11._MICROPIPETAS. EQUIPOS E INSTRUMENTOS EN EL ARRA ÁREA DE BIOQUÍMICA
Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii
1. 3B-2
GUÍA DE PRÁCTICAS
UnIDAD ACADémICA: ESCUELA ACADEmICO PROFESIOnAL DE
OBSTETRICIA
nOmBRE DE LA ASIGnATURA BIOQUÍmICA Y nUTRICIÓn
nOmBRES Y APELLIDOS : JOSELInE RICCI CUELLAR
AUTOR : Q.F. JAVIER F. mARTInEZ CARRERAS
INTRODUCCIÓN
La Bioquímica, que crece a un ritmo extraordinariamente vigoroso, ejerce una influencia cada
vez mayor en las Ciencias de la vida. Actualmente se considera que la Bioquímica es el arma más
poderosa con que se cuenta para interpretar el fenómeno biológico, con una profunda incidencia en
numerosas áreas incluyendo la medicina y la nutrición humana.
La presente guía de práctica comprende la aplicación experimental de los conceptos
fundamentales, tanto básicos como de desarrollo de la capacidad crítica del estudiante más que en el
almacenamiento memorístico de datos que tampoco puede, sin embargo, descuidarse.
Cada Práctica de laboratorio incluye: Marco Teórico, Competencias, Materiales y Equipos,
Procedimiento, Cuestionario y Fuentes de información que se deben desarrollar cuidadosamente
durante la práctica. La guía de laboratorio debe ser revisada antes de iniciar la práctica.
INSTRUCCIONES GENERALES
El estudiante deberá estar en las prácticas en el horario programado, a la hora exacta y con mandil
blanco.
Todos los alumnos participarán activamente en el desarrollo de las prácticas.
Es necesario que el alumno antes de cualquier experimento posea los conocimientos básicos:
- Los objetivos de cada práctica.
- El material y equipo de laboratorio necesario para la realización de dicha practica.
- Los reactivos verificando su nombre, concentración, evitando contaminar los mismos.
- El método seleccionado que permitirá obtener resultados objetables
- Desarrollar su capacidad de observación y actitud crítica
El modelo para el informe de cada práctica debe seguir el siguiente esquema:
1.− Título de la práctica
2.− Nombre del(los) integrante(s), fecha de entrega
3.− Materiales y Procedimientos
4.- Cálculos y Resultados
5.− Conclusiones (de acuerdo a los objetivos y resultados de la práctica)
6.− Desarrollo del cuestionario
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2. 7.− Bibliografía
Práctica N° 1
“Reconocimiento de materiales y equipos de laboratorio bioquímica”
1.1 Marco teórico
Para realizar con éxito las practicas programadas para el curso, se requiere de diferentes
materiales de laboratorio como son pipetas, fiola, probeta y otros. Así mismo el uso de
equipos e instrumentos como potenciómetro, balanza, espectrofotómetro y otros. Estos
materiales y equipo tienen condiciones básicas para su uso como el estar calibrados, limpios
y que sea el material correcto según nuestras necesidades.
1.2 Competencias
• Demuestra y explica el uso correcto de los materiales y equipos de uso rutinario en un
laboratorio.
• Aprende el manejo correcto de los materiales y equipos de uso rutinario en un laboratorio.
1.3 Materiales y equipos
Materiales y equipos a usar en la práctica:
Tubos Beacker 100mL Refrigerante Alcohol 70° Centrífuga
13x100mm
Tubos Beacker 500mL Bagueta Anaranjado de Baño maría
10x75mm metilo
Tubos Matraz 50mL Pipeta pasteur Azul de metileno Potenciómetr
17x150mm o
Tubo de Matraz 500mL Pipeta 1mL 1/10 Agua destilada Balanza
centrífuga
Probeta Micropipeta Pipeta 1mL 1/100 Mecheros de ron Incubadora
100mL 10-100uL
Probeta Micropipeta Pipeta 2mL 1/10 Pinza para buretas Espectrofotó
1000mL 100-1000uL metro
Bureta 25mL Tips amarillos Pipeta 5mL 1/10 Mortero Mechero de
gas
Gradillas Tips azules Pipeta 10mL 1/10 Propipeta Pinzas para
tubos
Luna de Reloj Matraz Kitazato Pipeta 25mL 1/10 Adaptador Tripode
500mL venoject
Goteros Fiola 100mL Pipeta 5mL no Ligadura Embudo
terminal
Rejilla de Fiola 1000mL Pipeta 5mL volum Aguja venoject Soporte
asbesto 21Gx1” universal
1.4 Procedimiento
PIPETAS:
Son materiales graduados que se emplean para medir o trasvasar volúmenes de líquidos.
Primero deberá identificar si es una pipeta terminal (graduación llega a la punta) o no terminal
(graduación finaliza antes de la punta). Luego identificar el volumen que puede medir con la
pipeta (capacidad de la pipeta).
Modo de uso: Introduzca la pipeta en el líquido sin tocar el fondo del recipiente, aspirar
con la ayuda de una propipeta succionando suavemente hasta el volumen que requiere, tapar
la pipeta CON EL DEDO INDICE, si se sobrepaso el volumen relaje lentamente su dedo y deje
salir el líquido hasta que logre enrazar el líquido (nivel deseado).
El profesor le enseñará el correcto uso de las pipetas.
MICROPIPETAS:
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3. Son pipetas muy especiales que se emplean para medir volúmenes muy pequeños en el rango
de los microlitros (uL), pueden medir un volumen fijo o medir diferentes volúmenes
(regulables) se emplean con un aditamento en la punta llamado TIP o puntera, que es
específico según la capacidad de la micropipeta.
Modo de uso: Coloque el tip correspondiente, ajústelo, regule el volumen a medir girando el
mando del émbolo, coloque el pulgar atravesado sobre el mando de la micropipeta, presione
suavemente e introduzca el tip al líquido a medir, suelte suavemente el émbolo y observe que
el líquido llene el tip, para depositar el contenido presione el émbolo completamente y el
líquido será expulsado del tip. Para eliminar el tip usado presione el mando expulsor.
RECUERDE QUE CUANDO SE EMPLEA CUALQUIER MUESTRA BIOLOGICA EL TIP DEBE SER
ELIMINADO DENTRO DE UN DESINFECTANTE COMO LA LEJIA O SIMILAR.
El profesor le enseñará el correcto uso de las micropipetas y demás materiales y equipos de
laboratorio.
1.5 Cuestionario
1. Los materiales de vidrio son elaborados en vidrio de Borosilicato, describa las
características de este material.
2. Describa los equipos que debe emplear para preparar soluciones.
3. El lavado es una parte importante del trabajo en el laboratorio, describa la forma correcta
para el lavado de materiales de vidrio.
4. Describa cada uno de los materiales mostrados durante la práctica y explique su uso.
1.6 Fuentes de información
1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y
nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima
2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed.
Reverté. Barcelona
3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona
(España)
4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill
Interamericana. Madrid
5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004
lima
6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición.
2006. Barcelona (España)
7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales.
Monografía.2003. Perú.
8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México
9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.
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4. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú
11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003.
Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España.
12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid
13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005
Ed. Manual Moderno. México
14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España
Práctica N° 2
“Determinación del pH, Amortiguadores”
2.1 Marco teórico
El concepto de pH fue dado a conocer por primera vez en 1909 por SORENSEN, y lo definió
como el logaritmo negativo de la concentración de iones de hidrógeno es decir:
pH = - log (H) ó = [H + ] = 10 – pH ó = - log ( 1 )
H
Donde la concentración del hidrogenión es dada en unidades moles.
La determinación del pH es uno de los procedimientos analíticos más importantes y más
utilizados en bioquímica puesto que esta medida determina características notables de la
estructura y la actividad de las macromoléculas biológicas, por consiguiente, la conducta de
las células y de los organismos.
CALCULO DEL PH DE UNA SOLUCION:
Procedimiento .-
Consiste en calcular la concentración de iones hidrógeno [H+]
Calcular el logaritmo de base 10 de [H+]
El pH es el logaritmo negativo que ha sido encontrado en (1)
Ejemplo:
El agua pura (25ºC), de concentración 1 x 10 –7 M tiene como pH: PH =
- log ( 1 x 10 – 7 ) PH = - ( - 7 ) PH = 7
El agua es un conductor eléctrico cuando se encuentra pura, debido a su propiedad
disociativa, pero en pequeño grado.
H2O + H2O H3O+ + HO– (1)
A 25ºC existe 1 molécula de H3O + y una molécula de HO– por cada 5.55x108 moléculas de agua
El número de agua por litro sería:
1000 g/L = 55.5 moles/L (2)
8 g/mol
55.5 x 108 moles de agua hacen 107g /L, existiendo solo un gramo de H3O+; es decir, 10–7 g/L, y
un gramo de OH– ó 10 – 7 g/L.
