Universidad Autónoma de Yucatán
Maestría en Ciencias Químicas y Bioquímicas
Métodos Cromatográficos
Derivatización de
Analítos
Presentado por:
IQI Ulises Gracida Álvarez

Definición
• Es el proceso que consiste en modificar
químicamente un compuesto para producir un
derivado con nuevas propiedades que faciliten o
permitan su análisis.
• Mejora la volatilidad, estabilidad térmica y la
detección del analito.
• En este tipo de reacciones no se conoce la
estructura de los productos. Es la reacción en si
misma la que da la estructura de los derivados.

Características
• Condiciones de operación lo más simples posible.
• Número mínimo de etapas (no más de dos).
• Rendimiento máximo de la reacción y que sea reproducible.
• El origen químico de los productos formados debe ser predecible.
• Correspondencia entre el número inicial de analitos y sus derivados.
• Se deben notar las características de la terminología estructural de
los derivados.
• La información previa al análisis provenga de características
generales de las reacciones de derivatización.

Tipos de derivatización
• Sililación
Reemplazo de un hidrógeno ácido con un grupo alquilsililo
• Acilación
Conversión de compuestos con hidrógenos activos como –OH, -SH, y –NH en
esteres, tioesteres y aminas, respectivamente.
• Alquilación
Reemplazo de un hidrógeno activo en R-COOH, R-OH, R-SH, R-NH2 con un
grupo alquilo o arilo.

Aplicaciones generales
• Transformación de compuestos no volátiles en derivados volátiles.
• Conversión de compuestos no detectables en productos apropiados
por minimización del límite de detección.
• Análisis de compuestos reactivos que presentan interacción con la
fase estacionaria o la columna.
• Incremento de la especificidad de la fragmentación del ión
molecular para la estimación de estructuras.
• La formación de nuevos cromóforos para la detección UV de
analitos en HPLC.
• Conversión de analitos hidrofílicos en derivados más hidrofóbicos
para su aplicación en RP-HPLC.

Aplicación partícular
Desarrollo de un método de derivatización simple para la
determinación sensitiva de ácidos grasos por cromatografía de líquidos
de alta eficiencia con detección de fluorescencia utilizando 9-(2-
hidroxietil)-carbazol como agente de derivatización

Antecedentes
• La Cromatografía de líquidos de alta eficacia
(HPLC) con detección de fluorescencia permite el
análisis a niveles traza.
• Estos compuestos presentan una débil absorción en
el espectro UV-VIS.
• Es necesaria la derivatización con reactivos
fluorescentes

Desventajas de los reactivos
derivatizantes comúnmente usados
Tipo Cumarina Inestables en medio acuoso, proceso complicado,
consumo de tiempo.
Tipo Diazometano Son inestables en los solventes de reacción, no se
pueden almacenar por mucho tiempo.
Tipo Quinoxanilona Presentan condiciones drásticas de reacción,
debido a su complicado proceso analítico.
Tipo Benzofurazano El proceso de derivatización para ácidos grasos
tiene una duración de 6 horas.
Tipo Benzohidrazida No se han logrado derivatizar y separar los 20
ácidos grasos más importantes.

9-(2-hidroxietil)-carbazol (HEC)
• Presenta altos rendimientos de esteres cuando reacciona con
ácidos carboxílicos en acetonitrilo a 60°C. En presencia de 1-etil-3-
(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) como agente de
condensación y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) como catalizador
básico.
• El proceso de derivatización es simple y no requiere de la remoción
posterior de reactivos en exceso y solventes.
• Contiene un par libre de electrones que incrementa
significativamente la detección de los derivados.
• Este proceso se puede aplicar para la determinación de ácidos
grasos.

Metodología
Síntesis del carbazol-9-il acido acético Síntesis del 9-(2-hidroxietil)-carbazol
Reaccionar el carbazol-9-hidroxietil
Mezclar 20 ml de bromoacetato de
ácido acético con LiAlH4 mediante
etilo y 20 ml de metil sulfoxido
reflujo en eter durante 2 hr.
Adicionar por goteo a 25 g de
carbazol, 20 g de hidroxido de potasio Adicionar agua para detener la
y 100 ml de metil sulfoxido a 95° C por 1 reacción y extraer la mezcla con eter.
hr.
Verter en una mezcla de agua e
Lavar 2 veces con una mezcla de
hidroxido de potasio e hidrolizar por 15
carbonato de sodio al 10% y agua
min a 100° C
Ajustar el pH entre 2.0 – 3.0 remover el
Extraer 3 veces el residuo con heptano
precipitado y lavarlo con 3 veces con
calentado
50 ml de agua.
SE obtiene un producto blanco que
Recristalizar con tolueno. debe ser filtrado y cristalizado
nuevamente.

