2. Objetivo del Trabajo Práctico
Aislamiento de microorganismos partir de
distintos inóculos (agua, ricota, arroz, tierra
y yogurt)
1)Enriquecimiento-Selección
2)Selección-Diferenciación
3)Obtención de un cultivo puro (Tinción de
Gram y Pruebas Bioquímicas)
4. Medios de Cultivo: características generales
•Disponibilidad de nutrientes (C, N, sales inorgánicas,
vitaminas)
•Disponibilidad de oxígeno
•pH
•Humedad
•Temperatura
•Esterilidad
5. • Medios Definidos o Complejos
• Medios Mínimos (definidos) o Ricos
(complejos).
6. •Medio Definido: los componentes del medio (y sus concentraciones)
son conocidos.
Ejemplo de Medio Definido para Escherichia coli:
Componente Gramos/litro
Glucosa 5 Fuente de C y
energía
Na2HPO4 6 Buffer, fuente de P
KH2PO4 3 Buffer, fuente de P
NH4Cl 1 Fuente de N
NaCl 0.5 Fuente de Na
MgSO4•7H2O 0.12 Fuente de Mg
CaCl2•2H2O 0.01 Fuente de Ca
7. •Medio Complejo: se agregan ingredientes cuya composición exacta de
desconoce (extractos, peptonas, etc).
Ejemplo de Medio Complejo para Salmonella:
Componente Gramos/litro
Extracto de 5 Fuente de aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y
carne micronutrientes. También fuente de C.
Peptona 6 Fuente de aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y
micronutrientes. También fuente de C.
Glucosa 5 Fuente de C y energía.
Na2HPO4•12H2O 4 Buffer y fuente de P.
FeSO4•7H2O 0.3 Indicador de producción de H2S. Fuente de Fe
y S.
Indicador 8 Inhibe el crecimiento de Gram positivos
Sulfito de
Bismuto
Verde Brillante 0.025 Inhibe el crecimiento de Gram positivos
Ágar 20
8. Peptonas: péptidos (aminoácidos libres), carbono y nucleótidos.
•Peptona de caseína (triptona): degradación pancreática de la
caseína.
•Peptona de carne: degradación pancreática de la carne.
•Peptona de gelatina: degradación pancreática de la gelatina.
•Proteosa peptona: peptona de mayor calidad, con alta proporción
de péptidos de menor PM, aminoácidos libres y factores de
crecimiento.
•Extracto de levadura: es la parte hidrosoluble de la levadura
autolizada. Alto contenido de vitaminas.
9. •Medio Mínimo: posee la mínima cantidad de nutrientes requeridos
para el crecimiento. Es un medio definido. Por ej.: M9.
•Medio Rico: posee gran variedad de nutrientes y en abundancia
(provenientes de extractos y peptonas). Por lo general son medios
complejos.
Por ej: Luria-Bertani (LB):
Componente Gramos/litro
Triptona 10 Aminoácidos, carbono, energía, macro y
micronutrientes.
Extracto de 5 Vitaminas, macro y micronutrientes.
Levadura
NaCl 10 Balance osmótico.
10. •Medio de Enriquecimiento: se utiliza como primer paso en el
aislamiento de bacterias. Contiene sustancias que permiten enriquecer el
cultivo en el organismo de interés.
•Medio Selectivo: posee sustancias que permiten el crecimiento de un
grupo de bacterias y que inhiben el desarrollo de otros grupos. Por ej:
sales biliares y cristal violeta: inhiben el crecimiento de Gram
positivos.
•Medio Diferencial: contiene compuestos que permiten detectar algún
cambio de color en el medio cuando ocurre una determinada reacción
química. Por ej: azul de bromocresol: indicador que vira al amarillo
cuando el pH del medio es ácido (permite distinguir a las bacterias
que fermentan lactosa).
•Medio Selectivo y Diferencial.
11. Pasos a seguir para aislar un microorganismo (y caracterizarlo):
1. Inocular la muestra (agua, tierra, yogurt, ricota o arroz) en
un caldo de enriquecimiento.
2. Incubar a la temperatura y tiempo adecuados.
3. Estriar en medio selectivo (además puede ser diferencial).
Obtención de colonias aisladas.