De la fórmula (1) se deduce que la constante de ionización del agua (Kw) es:
Kw = [H3O+] [HO-] = [H3O+] [ OH - ]
2 2
[H2O] (55.5)
De lo que:
[H3O+] [OH-] = K(55.5)2 = Kw
Por lo que:
Kw = 10 – 7 x 10– 7 = 10 – 14
Por lo tanto:
Log Kw = log [H3O+] + log [OH-]
-Log KW = -log [ H3O+] + - log [OH-]
- p Kw = p[H3O+] + p[HO-]
-p Kw = pH + pOH
Soluciones Buffer, tampón o amortiguadores :
Son aquellas soluciones que se caracterizan por ser mezclas de ACIDOS y BASES DEBILES y
sus sales, las cuales impiden las variaciones bruscas de pH; permitiendo que el cambio de
este no sea el más mínimo.
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5. APLICACIONES :
En organismos vivientes, por ejemplo:
Para conocer las alteraciones producidas en la composición química de la sangre.
Para conocer las alteraciones del pH de otros líquidos biológicos: saliva, lagrimas, sudor,
líquido cefalorraquídeo, etc.
En ciertos fenómenos fisiológicos: respiración, aplicación de enzimas (catalizadores), etc.
En química:
Para determinar el pH de una solución.
Para determinar el punto final de una titulación
Demostración : reacciones químicas con liberación o consumo de iones H +.
Otros
2.2 Competencias
• Aplica los conceptos fundamentales sobre el pH y la acción de los sistemas buffer.
• Utiliza las técnicas para medir el pH.
2.3 Materiales y equipos
Materiales y equipos a usar en la práctica:
Potenciómetro Anaranjado de Bureta 25mL Estandar de pH Pipeta 1mL
metilo 10
Beacker 100mL Papel de tornasol Soporte Ac. Acético Pipeta 2mL
azul universal 0,1N
Matraz 100mL Papel de tornasol Pinza para Acetato sodio Pipeta 5mL
rosado bureta 0,1N
Estandar de pH Indicador de pH 1-14 Tubos Agua destilada Pipeta 10mL
4 13x100mL
Estandar de pH Gradillas Vaso Fenolftaleina HCl 0,1N
7 descartable
METODOS DE DETERMINACION DEL pH:
Existen varios procedimientos:
Mediante indicadores
Mediante cintas o papel de pH universal
Mediante el potenciómetro o pHmetro
DETERMINACION DEL pH MEDIANTE EL USO DE INDICADORES:
Indicadores.-Son soluciones o cuerpos químicos que se agregan a los líquidos para dosar, con
el fin de ver el momento preciso del término de la reacción; manifestándose por la aparición,
desaparición o modificación del color. Estas sustancias químicas pertenecen al grupo de los
ácidos y bases débiles. Según Glaser, se clasifican en tres grupos:
1ero: Para valorar bases débiles con ácidos fuertes. Ejem: anaranjado de metilo, rojo de
congo, etc.
2do: Para valorar bases y ácidos fuertes. Ejem : Tornasol, paranitrofenol, etc.
3ero: Para valorar ácidos débiles con bases fuertes. Ejem: fenolftaleina, etc.
Aplicación :
1) En determinar el pH de una solución deseada.
2) En determinar el punto final de una titulación (volumétrica)
3) En determinar reacciones químicas con liberación o consumo de H
Comprende:
Elección de un indicador para una titulación, para lo que se debe tener en cuenta
conceptos básicos sobre disociación de sales, la que está sujeta a una constante (pK) y a una
variación de colores dependiente a su mayor o menor disociación de pK; el pK se emplea y se
define como el log (1/Ka) ó el –log Ka para definir la fuerza de un ácido o de una base.
Un ácido cuya constante de ionización sea 10 –4 tiene un pKa de 4. De igual forma pKb es – log
Kb, para cualquier constante de equilibrio Kb. (Ka constante de ionización de un ácido; Kb,
constante de ionización de una base).
Continuando :
a) Disociación de una sal formada a partir de un ácido fuerte y una base débil:
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6. NH4Cl NH4+ + Cl-
H2O OH - + H+
NH 4Cl + H2O NH 4 OH + HCl
La mayor tendencia de ionización del HCl frente a la del NH4OH lo hace una solución ACIDA.
b) Disociación de una sal formada a partir de un ácido débil y una base fuerte.
Ejemplo : Citaremos la titulación del CH3 – COOH con NaOH
CH 3 – COONa CH 3–COO - + Na +
H2O OH - + H +
CH3–COOH + NaOH
CH3COOH presenta menor tendencia a ionizarse que el NaOH siendo ésta una solución
ALCALINA.
c) Disociación de una sal formada a partir de un ácido y una base fuertes. Citaremos la
titulación del HCl con NaOH.
NaCl Na+ + Cl –
H2O OH - + H+
NaOH
+ HCl
La solución es NEUTRA ya que NaOH como el HCl tienen igual tendencia a ionizarse
Determinación del pH mediante el uso del papel indicador :
El papel Indicador:
Es un papel especial que contiene absorbidos indicadores en serie o a lo largo, que al ponerse
en contacto con la solución a evaluar da un color que corresponde al pH aproximado de la
solución problema. En el comercio existen diferentes tipos de papeles indicadores, por
ejemplo: el papel indicador universal (pH de 1 a 10); PH – YDRIEN papel (pH del 10 a 14)
Podemos observar la siguiente tabla de indicadores:
TABLA DE INDICADORES :
INDICADOR Pk LIMITES COLOR
Azul de timol 1.50 0.5 – 2.8 rojo – amarillo
Azul de bromofenol 3.98 3.0 – 5.0 amarillo – azul
Verde de bromofenol 4.68 3.7 – 5.7 amarillo - azul
Anaranjado de metilo 4.00 3.5 – 4.5 anaranjado–amarillo
Rojo de clorofenol 5.98 5.0 – 7.0 amarillo - rojo
Púrpura de bromocresol 6.30 5.3 – 7.3 amarillo - púrpura
Azul de bromotimol 7.00 6.0 – 8.0 amarillo - azul
Rojo de fenol 7.90 6.9 – 8.9 amarillo - rojo
Fenolftaleína 9.20 8.2 – 10.2 incoloro - rojo
Rojo de metilo 5.10 4.4 - 6.0 rojo - amarillo
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7. DETERMINACIÓN DE pH MEDIANTE EL POTENCIÓMETRO O pHMETRO:
Fundamento.-
Se fundamenta en la generación de una diferencia de potencial que se establece cuando se
emplean dos soluciones ioniozadas de diferente concentración en las cuales se hace pasar
una corriente eléctrica, es decir la diferencia de potencial es proporcional a la diferencia de
concentración(es) entre las soluciones.
Partes que lo constituyen.-
1.-Electrodo de vidrio: Es un pequeño bulbo de vidrio soldado a un vástago de vidrio de
borosilicato (pirex) dentro de él existe una solución de KCl 0.1N en la que está sumergido un
electrodo de referencia interna que puede ser de plata cloruro de plata o de Calomell,
quedando aislada dicha celda mediante un cierre hermético constituido por un dieléctrico de
cera o plástico y un casco de metal o plástico.
2.-Un electrodo de referencia externa de Calomell
3.-Un tablero de control con diales que regulan el funcionamiento del equipo.
PARTE OPERATIVA:
La calibración consiste en darle información al equipo mediante el uso de estándares de pH, o
sea soluciones cuyo pH es conocido y certificado.
Pasos previos: Verificar la instalación correcta del equipo, su conexión con la corriente
general. Calibrar la temperatura ambiente con la del equipo, lavando repetidas veces con agua
destilada y secando los electrodos con papel filtro.
Retirar cuidadosamente el jebe de seguridad del electrodo de vidrio.
La aplicación se realiza luego, enjuagando los electrodos con agua destilada, secándolos con
papel absorbente y sumergiéndolos en la solución problema, obteniéndose su pH que se leerá
en el lector en una escala de 0 a 14.
Actualmente se usan pHmetros portátiles, que funcionan con baterías o con una corriente
alterna de 100 a 200 voltios, digitales, otros.
2.4 Procedimiento
1. Determinación del pH:
El alumno deberá medir el pH de las diferentes muestras solicitadas por el profesor (leche,
gaseosas, yogurt, saliva, orina, otras) empleando los métodos descritos en la práctica.
2. Titulación Acido-Base:
2.1.-Titular una base (NaOH 0.1N) con un ácido:
Colocar en un Beacker 10 mL de NaOH (hidróxido de sodio) 0.1N y tres gotas de fenolftaleína
Enrazar una bureta de 25mL con H2SO4 (ácido sulfúrico) 0.1N
Comience a titular dejando caer gota a gota el H2SO4 0,1N sobre NaOH 0,1N, agitando
constantemente hasta que cambie el color.
Anotar la cantidad (mL) de H2SO4 0,1N que se gastó en la titulación (gasto)
2.2.-Titular un ácido (H2SO4 0,1 N) con una base:
Colocar en un Beacker 10mL de H2SO4 0,1N y tres gotas de anaranjado de metilo.
Enrazar una bureta de 25mL con NaOH 0,1N.
