私は『LC-ECD-MSを用いた代謝物の高感度・網羅的分析法の開発』を行っています。LC-MSに用いられるエレクトロスプレーイオン化（ESI）法は、代謝物などの低分子からペプチド・タンパクなどの高分子に至る、中・高極性の幅広い範囲の物質に対して有効なイオン化法でありますが、脂質などの低極性物質に対しては、イオン化効率が低いため高感度検出は難しいという問題が存在します。一方、LC-ESI-MSにおいて私達は、低極性物質とその酸化体ではヒドロキシ基がケトン基に変わった酸化体の方が高感度に検出されることを確認しました。このことから低極性物質を酸化体に変化させることが出来れば、LC-ESI-MSにおいても高感度分析が可能になると考え、ESIではイオン化が難しい低極性物質を酸化還元することにより高感度かつ選択的に検出する電気化学検出器（ECD）に注目しました。私達はESIによる既存のLC-MSに、ECDを組み合わせた、LC-ECD-ESI-MSを用いることにより、様々な低極性物質の測定を行い、高感度検出を可能としました。今後、このシステムを用いた網羅的分析に応用していくつもりである。

1. ○小林 勇太、水野 初、閔 俊哲、轟木 堅一郎、豊岡 利正 (静岡県立大学薬学部)
LC-ECD-MSを用いた代謝物の高感度・網羅的分析法の開発
 ECDの酸化還元反応により、VD3の酸化体が生成することが確認され、最適印加電圧は1250 mVに決定した。
 VD3のLC-ECD-ESI-MS分析において、 ECDにより生成したVD3酸化体の検出感度は、VD3を通常のLC-ESI-MSで検出した場合の
10～25倍程度、LC-APCI-MSでは10～30倍程度となり、高感度化を達成した。
ESIイオン化法による低極性物質分析の問題
LC-MSに用いられるエレクトロスプレーイオン化（ESI）法は、
代謝物などの低分子からペプチド・タンパクなどの高分子に至る、
中・高極性の幅広い範囲の物質に対して有効なイオン化法である。
しかし、脂質などの低極性物質に対しては、イオン化効率が低
いため高感度検出は難しいという問題がある。
一方、LC-ESI-MSにおいてL-Mentholのピークはほとんど検出さ
れなかったが、ヒドロキシ基をケトン基に変えたL-Menthoneでは
強いピークが検出されることが確認できた。このことから、低極
性物質を酸化体へ変換することができれば、より高感度な分
析が可能となることが示された。
menthone([M+H]+=155.1430)menthol ([M+H]+=157.1586)
総括
謝辞
LC condition
(Accela LC Systems, Thermo Fisher Scientific)
Column
Column Temp. (℃)
Mobile Phase
Flow Rate (mL/min)
Injection Volume (μL)
ACQUITY UPLC BEH C18
(1.7 μm, 2.1 × 100 mm)
40
50 mM fomic acid and 10 mM
ammonium formate in 90% MeCN
0.2
5
ECD condition
(Model 5600A CoulArray® Detector, esa)
Cell potential (mV)
Cell Temp. (℃)
1250
37MS condition
(Q-Exactive, Thermo Fisher Scientific)
Resolution
Mass Range
Capillary temp.(℃)
Heater temp.(℃)
Ion Mode
Sheath gas flow rate
Aux gas flow rate
Spray voltage (kV) /
Discharge current (μA)
70,000
m/z 100-500
350
300
ESI positive
40
10
3.80
―
/ APCI positive
/ 30
/ 0
/ —
/ 4.00
VD3のLC-ECD-ESI-MS分析
ECD
ON
ECD
OFF
APCI
LOD 1) (fmol) 5.51 131.4 153.5
LOQ 2) (fmol) 54.0 623.7 523.9
VD3標準試料の各測定法における感度比較
ECDの使用により
ESIイオン化の11～23倍
APCIイオン化の9～27倍
の高感度化を達成
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
S/N比
nM
下限値付近の拡大図
ECD ON
ECD OFF
APCI
本研究を行うに当たり、技術的な助言をいただいた、橋口九州男様（Thermo Fisher Scientific）に感謝致します。
本研究の一部は科研費（16K21276）の助成を受けたものである。
Sample VD3
1 mM VD3 in MeCN
測定条件
電気化学検出器（ECD）を検出器として用いたLC-ECDで
は、測定対象分子を酸化還元することにより高感度な検出
が可能である。
本研究では、既存のLC-ESI-MSにECDを組み込んだLC-
ECD-ESI-MSを用い、ESIではイオン化が難しい低極性物質の
高感度かつ選択的な分析法の開発を行った。
ECDの電圧セル
における酸化還元反応
酸化還元反応を起こす物質A A→AOx + e-
酸化還元を起こさない物質N N→N
1) LOD : S/N = 3, 2)LOQ : S/N = 10
LC-ECD-ESI-MS分析法の開発
酸化還元反応
を使えば･･･!?
LC-ECD-ESI-MSによるVD3分析
MS/MS spectrum(NCE : 30)Chromatogram
EIC @ m/z 385.3462 [M+H]+
18.30
VD3ECD
OFF
MS/MSフラグメント
m/z 367.33
m/z 81.07
ECD ONにより
同じ保持時間にVD3
酸化体ピークを検出
MS/MSデータベース
に登録されている
VD3のフラグメント
パターンと一致
ECDによるVD3の
酸化体生成を確認
VD3(ビタミンD3)の測定意義
VD3およびその代謝物はミネラル代謝や恒常性の維持, 骨代謝, 免疫
系を担う生体には欠かせない栄養素である。
しかし、VD3はESIのイオン化効率が低いため、高感度分析を行うに
は誘導体化や、APCIイオン源の利用などが必要となっている。
81. 0704 383.3302
365.3198
MS/MS database(https://www.mzcloud.org/)
FT HCD 30 NCE, 23.121eV MS2
81.0698
367.3359
385.3465
MS/MS Database 照合
385.3462
81. 0704
367.3356
共通フラグメント
17.97
VD3
酸化体
EIC @ m/z 383.3302 [M+H]+
ECDセル印加電圧値を
1250 mVに決定
ECDセルの印加電圧値を振り
強度が最大となる
1200 mV付近で検討
保持時間 (min)
ECD chromatogram 印加電圧変化に伴うPeak Height値変化
印加電圧 (mV)
PeakHeight値
ECDセル印加電圧の最適化
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 100 200 300 400 500 600
S/N比
nM
y = 0.7215x + 2.2056
R2 = 0.9998
ECD ON
ECD OFF
y = 0.0711x + 1.1308
R2 = 0.9987
y = 0.0945x + 0.0987
R2 = 0.9974
APCI
S/N比を用いた各測定法の検量線
ECD
ON