8. Προγεννητική Διάγνωση
β-θαλασσαιμία
α-θαλασσαιμία
Hb Bart’s Hydrops Fetalis
Σοβαρές μορφές αιμοσφαιρινοπάθειας H
Άλλες αιμοσφαιρινοπάθειες(π.χ. HbS)
Για ζευγάρια που έχουν πιθανότητα να αποκτήσουν παιδιά με πολύ σοβαρές γενετικές
ασθένειες.
13. Εξωκυτταρικό Εμβρυϊκό DNA στο Μητρικό Πλάσμα
13
DenisLo et al, 1997
ΚΛΕΑΝΘΟΥΣ ΜΑΡΙΝΑ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ:ΝΕΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ
14. Εφαρμογές ΜΕΠΔ
Κλινικές Εφαρμογές
Προσδιορισμόςτου Rhesus του εμβρύου σε Rhesus αρνητικέςεγκύους
(αιμολυτικήασθένειατωννεογνών)
Προσδιορισμόςτου φύλου του εμβρύου για X-φυλοσύνδετεςασθένειες
ΜΕΠΔ για ανευπλοειδίες με NGS (Χρωμ. 21, 18 και 13 εμπορικά διαθέσιμομε
κόστος €500)
Ερευνητικές μελέτες
Μονογονιδιακέςασθένειες(π.χ. β-θαλασσαιμία, Κυστική ίνωση)
Ανωμαλίεςκύησης (Προεκλαμψία,πρόωρος τοκετός)
14ΚΛΕΑΝΘΟΥΣ ΜΑΡΙΝΑ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ:ΝΕΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ
15. ΜΕΠΔ για β-Θαλασσαιμία
ΔΥΣΚΟΛΙΕΣ:
Ποιότητα εμβρυικού DNA στο πλάσμα
Το απομονωμένο DNA είναι κυρίως μητρικό
(~10% εμβρυϊκό)
Μητρικό και εμβρυικό DNA παρόμοιο
Πολλοί γονείς φέρουν ίδιες μεταλλάξεις
ΠΡΟΚΛΗΣΕΙΣ:
Αξιόπιστος προσδιορισμός πατρικού
αλληλομόρφου
Αξιόπιστος προσδιορισμός μητρικού
αλληλομόρφου
15ΚΛΕΑΝΘΟΥΣ ΜΑΡΙΝΑ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ:ΝΕΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ
N/IVS1-110N/IVS1-110
N/IVS1-110
N/N
IVSI-110/IVSI-110
N/IVS1-110N/IVS1-6
N/IVS1-110
N/N
N/IVSI-6
IVSI-110/IVSI-6
16. Επιλογή πολυμορφισμών (SNPs) με ψηλό βαθμό ετεροζυγωτίας
στον Κυπριακό Πληθυσμό
16
130 SNPs στο γονιδιακό τόπο της β-σφαιρίνης
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
75 τυχαία επιλεγμένα δείγματα
Sequenom® MALDI-TOFF Mass Array
49 SNPs με βαθμό ετεροζυγωτίας > 6% επιλέχθηκαν
για ΜΕΠΔ
ΚΛΕΑΝΘΟΥΣ ΜΑΡΙΝΑ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ:ΝΕΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ
17. Illumina Solexa Platform (HiSeq2000) in collaboration
with Erasmus Medical Centre (Rotterdam)
~1 million reads/sample
5% minor allele 50 000 molecules
Μέθοδος - Στοχευμένη NGS
Primer design for 4 SNPs (150-250bp)
PCR Amplification (3 replicates)
PCR product purification
Cluster generation by bridge amplification
Sequencing by synthesis
Bioinformatics analysis
17
NGS για την Ανάλυση του Εξωκυτταρικού Εμβρυϊκού DNA στο
Μητρικό Πλάσμα
ΚΛΕΑΝΘΟΥΣ ΜΑΡΙΝΑ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ:ΝΕΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ
18. Ανάλυση Εξωκυτταρικού DNA Μητρικού Πλάσματος με NGS
Illumina Solexa Platform, (HiSeq2000)
10 οικογένειες, 4 SNPs