Comience a titular dejando caer gota a gota el NaOH 0,1N sobre el H2SO4 0,1N, agitando
constantemente hasta que cambie el color.
Anotar la cantidad (mL) de NaOH 0,1N que se gastó en la titulación (gasto)
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8. 3. Cambios de pH en un sistema Buffer:
3.1. El agua como buffer
Colocar en un beaker, 10 mL de agua destilada y tres gotas de anaranjado de metilo.
Enrasar una bureta de 25mL con HCl 0,1N.
Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0,1N, agitando constantemente hasta que
cambie el color.
Anotar la cantidad (mL) de HCl 0,1N que se el gastó en la titulación.
3.2. Un ácido débil y su respectiva sal en diferentes proporciones:
Colocar en un beaker 8 mL de agua destilada, 1,5 mL de ácido acético 0.1N, 0,5mL de acetato
de sodio 0.1N y tres gotas de anaranjado de metilo.
Enrazar una bureta de 25mL con HCl 0.1N.
Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0.1N, agitando constantemente hasta que
cambie el color.
Anotar la cantidad (mL) de HCl 0.1N que se gastó en la titulación.
3.3. Un ácido débil y su respectiva sal en iguales proporciones:
Colocar en un beaker 8 mL de agua destilada, 1,0mL de ácido acético 0.1N, 1,0mL de acetato
de sodio 0.1N y tres gotas de anaranjado de metilo.
Enrazar una bureta de 25mL con HCl 0.1N.
Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0.1N, agitando constantemente hasta que
cambie el color.
Anotar la cantidad (mL) de HCl 0.1N que se gastó en la titulación.
2.5 Cuestionario
1.-Mencione el pH normal de: Sangre, orina, líquido seminal, líquido cefalorraquídeo, líquido
amniótico, saliva y su correlación con alguna patología.
2.-Principales sistemas buffer orgánicos.
2.6 Fuentes de información
1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y
nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima
2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed.
Reverté. Barcelona
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9. 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona
(España)
4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill
Interamericana. Madrid
5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004
lima
6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición.
2006. Barcelona (España)
7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales.
Monografía.2003. Perú.
8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México
9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.
10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú
11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003.
Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España.
12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid
13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005
Ed. Manual Moderno. México
14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España
nOTA: EL ALUmnO DEBERÁ ASISTIR A LA PRÁCTICA COn
mUESTRAS DE LEChE, YOGURT, GASEOSA, FRUTAS, JUGO DE
FRUTAS.
Practica N° 3
“Identificación de los carbohidratos“
“Determinación de glicemia y glucosuria“
3.1 Marco teórico
Los carbohidratos son los principales constituyentes de nuestra dieta, llegando a presentarse
en un 50-60% de la misma. Así mismo, son la principal fuente de energía del humano, siendo los
almidones los más abundantes.
Entre los monosacáridos de mayor importancia se tiene a la glucosa, la manosa, la galactosa
(aldohexosas), la ribosa (aldopentosa) y la fructuosa (cetohexosa), entre los disacáridos
tenemos a la maltosa (Glu-Glu), la sacarosa (Fru-Glu) y la lactosa (Gal-Glu), y entre los
polisacáridos el almidón vegetal, al almidón animal (glucógeno) y la celulosa..
Los azúcares, hidratos de carbono o carbohidratos son los compuestos más abundantes en la
naturaleza y en nuestra dieta, en su mayoría del tipo aldohexosas y cetohexosas. Los
carbohidratos se ingieren en la dieta como almidones (polisacárido), sacarosa y lactosa
(disacáridos) y en menor proporción en como glucosa, galactosa y fructosa (monosacáridos).
El producto principal de la digestión de los polisacáridos es la glucosa (monosacárido) la cual
es absorbida ya sangre donde se mantiene en ayunas entre 70 a 110 mg/dL, lo que se conoce
como los niveles de Glicemia. Para su dosaje existen diferentes métodos como el de la
glucosa oxidasa, el método de la orto-tolouidina (en desuso por ser cancerígeno) y el de
Somogy – Nelson.
Las necesidades de glucosa son cubiertas inicialmente por el glucógeno o almidón animal
que es la reserva de glucosa de la que se echa mano a través de la glucogenólisis. Esta vía es
regulada por dos hormonas: el glucagon para el glucógeno hepático y la adrenalina para el
hepático y muscular.
Cuando el requerimiento de glucosa es grande y los depósitos están vacíos, se puede formar
glucosa a partir de intermediarios anfibólicos (como el lactato, los aminoácidos, el glicerol, los
ácidos grasos y los cuerpos cetónicos), mediante la gluconeogenesis, que se lleva a cabo en
las células hepáticas, adiposas y musculares.
De esta manera se mantienen los niveles sanguíneos de glucosa que son necesarios para las
células, especialmente para las células cerebrales, que no tienen posibilidad de reserva y
están a merced de la glucosa circulante.
En el aspecto hormonal, la glucosa sanguínea está regulada principalmente por dos hormonas
secretadas por el páncreas endocrino:
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10. La Insulina:
Es una hormona formada por 51 aminoácidos dispuestos en dos cadenas. La insulina se
forma a partir de la proinsulina, que está constituida por una sola cadena polipetídica que se
sintetiza en las células β de los islotes pancreáticos de Langerhans. La insulina es el factor
más importante de los que intervienen en la regulación de los niveles de glucosa
sanguínea, que deben mantenerse dentro de unos límites rigurosos. Cuando la glucosa está
elevada en la sangre el nivel de insulina se incrementa del mismo modo.
El Glucagon:
Es una hormona formada por una cadena polipeptídica compuesta por 29 aminoácidos; es
sintetizada por las células α de los islotes pancreáticos de Langerhans y se incrementa en la
sangre al disminuir la glucosa, estimulando la glucogenólisis hepática.
Alteraciones del Metabolismo de los Carbohidratos:
Para los efectos del establecimiento del diagnóstico en el trastorno o alteraciones del
metabolismo de carbohidratos se han considerado dos situaciones clínicas bien definidas:
Hiperglucemia:
Es el estado biológico donde los niveles de glucosa sanguínea están por encima de los
valores considerados normales: La hiperglucemia fisiológica en situaciones de excitación
síquica, esfuerzos musculares, por exposición a baños calientes y a veces en el periodo
menstrual, y la hiperglucemia patológica más común es la Diabetes mellitus que es un
síndrome caracterizado por un aumento de los niveles de la glucosa en estado postprandial y
ayuno, que conlleva a características de laboratorio como:
Aumento de la glucosa en ayunas por encima de 7.8 mmol/L (140 mg/dl).
Aumento exagerado de la glucosa a cualquier hora del día, por encima de 200mg/dl
Aparición de glucosa en orina (glucosuria) cuando esta pasa de 180 mg/dL en sangre (umbral
renal de filtración para la glucosa).
El aumento de glucosa en orina produce un aumento en la osmolaridad y en la secreción de
agua en orina, con aumento de la excreción de orina (poliurea).
El aumento de glucosa sérica produce igualmente un aumento de la osmolaridad sanguínea, y
un aumento de agua intravascular por dos mecanismos: por una parte, se produce una sed
intensa que obliga a beber una cantidad (polidipsia) y, por otra parte, existe un trasvase del
agua interior de la célula al exterior, que lleva a una hemodilución de los elementos formes.
Aunque existe una gran cantidad de glucosa en la sangre esta no es capaz de ingresar a la
célula y producir energía debido a la falta de insulina, produciéndose sensación de hambre y
el enfermo come mucho (polifagia), pero a pesar de ello disminuye su peso corporal, ya que se
utilizan las reservas, activándose la gluconeogénesis, con una gran formación de cuerpos
cetónicos,
que dan lugar a un estado de acidosis metabólica y de halitosis (aliento a manzanas).
La Diabetes se acompaña de pérdida de proteína muscular y cetosis al aumentar el
catabolismo de proteínas, el músculo libera mayor cantidad de alanina proporcionando
substrato para la gluconeogénesis, promoviendo la hiperglucemia debido a la mayor
disponibilidad de substrato, la gluconeogénesis puede contribuir con más del 30% de la
producción de la glucosa hepática; la mayor utilización de aminoácidos produce la pérdida de
proteína.
Con el tiempo y con hiperglicemias constantes, se producen trastornos vasculares que afectan
a vasos pequeños, como los de la retina, el riñón y los capilares de la circulación general, con
lo que el enfermo puede acabar con problemas de ceguera, insuficiencia renal y gangrena en
zonas periféricas.
El diagnóstico precoz y un buen control de la enfermedad, encaminado a mantener los niveles
de glucosa dentro de unos niveles adecuados, son condiciones necesarias para que el
enfermo con diabetes mellitus pueda tener una buena calidad de vida y no sea esta
enfermedad la que le produzca la muerte.
Hipoglucemia:
Hablamos de hipoglucemia cuando los niveles de glucosa en sangre se sitúan en 2.2 y 2.5
mmol/l (40-45 mg/dL). La hipoglucemia se puede presentar por un ayuno prolongado, ejercicio
intenso o a un exceso de insulina, como ocurre en la hiperplasia de las células de los islotes
pancreáticos (insulinomas), o pueden ser del tipo reactivas producidas por la administración
exagerada de insulina exógena o por tratamiento con hipoglucemiantes orales en el caso de
enfermos diabéticos.