Metodología
Derivatización
Tomar una muestra de 100 l de una
mezcla estándar de ácidos grasos.
Adicionar 200 l de DMAP (catalizador
básico), EDC (agente de
condensación) y reactivo HEC
Poner la mezcla a reaccionar en un
baño de agua a 60° C por 30 min.
Diluir 10 l de la mezcla cruda a 100 l
con acetonitrilo
Inyectar 10 l de esta solución diluida
en el cromatógrafo.

Instrumentación
• Cromatógrafo de líquidos marca Hitachi modelo 655
• Detector de fluorescencia marca Hitachi modelo 650-10S
• Válvula de inyección marca Rheodyne modelo 7125
• Válvula de proporción marca Hitachi modelo 655
• Integrador marca Hitachi modelo 644-61
• Columna C18 de 200mm × 4.6 mm d.i. (5 m) marca Spherisorb
• Baño de agua marca Paratherm U2 (para controlar la temperatura
de la columna)

Método cromatográfico
• Las muestras fueron eluidas con :
Fase A: 40% acetonitrilo con 0.1% de ácido acético en agua.
Fase B: 0.1% de ácido acético en acetonitrilo puro.
• El gradiente de elución fue de 40% (A) a 100% (B).
• Velocidad de flujo constante de 1 ml/min.
• La temperatura se mantuvo a 35° C.
• Se utilizó ácido butanoico como estándar interno.

Resultados
• Se determinó que los derivados eran lo suficientemente estables
para el análisis por HPLC, al no encontrarse cambios significativos en
el área de los picos durante un periodo de 24 hr.
• Se encontró que la intensidad de la fluorescencia en el estándar
interno disminuye con el aumento de la temperatura.

Resultados
• El uso de acetonitrilo y el acetato de etilo como solventes de
reacción para el proceso de derivatización proporcionó las
respuestas de detección más altas.
• Se prefirió el uso del acetonitrilo debido a la inmiscibilidad del
acetato de etilo en la fase móvil.

Resultados
• Se obtuvo una respuesta del detector más alta utilizando como
catalizador básico 4-dimetilaminopiridina (DMAP).
• Se analizaron dos agentes de condensación, resultando más
apropiada la 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida clorhídrica
(EDC-HCl) obteniéndose un repuesta del detector de 2 a 3 veces
mayor que utilizando diciclohexilcarbodiimida (DCC)

Resultados
• Se analizaron las mejores condiciones de temperatura y tiempo de
derivatización resultando ser de 60° C y 30 min, respectivamente.

Resultados
• El detector operó a las longitudes de
onda de excitación y emisión máximas
de 335 y 360 nm, respectivamente.
• Las fases móviles que proporcionaron
una mejor separación en el menor
tiempo fueron:
(A) 40% acetonitrilo con 0.1% de ácido
acético en agua
(B) 0.1% de ácido acético en acetronitrilo
puro.
• Condiciones de gradiente:
Inicial 0-5 min=70% A
20 min= 100% B (manteniendose por 25 min)

Resultados
• Con base en las condiciones óptimas de derivatización se realizó el
análisis de linearidad a los ácidos mirístico y esteárico. Las
ecuaciones de regresión obtenidas fueron:
y = 0.0314+0.711X (n = 6, γ 2 = 0.997) para el ácido mirístico.
y = 0.353+0.721X (n = 6, γ 2 = 0.998) para el ácido esteárico.
• Por último se evaluó la precisión del método propuesto

Conclusiones
La derivatización de ácidos grasos con HEC ofrece las ventajas de:
• No requerir un agente de fase, ni solventes con alta toxicidad.
• La derivatización ocurre rápidamente y de forma sencilla.
• Los reactivos y los ácidos grasos derivados son estables.
• Es un método fácil, económico, sensible y reproducible.
• Se obtiene una separación de 20 ácidos grasos en 38 min bajo las
condiciones propuestas.

Bibliografía
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