt mat. att.
wt pat. inatt.
wt mat. att.
mut. pat. inatt.
wt mat. att.
wt pat. inatt.
wt mat. att.
wt pat. inatt.
wt pat. inatt.
mut. mat. inatt.

49. crom. 15 materno X
crom. 15 paterno
1. Microdelezione regione AS cromosoma 15 materno: 70%
UBE3A
crom. 15 paterno
crom. 15 paterno
2. Disomia uniparentale paterna cromosoma 15: 2-3%
UBE3A
UBE3A
crom. 15 materno
crom. 15 materno
3. Difetti Centro dell’Imprinting cromosoma 15 materno: 3-5%
UBE3A
UBE3A
crom. 15 materno
crom. 15 paterno
4. Mutazione puntiforme UBE3A cromosoma materno: 5-7%
UBE3A
UBE3A
5. Altri meccanismi (sconosciuti): 12-18%

50. La sindrome di Beckwith–Wiedemann
1: 14.500 nati vivi
La Sindrome di Beckwith-Wiedemann è una sindrome da
iperaccrescimento
Dimostrato il linkage con 11p15 e l’alterazione dell’imprinting
genomico di geni presenti in questa regione
La maggior parte dei casi sono sporadici ma una piccoloLa maggior parte dei casi sono sporadici ma una piccolo
numero sono familiari con trasmissione ADnumero sono familiari con trasmissione AD
Coinvolgimento della deregolazione dell’imprinting genomicoCoinvolgimento della deregolazione dell’imprinting genomico
nella regione 11p15nella regione 11p15
Presenta disordini clinici eterogeneiPresenta disordini clinici eterogenei

51. La sindrome di Beckwith–Wiedemann
caratteristiche cliniche
Macroglossia
Difetti della parete addominale
Visceromegalia(macrosomia)
Gigantismo natale e postatale
Anomalie alle orecchie (fossette, pieghe ecc)
Ipoglicemia neonatale
Citomegalia e cisti della corteccia surrenale
Nefromegalia e anomalie strutturali del rene
Emiperplasia (crescita asimmetrica di una o più regioni del corpo)
Dismorfismi facciali
Palatoschisi
Occipite prominente

52. Perdita di udito (conduttiva o neurosensoriale)
Tonsille e adenoidi di dimensioni notevoli
Scoliosi (dovuta all’asimmetria)
Tumore di Wilms
Epatoblastoma
Neuroblastoma
Nefroblastoma
Tumori delle ghiandole surrenali
Tumore del pancreas
La sindrome di Beckwith–Wiedemann

53. GENI “ IMPRINTED”-BWS
•Il cluster di geni “imprinted”nella regione 11p15 contiene almeno 12 geni
in due distinti domini regolati in cis da due imprinting centers (DMRs)

54. DOMINIO 1
Rosso: geni adRosso: geni ad
espressione maternaespressione materna
Blu: geni ad espressioneBlu: geni ad espressione
paternapaterna
H19 codifica un
trascritto polII non
tradotto
GF fetale–espressione paterna
Al 3’ del geneAl 3’ del gene H19H19 un set diun set di
enhancersenhancers
IGF2 e H19IGF2 e H19 competono percompetono per
tali enhancerstali enhancers
DMR1 (2 kb a monte diDMR1 (2 kb a monte di
H19H19):):
Regola l’espressione diRegola l’espressione di
IGF2IGF2 ee H19H19
causata dall’aumentato livellocausata dall’aumentato livello
d’espressione del gene IGF2d’espressione del gene IGF2
•Duplicazione del cromosoma paternoDuplicazione del cromosoma paterno
11p1511p15
•Disomia uniparentale paternaDisomia uniparentale paterna
•Alterazione della metilazioneAlterazione della metilazione
BWS

55. Dominio 2
6 geni imprinted :
CDKN1C,TSSC3, SLC22A1L,
KCNQ1,TSSC4,PHEMX
CDKN1CCDKN1C
•Espressione materna
•Regola negativamente la
proliferazione cellulare
•Mutazioni CDKN1C
causano BWS e sono
spesso associate con
l’eredita autosomica
dominante della sindrome
CDKN1CCDKN1C
•Espressione materna
•Regola negativamente la
proliferazione cellulare
•Mutazioni CDKN1C
causano BWS e sono
spesso associate con
l’eredita autosomica
dominante della sindrome
SLC22A1LSLC22A1L
•Espressione
materna
•Trasportatore di
cationi
•Mutazioni del gene
associata tumore al
seno
SLC22A1LSLC22A1L
•Espressione
materna
•Trasportatore di
cationi
•Mutazioni del gene
associata tumore al
seno
KCNQ1KCNQ1
•Espressione
materna
•6 traslocazoni note
sono associate con
la BWS
•L’introne 10
contiene un DMR2
KCNQ1KCNQ1
•Espressione
materna
•6 traslocazoni note
sono associate con
la BWS
•L’introne 10
contiene un DMR2
CH3
DMR2
PAT
MAT
KCNQ1OTIKCNQ1OTI: trascritto antisenso che
regola negativamente
l’espressione dei geni paterni

56. Alterazioni genetiche associate a BWS :Alterazioni genetiche associate a BWS :
1.1. DMR2 non metilato con conseguente perdita di imprintigDMR2 non metilato con conseguente perdita di imprintig
del KCNQ1OTI nel 50% dei casidel KCNQ1OTI nel 50% dei casi
2.2. Disomia uniparentale paterna dell’11p15 nel 10-20% dei casiDisomia uniparentale paterna dell’11p15 nel 10-20% dei casi
3.3. Perdita di imprintig del gene IGF2 sull’allele materno 25-50Perdita di imprintig del gene IGF2 sull’allele materno 25-50
% dei casi% dei casi