3.2 Competencias
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11. • Determina cualitativamente la presencia de carbohidratos en muestras de alimentos.
• Diferencia entre almidones, monosacáridos y azúcares reductores presentes en los
alimentos.
• Determina la glucosa en sangre por el método enzimático de glucosa oxidasa.
• Determina cualitativamente la glucosa en orina por el método de Benedict.
3.3 Materiales y equipos
Tubos 17x150mm Bagueta Pipeta 1mL Rvo. Benedict
Luna de reloj Alcohol Pipeta 5mL Rvo. Glicemia enzimático
Mechero de ron Mortero Goteros Estd Glucosa 100mg/dL
Pinza para tubos Agua destilada Rvo. Lugol Micropipeta 10-100uL
Tubo 13x100mm Pipeta 1mL Algodón Rvo. orcinol
Gradilla Pipeta 2mL Ligadura Rvo. Selivanoff
Espectrofotómetro Pipeta 5mL Tips amarillos Alcohol amilico
Baño maría Centrífuga Micropipeta 10-100uL
Portacubetas Aguja venoject 21Gx 1” Glucosa
Método enzimático de la Glucosa Oxidasa.
Fundamento:
Se basa en la oxidación de la glucosa por la enzima glucosa oxidasa, reacción en la que se
consume oxígeno (O2) y se genera agua oxigenada (H2O2).
Con esta reacción como principio, la glucosa se puede cuantificar por varios métodos:
Reacción de la Glucosa Oxidasa:
Glucosa + O2 GOD Acido Glucónico + H2O2
(suero)
H2O2 + Cromógeno POD Compuesto coloreado+ H2O
(505nm)
GOD: Glucosa Oxidasa
POD: Peroxidasa
Para la determinación de glucosa en orina por el método de BENEDICT
Fundamento.-
Este método se basa en que la glucosa tiene la capacidad de reducir los iones cúpricos (Cu +2)
a iones cuproso (Cu+).Por calentamiento los iones cuprosos forman oxido cuproso (Cu2O),
este método detecta los azúcares reductores totales en orina.
3.4 Procedimiento
1.- Identificación de los carbohidratos
Reacción de Benedict
Reacción de Molisch para Reacción de Lugol para
para determinar la
determinar la presencia de determinar la presencia de
presencia de Carbohidratos
Monosacáridos
C Almidones
reductores
Muestra Muestra Muestra
Agregar 2
Agregar por las Agregar 2 Calentar al mechero Agregar 2–
gotas de
mL de Rvo. 3 gotas de
Rvo. paredes por 1-2 min. Tenga
lentamente 3mL de Benedict Rvo. Lugol
Molisch cuidado
de H2SO4
(+) Formación de anillo (+) Cambio de color al azul (+) Cambio de color al
verdoso, castaño, amarillo, azul intenso o negro
color VIOLETA
marrón o rojo ladrillo
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12. Reacción de Bial. Para las Pentosas.
a. En un tubo de prueba se coloca 5 ml. De Reactivo de orcinol, se
calienta hasta ebullición y en este momento se adiciona gota a gota 1mL de
solución problema.
b. La aparición de un color verde oliva , soluble en alcohol amilico, indica
presencia de pentosa.
Reacción de Selivanoff.
a. En un tubo de prueba se coloca 3 ml de solución clorhídrica de
resorcinol y 6 ml de Muestra problema.
b. Luego se coloca en Baño de María hirviente por unos minutos.
c. El desarrollo inmediato de una coloración anaranjado rojiza indica
presencia de pentosas.
2.- Determinación de glicemia
Tomar una muestra de sangre (aprox. 3 mL), centrifugar a 3,000 rpm por 10 minutos. Separar el
suero.
Determinación de glucosa sanguínea:
Colocar en tres tubos de ensayo de acuerdo al siguiente esquema:
REACTIVO / TUBO BLANCO ESTANDARD MUESTRA
Estándar Glucosa(100mg/dL) -- 20 ul --
Muestra (suero) -- -- 20 ul
Reactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml
Mezclar e incubar en baño María a 37º C por 10 minutos.
Leer a 505nm, llevando a cero el aparato con el blanco de reactivo.
CALCULO DE LOS RESULTADOS:
Glucosa (g/L) = D (Abs M) x f f = 1,00 g/L
Abs. Std
VALORES DE REFERENCIA: Suero o plasma: 0.70 – 1.10 g/L
Sangre total: 0.60 – 1.00 g/L
LCR: 0.40 – 0.74 g/L
3.- Determinación de glucosuria
Determinación de glucosa en orina por el método de BENEDICT:
Colocar en un tubo de ensayo 8 gotas de orina patológica y en otro tubo 8 gotas de orina de
su compañero (no patológica), agregar a ambos tubos 2mL. del reactivo de Benedict, llevar a
hervir durante 3 minutos, enfriar e interpretar los resultados.
INTERPRETACION:
Color Interpretación
Azul negativo
Azul verdoso vestigios
Verde positivo +
Verde parduzco positivo ++
Amarillo positivo +++
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13. Rojo ladrillo positivo ++++
Normalmente en la orina no hay azucares, su presencia nos indica que hay glucosuria, que
generalmente está en relación con el incremento de la glucosa en sangre sin embargo, hay
algunas situaciones fisiológicas en la que esta presencia puede ser positiva pero por la
presencia de otros glúcidos como la lactosa en la mujer gestante o en la que está dando de
lactar sin que sea patológica.
3.5 Cuestionario
1.- Fundamento de la reacción de Molisch, Benedict y Lugol.
2.- Cuales son los azúcares característicos de cada una de las muestra empledas.
3.- Por qué la diferencia de reacción entre el azúcar blanca y rubia.
4.- Que es un “azúcar invertido” y su utilidad.
5.- Según la última clasificación de la OMS, cuantos tipos de diabetes existen.
6.- Como se produce la insulina recombinante.
3.6 Fuentes de información
1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y
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14. nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima
2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed.
Reverté. Barcelona
3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona
(España)
4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill
Interamericana. Madrid
5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004
lima
6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición.
2006. Barcelona (España)
7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales.
Monografía.2003. Perú.
8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México
9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.
10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú
11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003.
Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España.
12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid
13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005
Ed. Manual Moderno. México
14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España
NOTA: El alumno deberá asistir a la práctica con muestras de leche, yogurt, queso, gaseosa,
cerveza, azúcar rubia, azúcar blanca, huevo, galleta, pan, frutas.
Practica N° 4
Seminario N° 1: “Aspectos bioquímicos de la Diabetes Mellitus y la Diabetes Gestacional”.
Temas que se deben considerar en el seminario:
1.- Generalidades. Conceptos. Etiopatogenia
2.- Tipos de Diabetes. Factores predisponentes
3.- Insulina. Síntesis. Función. Deficiencia
4.- Complicaciones en el embarazo
Seminario Nº2: “ Mecanismo Hormonales de Regulación Metabólica”
Temas que se deben considerar en el seminario:
1.- Generalidades. Conceptos. Características generales de las hormonas.
2.- Clasificación de las hormonas
3.- Sistema de la adenilato ciclasa y la proteína quinasa A.
4.- Sistema de la fosfolipasa, inositol y Ca++.
5.- Receptores intracelulares
Seminario N° 3: “Rol bioquímico y fisiológico del surfactante pulmonar en la maduración fetal
y el de las prostaglandinas en el proceso de parto”.
Temas que se deben considerar en el seminario:
1.- Generalidades. Significado fisiológico. Composición química.
2.- Índices de madurez pulmonar
3.- Estructura y desarrollo del alveolo pulmonar
4.- Biosíntesis. Etapa embrionaria. Etapa pseudoglandular. Fase canalicular. Fase de saco
terminal
5.- Aceleración de la madurez pulmonar fetal
Importancia de la utilización de corticoides en la vida fetal
Rol de los corticoides en el desarrollo prenatal
6.- Efectos adversos de la corticoterapia antenatal. Riesgos fetales y maternos
7.- Enfermedades por insuficiencia del surfactante pulmonar:
Atelectasias. Membrana hialina. Embolia pulmonar. Síndrome distress respiratorio
8.- PROSTAGLANDINAS. Síntesis. Metabolismo .
Actividad farmacológica de las prostaglandinas. Accion de la prostaglandina en el proceso de
parto
Seminario N° 4: Hormonas en Embarazo y lactancia.
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15. Temas que se deben considerar en el seminario:
1.- Funciones
2.- Clasificación
3.- Metabolismo
4.- Regulación hormonal
Practica N° 5
“Identificación y características de los lípidos“
5.1 Marco teórico
Los lípidos son macromoléculas orgánicas que se encuentran en el organismo formando parte
estructural de la membrana celular, el tejido adiposo y otras formas moleculares funcionales;
así mismo, constituyen una rica fuente de reserva energética de nuestro organismo.