ΜΕΠΔ 8/10 με ανάλυση απλοτύπων
NIPD: Normal or β-thal trait
SNP1 SNP2 SNP3 SNP4
c c g ND
c c g ND
SNP1 SNP2 SNP3 SNP4
SNP1 SNP2 SNP3 SNP4
βthal c g t
Normal t c g
c c g
t c g
ND
Normal
N/IVS1-110N/IVS1-6
Mat plasma
European Journal of Human Genetics, 2013
19. Προεμφυτευτική Γενετική Διάγνωση (ΠΓΔ)
Εξωσωματική γονιμοποίηση (In vitro
fertilization - IVF) για δημιουργία εμβρύων
Έλεγχος 1-2 κυττάρων του εμβρύου
Επιλογή των υγειών εμβρύων για
μεταφορά στη μήτρα
Πρώτη ΠΓΔ (Handyside et al, 1990)
Χιλιάδες παιδιά έχουν γεννηθεί μετά από
ΠΓΔ
19
• ΣΤΑΔΕΙΑ
• Συμβουλευτική
• Επαγωγή ωορρηξίας
• Συλλογή ωοκυττάρων
• Γονιμοποίηση με ICSI
• Βιοψία εμβρύου
• Γενετική διάγνωση
• Μεταφορά1-2 κατάλληλωνεμβρύων
• Επιβεβαίωση κύησης
• Προγεννητική διάγνωση (κατευθυντήριες
γραμμέςαπό ESHRE)
ΚΛΕΑΝΘΟΥΣ ΜΑΡΙΝΑ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ:ΝΕΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ
20. Επαγωγή Ωορρηξίας και Συλλογή Ωαρίων
Ελεγχόμενη διέγερσητων ωοθηκών με τη
χρήσητης ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης
προκειμένου να εξασφαλιστεί η πολλαπλή
ανάπτυξη ωοθυλακίων
Η λήψη των ωαρίων πραγματοποιείται
διακολπικά υπό υπερηχογραφική
καθοδήγηση
20ΚΛΕΑΝΘΟΥΣ ΜΑΡΙΝΑ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ:ΝΕΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ
24. Μεταλλάξεις β-Θαλασσαιμίας και Ανάλυση
Πολυμορφισμών (STR)
24
Mother
Father
Child 1 A
Child 1B
N/IVSI-110)
N/N
ΚΛΕΑΝΘΟΥΣ ΜΑΡΙΝΑ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ:ΝΕΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ
25. ΚΛΕΑΝΘΟΥΣ ΜΑΡΙΝΑ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ:ΝΕΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ 25
ΠΓΔ για
β-Θαλασσαιμία
200
123
IVSI-110
115
243
184
I
209
119
N
111
251
182
II
B-THAL
200
119
N
115
247
182
III
206
121
N
108
243
188
IV
D11S2362
D11S1243
HBB
D11S4891
D11S1338
D11S1323
HBB
STR MARKER
200
119
N
115
251
182
V
203
123
N
115
249
188
VI
203
119
N
115
243
182
VII
B-THAL
200
123
IVSI-110
115
243
184
I
206
121
N
108
243
188
IV
B-THAL
200
119
N
115
251
182
V
206
123
IVSI-110
115
243
182
VIII
B-THAL
200
123
IVSI-110
115
243
184
I
206
123
IVSI-110
115
243
182
VIII
B-THAL
200
119
N
115
251
182
V
B-THAL
206
121
N
108
243
188
IV
B-THAL
206
121
N
108
243
188
IV
B-THAL
206
123
IVSI-110
115
243
182
VIII
B-THAL
200
123
IVSI-110
115
243
184
I
206
123
IVSI-110
115
243
182
VIII
206
123
IVSI-110
115
243
182
VIII
26. ΠΓΔ για Θαλασσαιμία με Παράλληλο Έλεγχο Ιστοσυμβατότητας
(HLA Typing)
Εφαρμόζεται σε ζευγάρια με θαλασσαιμικό παιδί
ΠΓΔ για επιλογή και μεταφορά στη μήτρα εμβρύων που είναι υγιή και
ταυτόχρονα ιστοσυμβατά με θαλασσαιμικό παιδί της οικογένειας