4. Tinción de Gram
5. Pruebas Bioquímicas: TP Nro. 5.
12. Enterobacterias
γ-Proteobacteria
Bacilos Gram negativos
Fermentadores de glucosa
Anaerobios facultativos
Flagelos peritricos
Escherichia coli (algunas cepas patógenas)
Salmonella, Shigella, Enterobacter, Yersinia, Klebsiella,
Proteus, entre otros. Todos con especies patógenas.
Oxidasa negativos
13. Aislamiento de Enterobacterias (agua)
1. Sembrar en Caldo Mac Conkey (2x): medio de enriquecimiento y
selectivo para el aislamiento de enterobacterias de agua y leche.
Peptona de Caseína
Lactosa
Bilis de Buey
Púrpura de Bromocresol
pH= 7,4±0,2
Incubar por 48 hs a 37ºC
Si hay fermentación de lactosa:
Sólo ácido Coliformes, sin E. coli
Gas + ácido E.coli (junto a otras coliformes)
14. Aislamiento de Enterobacterias (agua)
Crecimiento en Cambio de Formación de
Caldo Mac Conkey color a Gas
amarillo
Escherichia coli Bueno Sí Sí
(lactosa +)
Enterobacter Bueno Sí Sí
cloacae
(lactosa +)
Klebsiella pneumoniae Bueno Sí Sí
(lactosa +)
Proteus mirabilis Bueno No No
Pseudomonas Malo
aeruginosa
Staphylococcus Malo
aureus
Si hay formación de gas y el pH del medio se acidifica, entonces, el
siguiente paso es estriar en ágar Mac Conkey y ágar EMB.
15.
16. Aislamiento de Enterobacterias (agua)
2. Ágar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial.
•Peptona de Caseína
•Peptona de Carne Apariencia de las Microorganismo
•Cloruro de Sodio colonias
•Lactosa Grandes, rojas, con Escherichia coli (lactosa +)
•Sales biliares halo
•Cristal violeta Grandes, rosadas, Enterobacter spp., Klebsiella
•Rojo Neutro mucoides spp. (lactosa +)
pH= 7,1±0,1 Incoloras, Salmonella spp., Shigella spp.,
Incubar por 24 hs transparentes Proteus spp.
a 37ºC Pequeñas, opacas, Enterococci, Staphylococci
aisladas
18. Aislamiento de Enterobacterias (agua)
2. Ágar EMB: medio selectivo y diferencial
(enterobacterias patógenas).
•Peptona de Carne
•Hidrógenofosfato dipotásico
•Lactosa
•Sacarosa Apariencia de las Microorganismo
colonias
•Eosina Amarillenta
Transparentes, de color Salmonella spp., Shigella spp.
•Azul de Metileno
ámbar
pH=7,0±0,2
Verdosas con brillo Escherichia coli (lactosa +,
metálico a la luz sacarosa +)
Incubar por 24 hs reflejada, con el centro
a 37ºC negroazulado a la luz
transmitida
Más grandes que las de Enterobacter spp., Klebsiella
E. coli, mucosas, spp. (lactosa+, sacarosa-)
confluentes, con el
centro pardo-grisáceo a
la luz transmitida
20. Pseudomonas spp.
γ-Proteobacteria
Bacilos Gram negativos
Aerobios estrictos
Con flagelos polares
Producen pigmentos
No fermentadores
Oxidasa positivos
Patógenos de plantas/infecciones oportunistas en humanos
21. Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa (agua)
1. Sembar en Caldo M9 (2x) e incubar por 48 hs a 42ºC:
enriquecimiento y selección.
2. Estriar en Ágar Cetrimida: medio selectivo para Pseudomonas
aeruginosa
• Peptona de Gelatina
• MgCl2
• Cetrimida
• Glicerina
• SO4K2
Incubar por 48 hs a 37ºC.
Pseudomonas aeruginosa
22. Staphylococcus spp.
• Cocos Gram positivos
• Anaerobios facultativos
• Fermentan glucosa (ac. láctico)
• Asociados a piel y mucosas
• Patógenos (S. aureus)
• Resisten altas concentraciones salinas
23. Aislamiento de Staphylococcus aureus (ricota)
1. Ricota en Agua Peptonada: enriquecimiento (2 hs a temperatura
ambiente)
2. Mezclar con Caldo Cerebro Corazón (con NaCl 13%): medio selectivo
para Estafilococos patógenos.