Los lípidos se caracterizan por ser insolubles en agua, pero solubles en solvente orgánicos no
polares como eter, acetona, cloroformo, benceno, etc. Quimicamente están constituidos por
unidades denominadas ácidos grasos, unidos covalentemente a moléculas de alcohol.
Los podemos clasificar en Lípidos simples (ésteres de ac.graso y alcohol generalmente
glicerol), lípidos complejos (alcohol, ac. graso y otras moléculas como fosfato, aminas,
carbohidratos y similares) y lípidos derivados como los esteroides, el colesterol, la Vit D y los
ácidos biliares.
5.2 Competencias
• Determina la solubilidad de los lípidos y un esquema de extracción.
• Demuestra el poder emulsificador de las sales biliares.
• Determina la presencia de colesterol
5.3 Materiales y equipos
Baño maría Pipeta Bagueta KOH saturado Alcohol
1mL
Cocinilla Pipeta Gradilla HCl concentrado Acetona
2mL
Beacker 1L Pipeta Bencina HNO3 concentrado Cloroformo
5mL
Tubo 17x150mm Gotero Bilis en SSF Agua destilada Pinza para tubos
Tubo 13x100mm Mechero de ron
5.4 Procedimiento
1.- Solubilidad de los lípidos:
Reactivo/Tubos 1 2 3 4 5
Aceite de oliva (gotas) 5 5 5 5 5
Agua (mL) 2 --- --- --- ---
Cloroformo (mL) --- 2 --- ---
Eter Etílico (mL) --- --- 2 ---
Benceno (mL) --- --- --- 2
Alcohol (mL) --- --- --- --- 2
Al tubo N°5 (con alcohol) agregar 3mL de agua y calentar lentamente en el mechero.
Anotar los resultados de solubilidad e interpretar.
2.-Extracción de los lípidos:
-1ra. extracción:
Coloque en un beacker aprox. 1 g de yema de huevo (10 gotas) y agregue 5mL de eter
etílico, mezcle con la bagueta hasta obtener una mezcla homogénea que vertirá en un tubo
y agite fuertemente,
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16. luego centrifugue a 4000 rpm. por 5min. Observe el resultado y anote.
-2da. extracción:
Separe cuidadosamente, en un tubo, el sobrenadante de la 1ra. extracción, y agregue al
residuo 10mL de acetona, agite para mezclar. Observe y anote el resultado.
Filtre la mezcla, lave residuo del filtro con acetona. Observe el precipitado y el filtrado
final, anote los resultados en el siguiente cuadro:
SUSTANCIA OBTENIDA CARACTERISTICAS
1ra. extracción Sobrenadante
(con Eter)
Precipitado
2da. extracción Sobrenadante
(con acetona)
Precipitado
3.-Identificación del Colesterol: Reacción de Lieberman-Burchard
-En un tubo de ensayo colocar 1mL de sobrenadante de la 2da extracción y evaporar el
solvente con sumo cuidado, en baño maría de 36-40°C.
-Agregar 2mL de anhidrido acético, luego, por las paredes del tubo, 0,2mL de H2SO4
concentrado.
-Observe la reacción y la aparición de un color característico. Anote los resultados.
Color resultante: ..................................... Corresponde a: .........................................
5.5 Cuestionario
1.- Fundamento de las características de solubilidad de los lípidos.
2.- Composición y función de las sales biliares.
3.- Fundamento de la Reacción de Lieberman-Burchard para la identificación de colesterol.
4.- Importancia de los lípidos en la estructuración de la membrana celular.
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17. 5.6 Fuentes de información
1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y
nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima
2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed.
Reverté. Barcelona
3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona
(España)
4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill
Interamericana. Madrid
5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004
lima
6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición.
2006. Barcelona (España)
7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales.
Monografía.2003. Perú.
8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México
9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.
10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú
11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003.
Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España.
12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid
13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005
Ed. Manual Moderno. México
14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España
nOTA: EL ALUmnO DEBERÁ ASISTIR A LA PRÁCTICA COn:
hUEVOS.
Practica N° 6
“Hidrólisis enzimática de los lípidos“
6.1 Marco teórico
Los lípidos son compuestos orgánicos insolubles en el agua, pero solubles en
solventes orgánicos como éter, cloroformo, benceno, disulfuro de carbono entre otros;
participan en la absorción de vitaminas liposolubles, síntesis de hormonas etc.
Desde el punto de vista energético constituye reserva calórica como tejido adiposo,
proporcionando 9 kilocalorías por gramo.
En general la hidrólisis de los lípidos libera ácidos grasos de alto peso molecular y un alcohol
que depende del tipo de lípido, siendo el glicerol el mas frecuente.
La digestión de los lípidos se inicia en el estómago, mediante una lipasa ácido- estable que se
cree que en su mayoría se origina en la parte posterior de la lengua. Sin embargo, la velocidad
de hidrólisis es lenta porque los triacilgliceroles forman una fase lipídica separada con una
interfase agua-lípido limitada.
La verdadera hidrólisis se realiza en la primera porción del yeyuno la primera acción de la
lipasa pancréatica, esta enzima es específica para esteres en la posición 1 y 3 del glicerol y
prefiere ácidos grasos de cadena larga de mas de 10 átomos de carbono. La hidrólisis de
triacilgliceroles por la enzima pancreática también tiene lugar en la interfase agua-lípido de
las partículas de la emulsión .La lipasa llega al intestino con el jugo pancreático requiere un
pH optimo 8,sin embargo, el quimo ácido que viene del estómago no se neutraliza
completamente por la alcalinidad del jugo pancréatico y la bilis.
El pH intestinal es 6.5 y aún así la lipasa puede ejercer su acción. Por ejemplo a falta de la
enzima cuando hay obstrucción del conducto pancreático por cualquier proceso patológico
las grasas de la alimentación quedan sin digerir en las heces (esteatorrea).
La lipasa libera los ácidos grasos de las posiciones 1 y 3 del glicerol, pasando sucesivamente
por triglicéridos, diglicéridos y monoglicéridos, este último con el ácido graso (en posición 2),
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18. sobre el no actúa la lipasa interviniendo entonces una enzima, la ISOMERASA que transforma
el monoglicérido de posición 2 a 1 ó 3, haciéndolo de esta manera suceptible a la acción lenta,
los productos finales de la digestión de los triglicéridos son monoglicéridos, pequeña
cantidad de diglicéridos, triglicéridos, glicerol y ácidos grasos libres.
Las sales biliares, en especial el glicocolato y taurocolato de sodio, contenidos en la bilis
llegan al hígado por el coledoco, participan en la digestión y absorción de los lípidos. Su
papel en la digestión consiste en disminuir la tensión superficial de las gotas de lípidos (de
500 000 A de diámetro) originando una emulsión, en gotas de lípidos muy pequeñas,
permitiendo una mayor superficie de acción a la lipasa y aumentando paulatinamente La
actividad enzimática.
Terminando el proceso digestivo por acción de las sales biliares, los productos finales forman
complejos de 50 A de diámetro, llamadas MICELAS, que son absorbidas. Las sales biliares se
absorben en el ileon y regresan al hígado por la vena porta.
Los pasos de la digestión se pueden distinguir en el esquema siguiente:
HIDRÓLISIS:
O
O H2C – O – C – R1 R1 – CO2H
LIPASA + CH2 -- OH
R2 – C – O – CH O + 2 H2O R2 -- CO2 --CH
+
H2C – O – C – R3 CH2 -- OH
R3 – CO2H
Triacilglicerol 2 ácidos grasos y 1 monoacilglicerol
R = cadena hidrocarbonada
En la hidrólisis pueden distinguirse al menos cinco fases diferentes:
-Hidrólisis de triacilgliceroles a ácidos grasos libres y monogliceroles
-Solubilización de los ácidos grasos libres y monogliceroles por detergentes (ácidos biliares )
y transporte desde la luz intestinal hacia a la superficie celular.
-Captación de ácidos grasos libres y mono gliceroles al interior de la célula y resíntesis a
triacilgliceroles.
-Empaquetamiento de los triacilgliceroles recién sintetizados en glóbulos lipídicos especiales
denominados quilomicrones.
-Exocitósis de los quilomicrones desde las células y liberación a la linfa.
6.2 Competencias
• Mide la actividad de la lipasa pancreática por titulación con una base.
• Determina el efecto de las sales biliares sobre la digestión de los lípidos.
6.3 Materiales y equipos
Tubos 17x150mm Bagueta Buffer fosfato pH 8
Gradilla Baño maría Bilis en Buffer pH 8
Pipeta 1mL Aceite de oliva KOH 0.1N
Pipeta 5mL Fenolftaleina Sol. Pancreatina 2%
Pipeta 10mL Agua destilada
Hidrólisis del aceite por acción de la lipasa
Fundamento:
Se ha demostrado que los aceites no hidrolizables difícilmente se absorben en cantidades
apreciables. Sin embargo, cuando el aceite está en forma de emulsión muy fina, puede ser
absorbido a nivel intestinal en pequeña proporción.