Στη γέννηση συλλέγεται αίμα ομφάλιου λώρου από το νεογέννητο και
απομονώνονται αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα
Τα βλαστικά αιμοποιητικά κύτταρα μεταμοσχεύονται στο θαλασσαιμικό παιδί
και εγκαθίστανται στο μυελό των οστών
Επανασύσταση της αιματοποίησης ήταν επιτυχημένη σχεδόν σε όλες τις
περιπτώσεις που δημοσιεύτηκαν
26ΚΛΕΑΝΘΟΥΣ ΜΑΡΙΝΑ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ:ΝΕΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ
27. ΚΛΕΑΝΘΟΥΣ ΜΑΡΙΝΑ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ:ΝΕΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ 27
ΠΓΔ για
β-Θαλασσαιμία
και τυποποίηση HLA
MHC - Chr6p21
Σε 3.6 Mb βρίσκονται 224 HLA
γονίδιακαι ψευδογονίδια
29. Νέες Μεθοδολογίες στη Προγεννητική Διάγνωση
Νέες τεχνικές προσδιορισμού μεταλλάξεων (π.χ. Real Time-PCR, MLPA, NGS)
Νέες τεχνολογικές εξελίξεις που σχετίζονται με την υποβοηθούμενη αναπαραγωγή (ICSI, Laser,
διαλογή σπέρματος, vitrification)
NGS στη ΠΔ για αιμοσφαιρινοπάθειες – χρωμοσωμικές ανωμαλίες– γενετικοί τροποποιητικοί
παράγοντες
Περισσότερες πληροφορίεςστους υποψήφιουςγονείς
Απόπρογεννητική γενετική διάγνωση στη προγεννητική γενωμική διάγνωση
29ΚΛΕΑΝΘΟΥΣ ΜΑΡΙΝΑ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ:ΝΕΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ
30. Νέα Εποχή στη Προγεννητική Διάγνωση
Εξατομικευμένες Θεραπείες για το Έμβρυο
Συγκριτικέςμελέτες σε έμβρυα Genomics, transcriptomics, proteomics, methylomics
(omics)
Κατανόηση της παθοφυσιολογίας και εξέλιξης των ασθενειών στα διάφορα στάδια
ανάπτυξης του εμβρύου
Ανάπτυξη εξατομικευμένωνθεραπειών για το έμβρυο ή το νεογέννητο
30
Στο παρόν, η ΠΔ παρέχει μια
τεκμηριωμένηεπιλογή για τους
υποψήφιους γονείς
Στο μέλλον, τα δεδομένα/υλικό από την ΠΔ
θα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για
εξατομικευμένεςθεραπείες των εμβρύων
ΚΛΕΑΝΘΟΥΣ ΜΑΡΙΝΑ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ: ΝΕΕΣΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣΕς
31. Περίληψη
Η κύρια μέθοδος που χρησιμοποιείται στη ΠΔ των αιμοσφαιρινοπαθειών βασίζεται
στην ανάλυση βιοψίας πλακούντα (CVS)
Η ΜΕΠΔ αναμένεται να αντικαταστήσει σύντομα τη συμβατική μέθοδο
Μια άλλη επιλογή για ορισμένα ζευγάρια είναι η ΠΓΔ
ΠΓΔ-HLA μια ελκυστική θεραπευτική προσέγγιση, αλλά όχι μια γρήγορη λύση
Χρησιμοποίησηνέων τεχνολογιών (π.χ. NGS, ψηφιακό PCR)
Συνεχής παραγωγή νέων δεδομένων omics για το έμβρυο - ασθένειες
Νέος στόχος ΠΔ: Παροχή στοιχείων για την εφαρμογή νέων και εξατομικευμένων
θεραπειών για το έμβρυο ή το νεογέννητο
31ΚΛΕΑΝΘΟΥΣ ΜΑΡΙΝΑ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ:ΝΕΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