• Infusión de cerebro
• Infusión de corazón
• Proteosa peptona
• D(+) Glucosa
• NaCl (7.5% final)
• Hidrógenofosfato disódico
pH=7,4±0,2
Incubar por 48 hs a 37ºC
Si hay crecimiento, estriar en Ágar manitol salado-rojo fenol y Ágar azida
24. Aislamiento de Staphylococcus aureus
3. Ágar manitol salado-rojo fenol: medio selectivo y diferencial (permite
distinguir entre S. aureus y otras especies no patógenas).
• Peptona de carne Apariencia de las colonias Microorganismo
• Extracto de carne
Con halo amarillo, Manitol-positivos: S.
• NaCl 7.5%
luminoso; crecimiento aureus
• D(-)Manitol
• Rojo fenol intenso
pH=7,4±0,2 Sin cambio de color; poco Manitol-negativos: S.
crecimiento epidermidis y otros.
Incubar por 48 hs a 37ºC
1. S. aureus
2. S. epidermidis
3. Micrococcus luteus
3. Ágar azida: medio selectivo para Staphylococcus spp.
Incubar por 48 hs a 37ºC
25. Bacillus spp.
• Bacilos Gram positivos
• Forman endosporas
• Generalmente móviles con flagelos peritricos
• Aerobios (facultativos)
• B. cereus (alimentos)
• B. anthracis
26. Aislamiento de Bacillus cereus y Bacillus subtilis (arroz)
1. Arroz en PBS (80ºC por 5 min.): selección.
2. Pasar el sobrenadante a caldo nutritivo: enriquecimiento.
3. Incubar por 48 hs a 37ºC.
4. Estriar en Ágar Mossel con emulsión de yema de huevo: selectivo y
diferencial (permite distinguir entre Bacillus cereus y B. subtilis)
• Peptona de carne
• Extracto de carne
• D(-)Manitol
• NaCl
• Rojo Fenol
• Emulsión de yema de huevo/Polimixina B
Incubar por 48 hs a37ºC.
Bacillus cereus: colonias rugosas, secas, de color rosado y rodeadas de precipitado
blanco (Manitol – y lecitinasa +).
Bacillus subtilis: colonias amarillas y sin precipitado (Manitol + y lecitinasa -).
27. Lactobacillus spp.
• Bacilos o cocobacilos Gram positivos
• Fermentadores lácticos
• Aerobios facultativos o microaerófilos
28. Aislamiento de Lactobacillus spp. (yogurt)
1. Ágar De Man, Rogosa y Sharpe (MRS): medio de enriquecimiento
selectivo.
Polisorbato, acetato, magnesio y manganeso.
pH = 5.7.
Incubación en microaerobiosis.
2. Ágar Rogosa: medio más selectivo que el
anterior, con mayores concentraciones de
acetato y pH = 5.5 que inhiben flora
acompañante.
Incubación en microaerobiosis.
Ágar MRS-Lactobacillus casei
29. Azotobacter spp.
• Bacilos o cocos Gram negativos
• Habitan en el suelo y en el agua
• Fijan nitrógeno atmosférico (N2 a NH3)
• Vida libre
• Forman quistes (similar a endosporas)
Medio Fred & Waksman: medio selectivo sin fuente de
nitrógeno. Contiene manitol (azúcar fermentable).
Crecimiento a 28ºC.
30. Microorganismo Enriquecimiento Selección-
-Selección Diferenciación
Agua Enterobacterias Caldo Mc Ágar Mc Conkey
Conkey y ágar EMB
Agua Pseudomonas Caldo M9-42ºC Ágar Cetrimida
Ricota Staphylococcus Caldo cerebro- Ágar manitol
corazón con salado rojo
7.5% NaCl fenol y ágar
azida
Arroz Bacillus 80ºC y caldo Ágar Mossel con
nutritivo emulsión de
yema de huevo y
PmB.
Yogurt Lactobacillus Ágar MRS Ágar Rogosa
Microaerobiosis Microaerobiosis
Tierra Azotobacter Caldo Fred& Ágar Fred &
Waskman-28ºC Waskman-28ºC