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19. Para que esto ocurra es necesario la presencia de las sales biliares (bilis) que van a producir la
emulsión de las grasas y de esa manera facilitar su absorción y la acción enzimática de la
lipasa pancreática sobre las grasas hasta el desdoblamiento en ácidos grasos y glicerol. En
todo este proceso interviene el pH óptimo de 8.00.
En el laboratorio su demostración se puede llevar a cabo empleando una enzima pancreática
(sintética, solución de pancreatina) en lugar de la lipasa pancreática, la cual para poder ser
aislada necesita un proceso laborioso, también debido a su inestabilidad.
6.4 Procedimiento
Disponer una serie de 3 tubos de ensayo y proceder de la siguiente manera
Reactivo / Tubos Nº 1 2 3
Aceite de oliva neutralizado mL 1 1 --
Buffer pH 8. 0 mL - 2 2
Sales biliares en buffer pH8 mL 2 -- 2
Agua destilada mL 2 2 1
Antes de agregar la solución de pancreatinina, debemos estar seguros de que no haya acidez
libre en el medio que estamos preparando, para lo cual debemos emulsionar bien cada tubo y
si el color rosado del indicador (fenolftaleína) no se mantiene, nos indica acidez en el medio de
proceso; se añade unas gotas de KOH 0.1N, cuidando del exceso.
Solución de pancreatina mL 5 5 5
Agitar y deje incubando durante 20 minutos a 37º C.
Durante este tiempo la enzima libera los ácidos grasos del aceite que acidifican el medio, esto
hace virar al indicador hacia la zona ácida.
En el tubo que no contiene sales liberadas, la reacción habrá sido más lenta que la del primer
tubo, y en el que no contiene aceite de pepita no habrá ninguna acidez.
6.5 Cuestionario
1.- Cual es el origen de la pancreatina empleada en la práctica.
2.- Cuantos tipos de Lipasa existen.
3.- Importancia clínica, tipos y composición de la bilis.
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20. 6.6 Fuentes de información
1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y
nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima
2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed.
Reverté. Barcelona
3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona
(España)
4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill
Interamericana. Madrid
5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004
lima
6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición.
2006. Barcelona (España)
7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales.
Monografía.2003. Perú.
8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México
9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.
10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú
11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003.
Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España.
12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid
13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005
Ed. Manual Moderno. México
14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España
Practica N° 7
“Identificación de proteínas, determinación de proteínas totales y fraccionadas“
7.1 Marco teórico
Las proteínas son macromoléculas compuestas de cadenas de aminoácidos.
Todos los aminoácidos tienen la misma estructura básica, conformada por un carbono central
α unido a un grupo amino (-NH2), un grupo carboxilo (-COOH), un hidrógeno y un radical
variable (-R) que da la diferencia entre uno y otro aminoácido, confiriéndoles propiedades
distintivas.
Se define como Aminoácido a aquella molécula con grupo amino y grupo carboxilo que
proviene de la hidrólisis de las proteínas, según ello se han identificado 20 aminoácidos los
cuales difieren en sus propiedades fisicoquímicas, a tal punto que la secuencia exacta de ellos
determina, la función, la solubilidad o no en agua, su función catalítica como enzima, su
función reguladora como hormona o estructural. En algunos casos variaciones en un solo
aminoácido ocasiona que una proteína pierda su función.
Las proteínas presentan diferentes funciones muy importantes en los procesos biológicos,
actúan como elementos estructurales, biocatalizadores, coagulación sanguínea, anticuerpos,
hormonas, receptores hormonales y también como nutrientes de primer orden en la dieta y
alimentación del humano.
PROTEINAS SERICAS: El plasma sanguíneo es una solución coloidal con gran contenido de
proteínas, aprox 7-7,5 g/dL. Al conjunto de proteínas del plasma se les denomina proteínas
totales plasmáticas.
Albúmina.- Las albúminas constituyen mas de la mitad del total de proteínas del organismo,
debido a ello se les pueden considerar como una importante reserva proteica del organismo.
Se caracterizan por su gran estabilidad, solubilidad en agua y soluciones salinas, bajo peso
molecular siendo el mayor contribuyente en el mantenimiento de la presión osmótica coloidal
intravascular.
Es sintetizada por el hígado, se encarga de fijar y transportar numerosas sustancias que son
insolubles en medios acuosos tales como los ácidos grasos, hormonas esteroidales,
bilirrubina, catecolaminas ,etc.
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21. Globulinas.- Son proteínas plasmáticas complejas, muy heterogéneas, de alto peso molecular,
son insolubles en agua pero solubles en soluciones salinas, constituyen las proteínas
conjugadas (glicoproteínas y lipoproteínas).
Fibrinógeno.- Se sintetiza en el hígado y constituye la fase preliminar de la fibrina que
interviene en el proceso de coagulación sanguínea, su concentración media es de 0.3g/dL.
Variaciones en los Niveles de las Proteínas Séricas
-Hiperproteinemia.- Se presenta en la deficiencia relativa de agua. Se trata de cambios en la
concentración y no indica que haya alteración de la cantidad absoluta de proteínas, se aprecia
en casos de deshidratación, en ciertas enfermedades crónicas: procesos inflamatorios
crónicos, cirrosis hepática, etc.
-Hipoproteinemia.- Se presenta en un exceso relativo de agua. Se trata de cambios en la
concentración y no indica alteración de la cantidad absoluta de proteínas.
Pérdida excesiva de proteínas, principalmente albúmina, a través del riñón en el síndrome
nefrótico, por la piel en quemaduras graves, y por el intestino en enteropatías.
Disminución de la síntesis proteica por deficiencia proteica grave en la dieta, hepatopatía
grave o malabsorción. A niveles <4 g/dl, es frecuente la aparición de edemas.
-Hiperalbuminemia.- Es el aumento anormal de albúmina y se presenta generalmente, en casos
de deshidratación.
-Hipoalbuminemia.- Es la disminución anormal de albúmina lo cual genera trastornos en la
distribución de los líquidos orgánicos con formación de edema, acompañados de
hipocalcemia (debido a su unión con el calcio plasmático), presentándose en cuadros de
infección crónica, insuficiencia hepática, hemorragias y síndrome nefrótico.
-Hiperglobulinemias.- Aumento anormal de globulinas, se presenta en daño hístico activo,
como en procesos inflamatorios, procesos malignos, después de traumatismos, etc.
-Hipoglobulinemias.- Es la disminución de globulinas presentándose en diversos cuadros
dependiendo del tipo de globulina involucrada.
Las α-globulinas, están disminuidas particularmente en casos de enfisema pulmonar y
aumentadas en las reacciones inflamatorias.
Las γ-globulinas, están disminuidas en casos de pérdida renal como en el síndrome nefrótico,
disminución de su síntesis, deficiencias inmunitarias, edad avanzada, etc, encontrándose
aumentadas generalmente en procesos inflamatorios crónicos y en algunas enfermedades
autoinmunitarias.
TERMINOLOGIA CLINICA :
Proteinograma: Gráfico que representa cada una de las concentraciones proteicas en los
distintos líquidos del organismo.
Proteinemia: Concentración de las proteínas en la sangre.
Proteinosis: Acumulación de proteínas en los tejidos.
Proteinuria : Presencia de proteína en orina.
Proteinuria falsa: Proteína extraña a la de la orina por contaminación, ejemplos: leucorrea
vaginal, menstruación, semen, secreciones perianales o rectales, etc. Para evitar se
recomienda recoger orina por cateterismo.
7.2 Competencias
• Determina la presencia cualitativa de las proteínas en diferentes muestras.
• Determina la concentración de proteínas totales y fraccionadas (albúmina y globulina) en
suero.
7.3 Materiales y equipos
Tubo 13x100mm Pipeta 1mL Centrífuga Rvo. Biuret
Espectrofotómetro Pipeta 2mL Baño maría Rvo. Proti 2 Winer Prot.Tot
Alcohol Pipeta 5mL Espatula Rvo. Proti 2 Winer
albúmina
Tips amarillos Gotero Bagueta Estándar Prot Totales y
Albumina
F-CV3-3B-2 venoject 21Gx 1”
Aguja Gradilla Mortero Piceta
Micropipeta 10-100uL Ligadura Algodón Rev. Junio 2007
21
22. Método para la determinación de proteínas totales:
Fundamento:
Las proteínas en medio alcalino y en presencia de sulfato de cobre forman un complejo de
color violeta, debido a que el ión cobre forma un complejo tetra coordinado con el nitrógeno
del enlace peptídico
C C
H--N N--H
R—H--C C—H--R
Cu ++
C C
H--N N--H
Método para la determinación de Albúmina
Fundamento:
La albúmina reacciona específicamente sin separación previa con la forma aniónica de la
Bromo Cresosulfon Ftaleína (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio
tamponado a un pH 3.8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto del blanco de
reactivos, es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra.
7.4 Procedimiento
DETERMINACIONDE PROTEÍNAS EN MUESTRAS DE ALIMENTOS
Colocar cada muestra en tubos de ensayo (si son alimentos líquidos) o en lunas de reloj (si
son alimentos sólidos) y agregar 2 mL de Rvo de Biuret.
El color violeta indicará la presencia de proteína y el mantenimiento del color celeste la
ausencia.
De requerirlo, un alimentos sólido (cereales, granos, otros) puede ser triturado en el mortero
previo a la reacción.
DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES
Tomar una muestra de sangre (aprox. 3 mL), centrifugar a 3,000 rpm por 10 minutos. Separar el
suero.
Colocar en tres tubos de acuerdo al esquema siguiente:
Rvo. / TUBOS BLANCO ESTANDARD MUESTRA
Agua destilada 50 uL - -
Estándar Prot. Tot. - 50 uL -
Muestra (suero) - - 50 uL
Rctv.EDTA/ Cu 3.5 mL 3.5mL 3.5 mL
Mezclar e Incubar durante 15 minutos a 370C. Leer en espectrofotómetro a 540 nm llevando a
cero con el tubo blanco.
Estabilidad de la mezcla de reacción Final: El color de la reacción es estable durante 12 horas
por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso.
DETERMINACION DE ALBUMINAS
Colocar en tres tubos lo siguiente:
Rvo. / TUBOS BLANCO ESTANDARD MUESTRA
Estándar Albúminas - 10 uL -
Muestra (suero) - - 10 uL
Reactivo BCF 3.5 mL 3.5 mL 3.5 mL
F-CV3-3B-2
Rev. Junio 2007
22
23. Mezclar y mantener los tubos entre 15 y 28º C durante 10 minutos. Leer en espectrofotómetro
a 625 nm llevando a cero con el blanco de reactivo.
Estabilidad de la mezcla de reacción final: El color de la reacción es estable 20 minutos, por
lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso.
CALCULO DE LOS RESULTADOS:
Proteínas Totales (g/dL) = Abs. Muestra x f f=[Std.P.T.g/dL]
Abs Std
Albúmina (g/dL) = Abs. Muestra x f f=[Std. Alb. g/dL]
Abs. Std.
Globulinas (g/dL) = [Proteínas Totales] - [Albúmina]
Relación A/G = [Albúmina g/dL]
[Prot. Tot. g/dL] - [Alb. g/dL]
VALORES DE REFERENCIA: Proteínas totales: 6,1 a 7,9 g/dL
Albúmina: 3,5 a 4,8 g/dL
Globulinas: 2,0 a 3.6 g/dL
Relación A / G: 1–2
7.5 Cuestionario
1.-Mencione usted las características moleculares de: Caseína, ovoalbúmina, suero de leche,
gelatina, insulina, glutatión.
2.- Tratamientos contra las quemaduras empleando colágeno.
3.- Explique usted los cuadros de hipoproteinemia por pérdida renal.
7.6 Fuentes de información
1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y
nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima
2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed.
Reverté. Barcelona
F-CV3-3B-2
Rev. Junio 2007
23
24. 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona
(España)
4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill
Interamericana. Madrid
5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004
lima
6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición.
2006. Barcelona (España)
7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales.
Monografía.2003. Perú.
8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México
9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.
10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú
11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003.
Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España.
12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid
13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005
Ed. Manual Moderno. México
14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España
NOTA: El alumno deberá asistir a la práctica con lo siguiente: Huevos, leche, yogurt, carne cruda,
carne cosida, soya, quínua.
Practica N° 9
“Determinación de Colesterol”
9.1 Marco teórico
El colesterol se encuentra presente en la sangre, bilis y tejido cerebral. Es precursor de los
ácidos biliares, esteroides, y vitamina D. Su determinación contribuye al diagnóstico y
clasificación de las dislipidemias.
9.2 Competencias
• Determina la concentración de Colesterol en suero
• Relaciona la importancia de los niveles elevados con un trastorno metabólico
9.3 Fundamentos del metodo
El colesterol se determina por acción de las enzimas Colesterol ester hidrolasa y
Colesterol oxidasa. La primera libera el colesterol de los ésteres de colesterol, y la segunda
oxida el colesterol libre produciéndose peróxido de hidrógeno, el cual en presencia
de la enzima peroxidasa reacciona con el sistema cromogénico dando origen a un
compuesto coloreado que absorbe a 505 nm.
Colesterol ester CEH Colesterol + ácidos grasos
Colesterol + O2 CHOD Colest-4-en-3-ona + H2O2
2H2O2 + 4-AAP +p-HBA PAP Comp. Coloreado + 4H2O
9.4 Reactivos y Equipos
Conservado entre 2° y 8° C. y protegido de la luz, estable hasta la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta.
El reactivo con el tiempo puede tomar un leve color rosado que no afecta los resultados.
Descartar el reactivo si la absorbancia contra blanco de agua es superior a 0.4 D.O. a 505
nm.
Preparación: El reactivo se provee listo para su uso.
Composición del reactivo enzimático:
Buffer fosfato pH 7.2 100 mM
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24
25. Colesterol ester hidrolasa >150 U/l
Colesterol oxidasa (recombinante) >100 U/l
Peroxidasa >1000 U/l
4-Aminoantipirina 0.4 mM
Acido p-hidroxibenzoico 10 mM
Azida sódica 0.1 g/dl
Estabilizantes y preservantes no reactivos c.s.
Solución standard:
Colesterol en solución acuosa estabilizada 200 mg/dl
Espectrofotómetro o fotocolorímetro de filtros capaz de medir absorbancia a 505
nm. (rango 500 - 550 nm.)
Baño Maria
Pipetas
MUESTRAS
Utilizar de preferencia suero o plasma (Heparina o EDTA) libre de hemólisis. La muestra
debe tomarse con el paciente en ayunas.
Los tubos y material de vidrio deben estar limpios y libres de residuos de detergentes. El
colesterol es estable 7 días a temperatura ambiente, y 6 meses en congelador.
9.5 Procedimiento
Llevar el reactivo a la temperatura que se realizará el ensayo. Las pipetas a utilizar
deben estar limpias y libres de residuos para no contaminar el reactivo.
Blanco Standard Muestra
Muestra (ml) -- -- 0.01
Standard (ml) -- 0.01 --
Reactivo (ml) 1.00 1.00 1.00
Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C. ó 10 minutos a temperatura ambiente (>20°C.).
Leer las absorbancias llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo.
El color resultante es estable por a lo menos treinta minutos.
9.6 Calculos
FACTOR = 200
Absorbancia Standard
Colesterol (mg/dl)= Factor x Abs. Muestra
RANGO DE REFERENCIA 140 a 200 mg/dl
“Determinación de Acido Úrico en suero “
9.7 Marco teórico
Los nucleótidos de una célula se estan renovando continuamente. Los nucleotidos se degradan
por hidrólisis a nucleósidos, por medio de las
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25
26. nucleotidasas. Las nucleósidos fosforilasas catalizan la ruptura fosforolítica de los nucleósidos
para originar bases libres y ribosa -1-fosfato. Esta base libre proviene de una base nitrogenada
de tipo purínica
A pH fisiológico, el ácido úrico pierde un protón dando lugar a urato. En los seres humanos,
el urato es el producto final de la degradación de las purinas y se excreta en la orina. Niveles
elevados de urato en el suero provocan la gota, una enfermedad en la que las sales de urato
forman cristales que deterioran las articulaciones y los riñones. En algunos casos se utiliza el
alopurinol, un inhibidor de la xantina oxidasa para tratar la gota.
También existen otros desórdenes que transcurren acompañados de hiperuricemia, tales como
leucemia, policitemia, mieloma múltiple, intoxicación plúmbica, incluyendo alteraciones
medicamentosas en los tratamientos con citostáticos o con tiazidas. Mientras que otros
medicamentos (drogas uricosúricas tales como salicilatos y la fenilbutazona) aumentan la
excreción del ácido úrico, disminuyendo los niveles séricos del mismo
9.8 Competencias
• Determina la concentración de ácido úrico en suero
• Relaciona la importancia de los niveles elevados con un trastorno metabólico
9.9 Materiales y equipos
Micropipeta 10 a 200 ul Tips amarillo
Pipetas 5 mL Suero
Gradilla Estándar de ácido urico 10 mL x grupo
Tubos 3 x mesa Rvo Enzimático de acido úrico 10 mL x grupo
Espectrofotométro Baño María
9.10 Fundamento del método
El ácido úrico es oxidado por la enzima específica uricasa, generándose alantoína y H2O2, el cual
en una reacción mediada por la enzima POD, reacciona con el Ac.3 dimetiaminobenzoico y 4 –
AAP produciéndose un compuesto coloreado con un máximo de absorción a 555 nm., en cantidad
proporcional a la cantidad de ácido úrico presente en la muestra.
Acido Úrico uricasa Alantoína + H2O2
H2O2 + DMAB + 4- AAP POD H2O + Complejo coloreado
9.11 Procedimiento
BLANCO STANDARD MUESTRA
Muestra (ml) --- --- 0, 025
Standard (ml) --- 0, 025 ---
Reactivo (ml) 1,00 1, 00 1, 00
Mezclar e incubar 10 minutos a 37º C, o 20 minutos a temperatura ambiente
(20 a 25ºC).
Leer a una longitud de onda óptima 555 nm.
Llevar a cero con agua destilada el espectrofotómetro
Anote la absorbancia de la muestra:…………….
La fórmula matemática a usar es el factor de calibración
FACTOR = 10 mg/mL
Absorbancia Estándar
ACIDO ÚRICO (mg/dL.) = FACTOR X ABSORBANCIA DESCONOCIDO
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26
27. VALORES DE REFERENCIA:
En Suero: Hombres.................. 3, 4 a 7, 0 mg/dl.
Mujeres...................... 2, 4 a 5, 7 mg/dl.
9.12 Cuestionario
1.- ¿Cuáles son los otros factores de riesgo de padecer enfermedades
cardíacas y vasculares, Además del exceso de colesterol?
2.- ¿Qué tipos de colesterol hay, haga un breve resumen de cada uno?
3.- ¿Cómo afecta a los niños el colesterol, y cuál es el nivel de colesterol recomendable en la
infancia?
4.- Desarrolle el esquema metabólico de la formación del ácido úrico?
5.- Señale que otras muestras biológicas podemos usar para determinar ácido úrico?
9.13 Fuentes de información
1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y
nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima
2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed.
Reverté. Barcelona
3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona
(España)
4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill
Interamericana. Madrid
5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004
lima
6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición.
2006. Barcelona (España)
7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales.
Monografía.2003. Perú.
F-CV3-3B-2
Rev. Junio 2007
27
28. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México
9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.
10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú
11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003.
Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España.
12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid
13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005
Ed. Manual Moderno. México
14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España
Practica N° 10
“Actividad enzimática y factores que la afectan“
10.1 Marco teórico
Las Enzimas son proteínas que intervienen en las reacciones químico-biológicas
acelerando la velocidad de dichas reacciones hasta su punto de equilibrio.
Los substratos son las moléculas sobre las que actúan las enzimas.
En una reacción bioquímica catalizada por una enzima, a medida que progresa la reacción,
aumenta la concentración de los productos a expensas de la desaparición de los
correspondientes substratos en tanto permanece fija la concentración de la enzima.
La Actividad Enzimática se puede expresar como:
a.- La DESAPARICION del SUBSTRATO. E + S E +
b.- La APARICION del PRODUCTO P
c.- Por la MODIFICACION de COFACTORES
Factores que Modifican la Actividad Enzimática Donde: C C´
Son diversos: E = Enzima
1.- pH del medio S = Substrato
2.- Temperatura P = Producto
3.- Concentración de Enzima
4.- Concentración de Substrato C = Cofactor antes de la reacción
5.- Acción de Inhibidores y Activadores
10.2 Competencias
• Comprueba la acción de los factores que regulan la actividad enzimática
• Demuestra como la actividad enzimática puede ser expresada.
10.3 Materiales y equipos
Tubos 17x150mm Pipeta 1mL Indicador de pH Solución Salina
1-14 Fisiológica
Potenciómetro Pipeta 5mL Estandar de pH 4 Albúmina de huevo en
SSF
Baño maría Pipeta 10mL Estandar de pH 7 Pepsina en SSF
Hielo Bagueta Estandar de pH 10 Agua destilada
Beacker 500mL Gradillas Portacubetas NaCO3 10%
Espectrofotómetr HCl 1N
o
Para nuestros experimentos estudiaremos el efecto de la PEPSINA sobre la ALBUMINA.
La PEPSINA es una enzima que hidroliza cadenas grandes de proteínas convirtiéndolas en
cadenas pequeñas.
La ACTIVIDAD ENZIMATICA se demostrará por desaparición del substrato, o sea la
disminución de la turbidez de una solución de Albúmina de huevo sobre la cual actuará la
enzima. La turbidez se leerá en el ESPECTROFOTOMETRO.
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28
29. 10.4 Procedimiento
Experiencia Nº1 EFECTO DEL PH
Principios Teóricos.- Si actúa una enzima sobre un Efectos del pH sobre la Actividad
substrato n cantidades equimoleculares (iguales) Enzimática.
variando el pH del medio de reacción, se observará
que existe una región o punto de actividad óptima, A E pH óptimo
correspondiendo al pH, al cual se denomina pH c n 1
OPTIMO, que varía con la pureza de la enzima, el t z
tipo de sustancia sobre el cual actúa, las sales del
medio, etc. Ello debido a la interacción E–S (Enzima
i i
–Substrato) que se realiza, en gran parte, a través de v m
los grupos ionizados existentes en sus moléculas. La i á
concentración de iones (H+) u Oxhidrilos (OH-) d t
presentes en el medio, alteran los grupos ionizados a i
e impiden la asociación de las moléculas.
d c
Procedimiento Experimental: a
Preparar 6 tubos de acuerdo al esquema siguiente:
0
Tubo Nº 1 2 3 4 5
BAJO pH 6
H2O dest. (mL) --- 1,5 2 1,5 --- ---
HCl 1N (mL) 2,0 0,5 --- --- ---
Na2CO3 10%(mL) --- --- --- 0,5 2,0 ---
Albúmina (mL) 5 5 5 5 5 ---
Pepsina (mL) --- --- --- --- --- 20
pH del tubo 1.0 2 6.0 10 11.0 ---
Incubar por 5 min los 6 tubos en Baño maría a 37ºC.
Añadir 3 mL de la pepsina pre-incubada (tubo 6), a los tubos 1, 2, 3, 4 y 5, y mezclar bien.
Volver a incubar los tubos 1 al 5 por 5 min en baño maría a 37ºC.
Leer la absorbancia de los tubos del 1-5 al espectrofotómetro a una longitud de onda de
440nm, usando un blanco de agua destilada.
La lectura debe realizarse tan pronto sale de la incubación, de no ser así, mantener los tubos
en agua helada hasta el momento de la lectura.
CALCULOS: Para obtener la actividad enzimática se debe restar la mayor absorbancia
obtenida menos la absorbancia de cada tubo. Graficar los resultados, en un papel milimetrado,
colocando el pH en las abcisas y la actividad enzimática en las ordenadas.
RESULTADOS: Encontrar el pH óptimo de acción la PEPSINA sobre la ALBUMINA
Experiencia Nº2 EFECTO DE LA TEMPERATURA Efectos de la Temperatura sobre la
Principios Teóricos.- La temperatura acelera la velocidad Actividad Enzimática.
de las reacciones al aumentar las colisiones efectivas entre
A E Temperatura
los elementos reaccionantes.
En una reacción enzimática también deben colisionar E-S óptima
(Enzima-Sustrato) para que la reacción progrese, por c n 1
tanto, las reacciones enzimáticas serán más rápidas a t z
mayores temperaturas, sin embargo y dada la naturaleza i i
proteica de las enzimas, la temperatura no puede v m
aumentarse indefinidamente, pues comenzarán a
romperse los puentes de hidrógeno, alterándose las i á
estructuras secundarias, situación que se conoce como d t
DESNATURALIZACION (Ver esquema). a i
d c
Procedimiento Experimental:
1º Preparar dos series de 5 tubos cada una, de acuerdo al esquema siguiente:
Reactivo / Tubo N° CONTROL 1 2 3 4 5
H2O dest. (mL) 3,0 3,5 3,5 3,5 3,5 ---
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30. HCl 1N (mL) --- 0,5 0,5 0,5 0,5 ---
Albúmina (mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 ---
Pepsina (mL) --- --- --- --- --- 11
Incubar por 5 min a 37°C en baño maría
Agregar 2 mL de la pepsina pre incubada (Tubo 5) a cada uno de los tubos del 1 al 4 e
inmediatamente incubar por 5min según el esquema siguiente:
Tubo 1 2 3 4
Temperatura °C 0 (hielo) 25(Ambiente) 37 100 (ebullición)
Al finalizar el tiempo, colocar inmediatamente los tubos en agua helada para detener la
reacción, hasta el momento de su lectura.
Leer al espectrofotómetro los tubos 1-4 y el control, usando un blanco con agua destilada.
CALCULOS: La actividad enzimática se encontrará restando la lectura de cada tubo
(1-4) de la lectura del tubo CONTROL (SIN INCUBAR). Graficar los resultados en un papel
milimetrado, colocando la temperatura en las abscisas y la actividad enzimática en las
ordenadas.
RESULTADOS: Encontrar la T° óptima de acción la PEPSINA sobre la ALBUMINA
10.5 Cuestionario
1.- Explique el mecanismo de acción de la las enzimas
2.- Escriba la reacción que cataliza la pepsina.
3.- Con los datos de la práctica elabore las gráficas de pH vs Actividad y T° vs Actividad, y
explique en función a la bibliografía recomendada.
4.- A que llamamos especificidad por el sustrato?
5.- Uso del dosaje de enzimas para el diagnóstico clínico, de ejemplos.
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